PLOS ONE: HIF-1α Induit Résistance multirésistante dans les cellules de cancer gastrique par Induire miR-27a

Résumé

Cette étude visait à déterminer la corrélation entre HIF-1α et l'expression de miR-27a et d'évaluer l'effet de l'inhibition de l'expression de HIF-1α sur l'expression de miR-27a et la résistance aux médicaments dans le cancer gastrique ( GC). Dans la présente étude, PCR en temps réel et Western blot ont été effectuées pour détecter l'expression de HIF-1α dans les tissus du GC et des lignées cellulaires. Ensuite, les cellules OCUM-2MD3 /L-OHP ont été transfectées avec HIF-1α-ARNsi, un imitateur miR-27a ou pcDNA-HIF-1α et la survie des cellules a été déterminée par le test MTT. L'expression de HIF-1α, miR-27a, et les gènes MDR-connexes a été mesurée par PCR en temps réel et Western blot. ChIP et deux tests d'activité luciférase ont été réalisées pour évaluer la régulation transcriptionnelle de HIF-1α et miR-27a. Les résultats ont montré que la transfection avec HIF-1α-ARNsi nettement diminué les niveaux de miR-27a, ce qui entraîne une inhibition améliorée de façon spectaculaire le taux de cellules OCUM-2MD3 /L-OHP prolifération. Par rapport aux cellules non transfectées, le taux de survie était significativement réduite dans les cellules transfectées avec HIF-1α-ARNsi après le traitement avec la L-OHP. Le taux de survie des cellules a été significativement augmentée dans OCUM-2MD3 /L-OHP cellules transfectées avec le synoptique miR-27a, alors que la surexpression de HIF-1α n'a pas abouti à un changement clair dans la survie des cellules. Les résultats de l'essai d'activité de luciférase double ont démontré que HIF-1α augmente l'activité transcriptionnelle du promoteur miR27a dans des cellules transfectées avec un plasmide rapporteur contenant la région de promoteur en amont de miR27a conjointement avec pcDNA-HIF-1α. analyse ChIP a suggéré que HIF-1α se lie directement à la région promotrice de miR27a. L'inhibition de HIF-1α ou l'expression miR27a diminué MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 expression dans les cellules L-OHP OCUM-2MD3 /. Ainsi, nous avons constaté que HIF-1α est étroitement associée à MDR en GC et que HIF-1α peut supprimer MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 expression en inhibant l'expression de miR-27a

Citation:. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induit une résistance à la polychimiothérapie dans les cellules de cancer gastrique par Induire miR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Editeur: Jin Cheng Q., H.Lee Moffitt Cancer Center & Institut de recherche, ÉTATS-UNIS

Reçu: 5 Janvier 2015; Accepté le 17 Juin 2015; Publié 20 Août, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Zhao et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été soutenu par la subvention suivante:. la Fondation provinciale des sciences naturelles de la province du Hebei (n ° H2013206311 à Qun Zhao)

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

le cancer gastrique introduction (GC) est parmi les tumeurs malignes les plus fréquentes, causant un préjudice grave dans le monde entier [1, 2] Après des années de les progrès technologiques dans le diagnostic et le traitement de la GC, son incidence et de mortalité ont diminué dans le monde entier mais restent élevés dans les pays asiatiques [3, 4]. Actuellement, la résection gastrique est la seule méthode disponible pour guérir GC. Cependant, il est difficile de parvenir à une guérison complète malgré l'ablation chirurgicale de la tumeur, car la plupart des patients souffrent de GC avancé au moment du diagnostic [5, 6]. Par conséquent, la chimiothérapie joue un rôle extrêmement important dans le traitement complet de GC. Bien que la chimiothérapie fortement progressé par rapport au traitement de GC avancé, [7, 8] le pronostic de GC reste insuffisant, avec un taux de survie à 5 ans de moins de 30% [9]. Ce pronostic est principalement due à la multirésistance (MDR) de cellules de GC. MDR en GC conduit souvent à l'échec d'une chimiothérapie [10-12]. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques prometteuses pour réduire efficacement MDR en GC.

Le manque d'oxygène est très répandue dans les tumeurs solides et est associée à une variété de fonctions biologiques. Actuellement, hypoxia-inducible factor (HIF) -1α est considéré être étroitement associée à une hypoxie. HIF-1α est fortement exprimé dans une variété de tumeurs malignes [13, 14] et agit comme un facteur essentiel pour réguler l'adaptation des cellules tumorales à l'hypoxie [15]. HIF-1α a été suggéré d'être étroitement associé à GC MDR [16, 17]. Cependant, on ne sait pas qui voie médie le rôle de HIF-1α en GC MDR.

Au cours des dernières années, le rôle des microARN (miARN) dans le cancer est devenu un mécanisme largement étudié de l'initiation et de traitement tumeur. miR-27a, un membre de la famille des miARN a été démontré que l'incidence de la tuberculose GC [18]. En outre, l'expression de miR-27a est augmentée dans un environnement hypoxique [19]. Ces résultats suggèrent que HIF-1α peut réguler l'expression de miR-27a et affecter GC MDR. Cependant, les mécanismes réglementaires spécifiques doivent encore être élucidés. La présente étude a montré que l'expression de HIF-1α et miR-27a étaient significativement régulés à la hausse dans les tissus GC et des lignées cellulaires, en particulier dans des lignées cellulaires résistantes.

Transfection avec un petit ARN spécifique interférence pour bloquer HIF endogène -1α a entraîné une réduction de l'expression de miR-27a et la réduction de la MDR dans des lignées de cellules GC. Ces nouveaux résultats suggèrent que l'inhibition de l'expression de HIF-1α supprime la transcription des gènes MDR liés MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 pour atténuer MDR des cellules GC en réprimant l'expression de miR-27a.

Matériel et méthodes

1.1 Matériaux

lignée cellulaire gastrique OCUM-2MD3 était du professeur Masakazu Yashiro en chirurgie Japon Oita médicale [20]. La ligne stable résistant aux médicaments cellule OCUM-2MD3 /L-OHP2 a été obtenue par la culture et la sélection par notre groupe de recherche. La lignée cellulaire GSE-1 a été acheté auprès de la Cellule Resource Center à Shanghai Instituts des sciences biologiques de l'Académie chinoise des sciences. Du RPMI 1640 du milieu de culture et de la trypsine ont été achetées auprès de Gibco Company; réactif Trizol et Lipofectamine 2000 réactif de transfection ont été achetés chez Invitrogen. Le kit de transcription et de PCR quantitative de fluorescence réactifs inverses ont été obtenus auprès de Promega Corporation. Les amorces de PCR et de petits ARN interférents ont été synthétisés par Shanghai Biological Engineering Company. Le kit d'extraction de la protéine a été obtenue à partir Beyotime Company, Chine. Les anticorps primaires contre HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS ou GAPDH ont été achetés à Santa Cruz. MTT a été obtenue auprès de Sigma. Notre étude a été approuvée par le comité d'éthique de la quatrième hôpital affilié de l'Université médicale de Hebei.

1.2 préparation de l'échantillon clinique

Tous les 65 patients atteints de GC ont été sélectionnés après résection gastrique et confirmation pathologique dans la quatrième Hôpital de l'Université médicale de Hebei, dont 42 hommes et 23 femmes âgés de 60,5 ± 8,1 ans, qui n'a pas reçu la radiothérapie préopératoire ou la chimiothérapie. les tissus cancéreux et le para-carcinome (environ 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) ont été prélevés sur tous les patients, et les échantillons ont été rapidement congelées dans de l'azote liquide et ensuite transférés à -80 ℃ conservation. Tous les participants ont signé le consentement éclairé.

1.3 Culture cellulaire et transfection

Le OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP et GSE-1 lignées de cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 100 U /ml de pénicilline et 100 mg /ml streptomycine. Notamment, le milieu des cellules OCUM-2MD3 /L-OHP a été traitée avec de la L-OHP à une concentration de 75μg /ml pour maintenir leur phénotype de résistance aux médicaments, une semaine avant l'intervention chirurgicale pour arrêter le traitement. Les cellules ont été incubées dans un humidifiée à 5% de CO _{2 atmosphère à 37 ° C}

Trois séquences HIF-1α-siRNA ont été conçus à l'aide BLOCK-iT ARNi Designer (séquence 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt, séquence 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; séquence 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), dont chacun a été recuite avec leur séquence complémentaire, respectivement, et transfecté dans les cellules /L-OHP GC-2 OCUM MD3. Une séquence d'ARNsi non spécifique (NS-ARNsi: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) a été utilisé comme témoin négatif. La séquence mimétique miR27a était 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Pleine longueur séquence coden de HIF-1α humain a été sous-cloné dans le vecteur pcDNA3.1. pGL3-miR27a-luc, plasmides pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic et pRL- savoirs traditionnels ont été construits et conservés dans notre laboratoire.

Les cellules du GC ont été ensemencées dans des plaques 6 puits pendant 24 h avant la transfection à une densité de 4 x 10 ^{5 cellules /ml. Les vecteurs plasmidiques, ou l'ARNsi miR27a mimétique a été transfecté dans les cellules GC ou des cellules résistantes aux médicaments en utilisant le réactif de transfection lipofectamine suivant les instructions du fabricant. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du RPMI 1640 antibiotiques sans sérum dépourvu. L'efficacité de transfection a été mesurée 24 h plus tard, suivie par les expériences suivantes.}

1,4 test MTT

GC tissus et le tissu para-carcinome normale a été homogénéisés pour préparer des suspensions de cellules isolées par filtration à travers un 300 grille de cuivre -mesh. Les cellules GC digérées en utilisant 0,02% d'EDTA-trypsine à 0,25% ont été ensemencées à une densité de 5 x 10 ^{4 cellules /ml dans des plaques à 96 puits. Une fois que les cellules ont atteint environ 60% de confluence, HIF-1α-siRNA a été transfecté ou un médicament chimiothérapeutique (150 pg /ml de L-OHP) a été appliqué. Chaque groupe était composé de six puits. Ensuite, 20 ul de 5 mg /ml de MTT a été ajouté pendant 4 heures avant la fin de l'expérience. Les cellules ont été cultivées pendant 4 h, puis le milieu de culture a été jeté. Ensuite, 150 ul de DMSO ont été ajoutés à chaque puits, et les valeurs de DO ont été mesurées à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques après avoir secoué la plaque pendant 15 min à température ambiante. Les expériences ont été répétées trois fois.
Isolement}

1,5 de l'ARN et RT-PCR quantitative

ARN total a été extrait en utilisant du Trizol procédé à une seule étape, et on a utilisé 2 ug d'ARN pour la transcription inverse pour générer des ADNc matrice. Les taux d'ARNm relatifs ont été déterminés par PCR quantitative, la GAPDH a servi en tant que gène de référence interne. Les paramètres de PCR étaient les suivantes: 95 ° C pendant 5 minutes suivie de 45 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s et un annelage à 60 ° C pendant 30 s. Les séquences d'amorces ont été conçues en utilisant Primer 5.0 et ont été recherchées pour la spécificité. Les séquences d'amorces sont les suivantes: HIF-1α (93 pb): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'et (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 pb): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'et (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 pb): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'et (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 pb): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'et (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 pb): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'et (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 pb): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'et (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; et GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'et (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Les résultats quantitatifs de PCR ont été calculées en utilisant la 2 ^{-ΔΔCt méthode}

1.6 Western blot

Les échantillons de tissus et de cellules ont été lysées en utilisant tampon de lyse RIPA:. 1% de Triton X-100, 150 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle et 0,5% de NP-40. Des quantités égales des échantillons de protéines ont été séparés sur des gels de SDS Polyacrylamide à 10% (SDS-PAGE) et ont été électrotransférées un fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Amersham Pharmacia Biotech). Les membranes ont été bloquées avec 5% de BSA pendant 2 h, et on fait incuber avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. Les membranes ont été incubées pendant 2 h dans un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort. Les bandes cibles ont été détectées à l'aide d'une chimioluminescence amplifiée (ECL) kit de détection (Santa Cruz, États-Unis). β-actine a été utilisée comme gène de contrôle endogène. L'expérience a été répétée trois fois.

1.7 chromatine immunoprécipitation (ChIP) dosage

essais ChIP ont été effectuées selon la méthode de Wang et al. [21]. Les cellules avec des traitements différents ont été fixées avec 1% de formaldehyde pendant 15 min à température ambiante et terminée par une concentration finale de 0,125 M de glycine. Ensuite, les cellules ont été lysées en utilisant 300 pi de tampon de lyse (1% de Nonidet inhibiteurs P-40, 0,5% de désoxycholate et la protéase 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM). Les lysats cellulaires ont été traitées par ultrasons dans un bain d'eau glacée pour donner des fragments de chromatine environ 600 pb, tel qu'évalué par électrophorèse sur gel d'agarose. Après centrifugation à 13 000 tpm pendant 10 minutes, les surnageants ont été prélevés et pré-dégagés pendant 15 min à 4 ° C par incubation avec 30 ul de billes de protéine A-Sépharose et l'ADN cisaillé de sperme de saumon. Après centrifugation à 13 000 tpm pendant 5 minutes, les surnageants ont été divisées en trois parties égales: une pour l'entrée, les deux autres pour une immunoprécipitation avec ou sans anticorps anti-HIF-1α. Le lendemain, les complexes immuns ont été précipités avec des billes de protéine A-Sepharose et cisaillé d'ADN de sperme de saumon, puis les billes ont été recueillies après lavées deux fois avec le tampon de lavage I (20 mM de Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100 et 2 mM d'EDTA), suivi par un tampon de lavage II (20 mM de Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 500 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100 et 2 mM d'EDTA) et un tampon de lavage III (10 mM de Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M de LiCl, 1% de Nonidet P-40, 1% de désoxycholate, et EDTA 1 mM) et du tampon de lavage final IV (10 mM de Tris-HCl, pH 8,1 et EDTA 1 mM). Les immunoprécipités ont été éluées par 200 ul de tampon d'élution (SDS à 1% et 0,1 M de NaHCO _{3), suivie d'une incubation à 65 ° C pendant une nuit. Le jour suivant, l'ADN de chaque échantillon a été isolé, et la PCR a été réalisée pour amplifier les segments de promoteur contenant un site de liaison de HIF-1α.}

1,8 dosages de luciférase

Cellules cultivées à 70% de confluence et puis ont été transfectées en triple avec pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α ou pGL3-Basic, avec pRL-TK. Après 48 heures de transfection, les cellules ont été recueillies et l'activité luciférase a été mesurée en utilisant le Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) selon le protocole du fabricant. Les activités luciférase de la PRL-TK ont été servis comme contrôle interne.

1.9 Analyse statistique

Les résultats sont présentés comme le moyen ± E.T. Le test de ANOVA, et Dunnett a été réalisée à l'aide du logiciel SPSS 11.5.

Résultats

1 HIF-1α et miR27a sont exprimés de manière différentielle entre gastrique tissu para-carcinome et GC tissus

Le l'expression de HIF-1α dans le tissu gastrique GC par rapport au tissu para-carcinome a été déterminée par la qRT-PCR et transfert de Western, et la sensibilité des cellules l-OHP a été déterminée par le test MTT. HIF-1α (figure 1A, 1B et 1C, qPCR et Western blot) et miR27a (Fig 1D, les résultats de qPCR) étaient régulés à la hausse dans les tissus GC par rapport à l'estomac tissu para-carcinome. Le test MTT a montré que le taux de survie des cellules était supérieure dans les tissus GC que dans l'estomac tissu para-carcinome quand L-OHP a été ajouté aux suspensions de tissus de cellules uniques (figure 1E, les résultats de l'histogramme).

2 HIF -1α et miR27a sont exprimés de manière différentielle entre une lignée de cellules épithéliales de la muqueuse gastrique et une ligne cellulaire de GC

l'expression de HIF-1α était le plus élevé OCUM-2MD3 /l-OHP et les cellules OCUM-2MD3, séquentiellement, et a été le plus bas en GES-1 cellules (figure 2A, 2B et 2C, qPCR et Western blot). De plus, l'expression de miR27a affiché la même tendance, dans laquelle les cellules OCUM-2MD3 /L-OHP affichés la plus haute expression, suivie par les cellules OCUM-2MD3 et GSE-1 cellules affiche l'expression la plus basse de miR-27a (Fig 2D, résultats qPCR). Le test MTT a révélé que, lorsque L-OHP a été ajouté aux trois lignées cellulaires, les cellules OCUM-2MD3 /L-OHP présentaient le taux le plus élevé de survie des cellules, suivie par les cellules OCUM-2MD3, et que EGE-1 des cellules exposées à la survie de la cellule la plus basse taux (figure 2E, les résultats de l'histogramme).

3 HIF-1α-siRNA supprime l'expression de miR27a et de la résistance aux médicaments des cellules /l-OHP OCUM-2MD3

analyse Western blot a montré que les niveaux de HIF-1α ARNm et de protéines a diminué à des degrés divers dans OCUM-2MD3 /les cellules L-OHP transfectées avec trois paires de HIF-1α-siRNA, alors que l'expression de HIF-1α n'a pas changé dans les cellules transfectées avec le contrôle-siRNA. HIF-1α expression semblaient diminuer plus fortement, d'environ 90%, à l'aide de HIF-1α-ARNsi-2 (figure 3A). Comme on le voit sur la figure 3B, l'expression de HIF-1α diminuée dans ces cellules d'une manière dépendante de la dose, dans laquelle l'expression de HIF-1α diminué de plus de 95% dans les cellules transfectées avec 80 nM de HIF-1α-ARNsi-2, lorsque HIF 1α-ARNsi-2 a été transfecté en outre à une dose de 20 nM, 40 nM ou 80 nM. En outre, l'effet inhibiteur maximal a été détectée 48 heures après la transfection (figure 3C).

miR27a expression était significativement diminuée suite à la transfection des cellules MD3 /L-OHP OCUM-2 avec HIF-1α-ARNsi-2 (figure 3D). Le test MTT a indiqué que le taux de survie des cellules a été significativement réduite après le traitement de HIF-1α-ARNsi-2 transfectées OCUM-2 MD3 /cellules L-OHP avec L-OHP par rapport aux cellules non transfectées (figure 3E).

4 Effets de miR27a sur le MDR /cellules l-OHP OCUM-2MD3

l'expression de miR27a a été régulée à la hausse dans les cellules OCUM-2MD3 /l-OHP lorsque le miR27a mimique était co transfecté dans ces cellules GC résistantes aux médicaments qui ont été transfectées avec HIF-1α-siRNA (figure 4A). Cependant, aucune différence significative de l'expression de HIF-1α est détectée dans les cellules OCUM-2MD3 /L-OHP après la transfection (figure 4B et 4C, qPCR et Western Blot).

Le test MTT a démontré que la survie taux de cellules /l-OHP OCUM-2MD3 a nettement augmenté après transfection avec le miR27a mimétique (Fig 4D, les résultats de l'histogramme).

5 HIF-1α induit la transcription de miR27a dans les cellules OCUM-2MD3

l'expression de HIF-1α a été significativement augmentée dans les cellules OCUM-2MD3 transfectées avec le plasmide d'expression pcDNA-HIF-1α eucaryote pendant 48 h (figure 5A). En outre, l'expression miR27a était clairement régulée à la hausse (figure 5B). Par conséquent, ces résultats suggèrent que HIF-1α est un facteur critique qui affecte la transcription de miR27a. Par conséquent, nous avons établi un plasmide de gène reporter luciférase portant une séquence de 2 kb en amont de la région promotrice de miR27a, qui a été co-transfectées avec le pcDNA-HIF-1α dans les cellules. Les données ont montré que DLA HIF-1α amélioré l'activité du promoteur de miR27a suivant une co-transfection (figure 5C). analyse ChIP a également confirmé que HIF-1α directement lié à la région promotrice de miR27a (figure 5D). Les résultats ont révélé que HIF-1α peut promouvoir la transcription dans les cellules de miR27a OCUM-2MD3 en se liant directement à la région promotrice de miR27a.

6 inhibition de HIF-1α utilisant des ARNsi inhibe l'expression de la résistance aux médicaments apparenté gènes

Comme le montre la figure 6, l'inhibition de HIF-1alpha considérablement supprimé l'expression de MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 dans les cellules OCUM-2MD3 /l-OHP, mais n'a pas modifié de façon significative l'expression de GST-π ou TS. (Figure 6).

7 Inhibition de miR27a réduit l'expression des gènes liés à la résistance aux médicaments dans les cellules /L-OHP OCUM-2MD3

miR27a a été réprimée dans résistant aux médicaments GC OCUM-2MD3 /cellules l-OHP transfectées avec la séquence anti-miR27a (Fig 7A). En outre, à la suite de cette transfection, l'expression de MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 a été significativement diminué, alors qu'aucune différence significative n'a été détectée dans l'expression de GST-π ou TS (figure 7B, 7C et 7D, qPCR et occidentale tache). (Figure 7)

Discussion

Bien que le taux d'incidence mondiale de GC semble avoir diminué au cours des dernières années, une forte incidence de GC persiste, mettant gravement en danger la santé des personnes en Asie [22] . MDR des cellules GC contribue à un mauvais pronostic de la CG, dans laquelle la carence en oxygène joue un rôle essentiel. Dans la présente étude, nous avons établi la lignée cellulaire OCUM-2MD3 /L-OHP stable qui résiste à la L-OHP. Nos données indiquent que les tissus GC et des lignées cellulaires présentent une résistance aux médicaments plus forte que les tissus épithéliaux normaux gastriques et des lignées cellulaires. Nous avons également constaté que les cellules résistantes aux médicaments se développent MDR beaucoup plus forte. Nos résultats ont montré une expression accrue de HIF-1α dans les tissus GC et des lignées cellulaires, et la plus haute expression de HIF-1α est détectée dans une lignée cellulaire résistante aux médicaments. Par conséquent, nous proposons que HIF-1α contribue au développement de la MDR dans des cellules GC.

Le gène de HIF-1α code pour une protéine qui est constituée de 826 acides aminés avec un poids moléculaire de 120 kDa [23]. De nombreuses études ont confirmé que l'augmentation de l'expression de HIF-1α est fortement associée à l'apparition et au développement de tumeurs [24-28]. D'autres études ont suggéré que la surexpression de HIF-1α améliore les propriétés de résistance au médicament d'une variété de cellules tumorales [29-32]. En outre, notre étude a démontré que les tissus GC et des lignées cellulaires présentent une plus grande résistance aux médicaments chimiothérapeutiques que les tissus para-carcinome gastrique et des lignées cellulaires de la muqueuse gastrique. Nous avons également détecté la résistance aux médicaments les plus puissants dans les cellules du GC. Cependant, les mécanismes par lesquels HIF-1α réglemente MDR doivent encore être clairement identifié dans les cellules du GC. Par conséquent, nous avons en outre étudié les effets de HIF-1α sur les propriétés MDR des cellules GC par interférence des gènes et des techniques de clonage. l'interférence ARN (ARNi) a affiché des avantages de la spécificité, l'efficacité et la durabilité pour la régulation de l'expression du gène cible [33]. Nos données indiquent que l'inhibition de HIF-1α réduit de manière significative la résistance aux médicaments dans les cellules OCUM-2MD3 /L-OHP. De plus, nous avons démontré que la résistance aux médicaments a été considérablement augmentée lorsque pcDNA-HIF-1α, qui a été utilisé pour surexprimer HIF-1α, a été transfecté dans des lignées cellulaires GC non résistants aux médicaments. Nos résultats indiquent que HIF-1α joue un rôle essentiel dans le développement du MDR en GC.

Des études récentes ont indiqué que le MDR est étroitement liée avec miARN dans les tumeurs [34-36]. Hu a indiqué que inactivant miR-27a peut inverser les propriétés MDR des cellules GC [18]. En outre, il a été rapporté que miR-21, miR-27a, miR-210 et miR-181b étaient régulés à la hausse par la voie HIF dans l'environnement hypoxique sur la base d'un dosage génique puce [19]. Conformément à nos résultats, HIF-1α était positivement associée à l'expression de miR-27a dans les tissus du GC et des lignées cellulaires, et l'inhibition de HIF-1α a diminué miR-27a. En revanche, la surexpression de HIF-1α induit l'expression de miR-27a. Ces résultats indiquent que HIF-1α régule l'expression de miR-27a. En outre, notre étude a montré que miR-27a imite sauvé les propriétés de résistance aux médicaments de cellules HIF-1alpha-knockdown. Plus important encore, HIF-1α se lie directement à et favorise la transcription miR27a, indiquant que HIF-1α régule le MDR de GC via miR-27a.

Nous avons caractérisé l'expression des gènes qui sont étroitement associés à MDR, y compris MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 et TS, avant et après la modulation de l'expression de HIF-1α dans les cellules du GC pour élucider le mécanisme par lequel la voie HIF-1α-miR-27a régule le MDR de GC . Nous avons démontré que l'inhibition de l'expression de HIF-1α réduisait l'expression de MDR1 /P-gp, PRL et Bcl-2. Les niveaux de ces gènes d'expression ont été significativement augmentés lorsque les cellules ont été transfectées avec le miR-27a mimique, tandis que les niveaux de GST-π et TS expression n'a pas été significativement modifiées. Conformément à cette constatation, sur-expression de HIF-1alpha puissamment régulés à la hausse l'expression de MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 dans la lignée cellulaire GC OCUM-2MD3. Par conséquent, nos données montrent que la voie HIF-1α-miR-27a médiatise propriétés MDR en GC en induisant MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 expression.

Nos études démontrent que HIF-1α et miR -27a sont régulés à la hausse dans les tissus du GC et des lignées cellulaires. HIF-1α agit comme un régulateur en amont de miR-27a. signalisation HIF-1α-miR-27a améliore les propriétés du MDR en induisant l'expression de MDR1 /P-gp, LRP et Bcl-2 en GC. Ces résultats suggèrent que la voie HIF-1α-miR-27a joue un rôle crucial dans l'initiation du MDR en GC humaine, qui peut servir de cible thérapeutique pour MDR en GC.

Informations complémentaires
fichier S1. Les données de MTT et Western
doi: 10.1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)
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