Résumé
Helicobacter pylori Citation:. Li G, Wulan H, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Regulatory Fonction B Cell est supprimée par le tabagisme et l'obésité au H Editeur: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPON Reçu 3 Février, 2015; Accepté le 13 Juillet 2015; Paru le 30 Juillet, 2015 Droit d'auteur: © 2015 Li et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier financement:.. les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent introduction Helicobacter pylori (H Récemment, le rôle de Tolérance- induire des cellules B a été caractérisée par une série de maladies infectieuses et les maladies auto-immunes [12]. Chez la souris, CD1d hiCD5 + cellules B ont été trouvés pour aider à établir l'environnement tolérogène dans les tissus et ont un rôle dans la prévention de l'induction auto-immune [13]. Chez les humains, CD19 + CD24 hiCD38 salut les lymphocytes B ont une tolérance induisant rôle dans la santé ainsi que des individus infectés par le VHB [14] similaire; l'apparition de la maladie auto-immune est corrélée avec la perte de la fonction de régulation dans ce sous-ensemble des cellules B [15]. IL-10 est une cytokine immunorégulatrice pléiotropique qui est capable d'inhiber une série de cytokines pro-inflammatoires, y compris IL-2, IL-17, IFN-y et TNF-a, et est représenté à supprimer puissamment la capacité de présentation de l'antigène les cellules présentatrices d'antigène [16]. Au centre de tous les sous-ensembles de cellules B induisant une tolérance, d'IL-10 est essentielle à la régulation B à médiation cellulaire T à supprimer l'inflammation à médiation cellulaire [12,17]. Le rôle de la régulation à médiation cellulaire B dans H Dans cette étude, nous avons analysé le profil de composition de cellules B et de l'expression des cytokines dans H Sujets de l'étude de méthodes échantillons périphériques primaires de sang ont été obtenus à partir de 55 H cellules mononucléées du sang (PBMC) ont été isolées à partir d'échantillons de sang périphérique avec procédure Ficoll-Hypaque standard et congelés immédiatement à -150 ° C jusqu'à utilisation, ou utilisés dans des expériences immédiatement si noté. un milieu de culture ordinaire est un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 5 ml de pénicilline 100U /0,1 mg /ml de streptomycine, et 5 ml de 2 mM de L-glutamine. Les cellules ont été cultivées dans 5% de CO 2 à 37 ° C pour la période de temps définie. T et B ont été isolés en utilisant T Cellule humaine ou une cellule B négative Kit de sélection (Stemcell, Vancouver, Canada), en suivant les protocoles fournis par le fabricant. Les puretés des isolements de cellules T et B ont été supérieures à 94% par cytométrie en flux. L'épuisement de CD24 + CD38 + B cellules dans certaines expériences, les cellules B purifiées ont été colorées avec du PE CD24 anti-humain et de CD38 APC anti-humain pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été envoyés vivre tri cellulaire et les cellules CD24 + CD38 + ont été épuisées. Dans l'ensemble de la création de cellules B, cellules totales B ont été envoyés vivre tri cellulaire sans les anticorps cytométrie de flux Les anticorps monoclonaux anti-humains suivants ont été utilisés:. IL-10, TNF- un (eBioscience, San Diego, CA, USA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (BioLegend, San Diego, CA, USA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Purifié IgG humaine (BioLegend, San Diego, CA, USA) a été utilisé pour bloquer les récepteurs Fc lorsque la coloration des populations contenant des cellules B. Pour certaines expériences, phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA, Sigma), ionomycine (Sigma, Munich, Allemagne), ou tués par la chaleur H IL-2, IL-17, IFN-g, le TNF-a et l'IL-10 à partir de cellules T et les cellules B ont été mesurées quantitativement par multiplex dosage Luminex suivant les protocoles fournis par le fabricant avec des modifications (EMD Millipore, Etobicoke, Canada). Un total de 2x10 5 cellules T et /ou les cellules B ont été étalées dans chaque puits de la plaque de 96 puits (Corning, Tewksbury, MA, USA). Pour la stimulation des cellules B, tué par la chaleur H D'Agostino et Pearson test de normalité omnibus a été utilisé pour examiner si les données ont été distribuées normalement. Une analyse de variance (ANOVA) a été utilisé pour les comparaisons entre plusieurs groupes suivis par le test de Dunn. test t de Student a été utilisé pour les comparaisons entre les deux groupes. Si les ensembles de données nettement écartés de la distribution normale, tests non paramétriques ont été utilisés. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant Prism (GraphPad Software). P < 0,05 a été considérée comme significative. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± S.E.M.. H Pour analyser les changements potentiels dans le rôle des réponses des lymphocytes B dans H Circulating cellules B dans le sang périphérique de sujets sains sont composés principalement de IgD + CD27 - cellules B naïves et CD21 + CD27 + cellules au repos B mémoire, tandis que dans les infections chroniques, il existe souvent une diminution des cellules B naïves et de repos des cellules de mémoire B, et une augmentation de CD21 lo activé les cellules B et CD24 + CD38 + cellules B [15,18]. Nous avons examiné d'abord la composition des cellules B circulantes dans H em <.> H Auparavant, les cellules B ont été trouvées pour amplifier ou supprimer les réponses immunitaires à travers la production d'une série de cytokines avec des fonctions différentes, y compris les pro- cytokines inflammatoires telles que l'IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-y et TNF-a, ainsi que l'IL-10 et le facteur bêta de croissance transformant (TGF-b) en tant que cytokines régulatrices [19] . Ici, nous avons examiné l'expression des cytokines des cellules B chez des sujets de l'étude. Nous avons constaté que CD24 + CD38 + B ont des fonctions de réglementation dans d'autres études et avaient des niveaux d'expression intéressants dans différents H Tous ensemble, ces données a démontré que cytokine régulatrice IL-10 est principalement produite par CD24 + CD38 + cellules B et est augmentée dans H cellules réglementaires B ont été connus pour inhiber les réponses des lymphocytes T dans les infections chroniques telles que l'infection par l'hépatite B et l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine [14,20], en établissant l'environnement tolérogène par l'IL-10 avant l'induction de l'inflammation [15,21]. Nous avons examiné si les cellules + CD38 + B l'IL-10 produisant CD24 ont eu des effets réglementaires similaires dans H Nous avons ensuite cherché à examiner le mécanisme de l'IL-10 surexpression dans les cellules B de H
infection se produit dans plus de la moitié de la population du monde et est la principale cause de cancer de l'estomac. Une série de style de vie et facteurs nutritionnels, tels que le tabagisme et l'obésité, ont été trouvés pour élever le risque de développement du cancer. Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer les aspects immunologiques pendant H
. pylori
l'infection et le développement du cancer gastrique. Nous avons constaté que les cellules B de H
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patients infectés par présenté la composition et la fonction altérée par rapport aux patients non infectés. cellules CD38 + + B IL-10 exprimant CD24 ont été surexprimés dans H
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patients infectés par, contenaient une activité réglementaire puissante dans l'inhibition de cellules T pro-inflammatoire sécrétion de cytokines, et ont répondu directement à H
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stimulation antigénique. Fait intéressant, dans H
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sujets fumeurs infectés et les sujets obèses, le nombre d'IL-10 + B et cellules CD24 + CD38 + cellules B ont été réduites par rapport à H
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infectés par les sujets asymptomatiques. Les fonctions de réglementation médiées par CD24 + CD38 + cellules B ont également été altérées. En outre, le cancer gastrique des patients positifs ont réduit l'IL-10 produisant des fréquences des cellules B après H
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-Stimulation. Au total, ces données suggèrent que dans H
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-infection, CD24 + CD38 + cellule B est régulée positivement et joue un rôle dans la suppression des réponses pro-inflammatoires, éventuellement par le biais d'IL-10, une caractéristique qui n'a pas été observé dans le tabagisme et les patients obèses
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sujets infectés par et est corrélée avec un risque élevé de cancer gastrique. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591
. pylori)
est une sorte de bactéries Gram-négatives pathogènes trouvés dans plus de la moitié de la population mondiale et inhibe le tractus gastro-intestinal supérieur préférentiellement, y compris l'épithélium de l'estomac et le tractus duodénum [1,2]. Bien que la grande majorité (> 80%) des infections sont asymptomatiques, 10-20% des sujets infectés vont développer des ulcères peptiques alors 1-2% fera l'acquisition de cancer gastrique [3]. Le mécanisme précis du développement du cancer à la suite de H
. infection pylori
est pas bien définie, mais l'inflammation chronique non traitée dans le tractus gastro-intestinal supérieur est pensé pour contribuer à la poursuite de dommages de l'épithélium de l'estomac [4,5]. Plus précisément, l'inflammation associée à des molécules telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-A) de signalisation, se sont révélés favoriser la tumorigenèse gastrique et est régulée à la hausse dans H
. pylori
infection [6]. D'autres cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules T, y compris l'IL-2, IL-17, et l'interféron gamma (IFN-g), sont également surexprimés dans H
. pylori
infection et sont associés à un risque accru de tumorigenèse gastrique [7-10]. Une série d'autres facteurs, tels que l'exposition continue à fumer du tabac et l'obésité, sont positivement corrélés à un risque accru de cancer de l'estomac, bien que le mécanisme sous-jacent ne sait pas [3,11].
. infection pylori
et l'induction subséquente du cancer gastrique, cependant, n'a pas été précédemment étudiés.
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sujets infectés par. Accroissement des pourcentages de CD24 + CD38 + cellules B et les pourcentages réduits de cellules B naïves et de repos des cellules de mémoire B ont été trouvés dans H
. pylor
sujets i-infectés. Le CD24 + CD38 + B cellules dans H
. sujets pylori infectés avaient augmenté
pourcentage d'IL-10, et a supprimé l'expression des cytokines pro-inflammatoires en cas de co-cultivées avec des cellules T autologues. H
. pylori-s
timulated CD24 + CD38 + B cellules de H
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sujets infectés sécrétées puissamment IL-10. Fait intéressant, H
. fumer pylori infectés
sujets et subects obèses avaient réduit les niveaux de CD24 + CD38 cellules + B. En outre, le CD24 + CD38 + cellules B réglementaires dans le tabagisme et les sujets obèses ont été trouvés pour présenter une perte de fonction suppressive en cas de co-cultivées avec des cellules T autologues et stimulé les niveaux d'IL-10 réduit après directe H
. pylori
stimulation. En outre, le tabagisme chez les patients obèses qui ont développé ultérieurement un cancer gastrique, les fréquences des cellules IL-10 B sécrétant ont encore été réduits, par rapport aux sujets qui ne développent pas un cancer gastrique. Au total, ces données ont démontré que les cellules CD38 + + B CD24 ont été surexprimés dans H
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infecté par et avait fonctionnellement supprimé des cellules T la production de cytokines inflammatoires. Le CD24 + CD38 + cellules B chez des sujets fumeurs et les sujets obèses, cependant, étaient réfractaires à H
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-Stimulation, produit moins d'IL-10, et manquaient de capacité suppressive.
Matériaux et
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patients libres de l'ulcère-infectés par, dont 15 sont des consommateurs primaires de la fumée de tabac et 15 sont de classe I obèses (30 kg /m 2 < IMC < 35 kg /m 2 ) des sujets, ainsi que 15 sain H
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individus libres de l'ulcère--uninfected. Les personnes ayant une exposition chronique à la fumée secondaire ont été exclus de l'étude. Aucune différence significative concernant l'âge, le sexe, et l'histoire de l'infection précédente entre les groupes d'étude ont été trouvés. Tous les sujets ont été suivis pendant 5 ans pour l'état de développement du cancer. Tous les sujets étaient des individus non apparentés de la province du Henan et de sa région. Les patients ont été recrutés entre janvier 2008 et décembre 2013 de l'Hôpital Central 155e de PLA en Chine. Les témoins étaient des personnes sans cancer choisis au hasard à partir d'un programme de dépistage du cancer communautaire pour la détection précoce du cancer effectué dans les mêmes régions au cours de la même période, les patients ont été recrutés. Le taux pour les deux contrôles et les cas de réponse était de 95%. Les critères de sélection pour les contrôles sains comprenaient des personnes sans cancer et la fréquence correspondant à des cas par sexe et âge (± 5 ans). Au moment du recrutement, le consentement éclairé a été obtenu à partir de chacune des données soumises et personnelles telles que le sexe, l'âge, le poids, la hauteur et le tabagisme ont été recueillies au moyen d'un questionnaire. Les échantillons de tous les sujets non ont été utilisés dans toutes les expériences en raison de l'observance du patient incomplètes et insuffisantes cellules chez certains patients. Cette étude a été approuvée par le Conseil d'examen institutionnel de l'Hôpital Central 155e de PLA.
Préparation d'échantillons
cellules d'isolement cellulaire
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(Sigma, Munich, Allemagne) ont été utilisées pour stimuler les cellules. GolgiStop et GolgiPlug ont été ajoutés à la cellule avant 6 h récolte pour la coloration intracellulaire de l'IL-2, IL-17, l'IFN-g, du TNF-a et IL-10. FlowJo a été utilisé pour l'analyse de cytométrie en flux.
Luminex test
.
pylori ont été ajoutés aux cellules B qui ont été étalés au fond d'un puits 96 Transwell plaque (Corning, Tewksbury, MA). Pour la stimulation des lymphocytes T, la partie inférieure de la plaque Transwell a été pré-incubées avec CD3 (clone OKT3), anti-humaine pendant une nuit et on l'a lavé, après quoi les lymphocytes T purifiés ont été transférés dans la plaque. perles d'anticorps cytokine de capture humains ont été ajoutés à la chambre supérieure du puits 96 Transwell plaque. Douze heures plus tard, les billes ont été récoltées, lavées et lues selon le protocole du fabricant.
L'analyse statistique
Résultats
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sujets infectés par avaient modifié la composition de circulation des cellules B
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infection et comment elle pourrait être affectée par le tabagisme et l'obésité, 15 sain H
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-uninfected ( H
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-uninfected) bénévoles, 20 H
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infectés par le non-obèses sujets (asymptomatiques) non-fumeurs asymptomatiques, 15 H
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infectés par le tabagisme non-obèses (fumeurs) sujets, et 15 H
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infecté par non-fumeurs sujets (obèses) obèses ont été recrutés pour cette étude. Les données démographiques et cliniques ont été résumées dans le tableau 1.
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sujets infectés par. Des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) ont été colorées pour l'expression des marqueurs de surface directement
ex vivo (figure 1A). Nous avons constaté que l'on compare à H
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-uninfected sujets sains, tous les H
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groupes infectés par contenaient des pourcentages inférieurs de IgD + CD27 - cellules naïves B (P < 0,001 pour tous, la figure 1B et 1C). Les pourcentages de CD21 + CD27 + de repos des cellules de mémoire B ont été réduits dans H
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sujets infectés par le fumeur et les sujets obèses par rapport à des sujets sains (P < 0,001 pour les deux), et le pourcentage de CD21 + CD27 + cellules B chez les sujets obèses a été réduite par rapport à H
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sujets asymptomatiques infectés par le (P < 0,01). Fait intéressant, les pourcentages de CD24 cellules CD38 + + B ont été modifiées entre les différents groupes de H
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sujets infectés par. H
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sujets asymptomatiques infectés par contenaient des pourcentages beaucoup plus élevés de CD24 + CD38 + B cellules que les témoins en bonne santé (P < 0,001). Le pourcentage de CD24 cellules + CD38 + B a été réduite chez les sujets fumeurs par rapport à celle des sujets asymptomatiques (P < 0,05), mais toujours supérieure à celle des sujets sains (P < 0,001). Chez les sujets obèses, le pourcentage de CD24 + CD38 + cellules B n'a pas été significativement différente de celle des sujets sains, mais a été réduit de celle des sujets asymptomatiques (P < 0,001)
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sujets infectés par avaient modifié B cytokine cellulaire profil d'expression
ex vivo l'expression de l'IL-2, IFN-y et TNF-a par les cellules B ont été augmentées en H
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infecté par les sujets fumeurs et les sujets obèses que chez les sujets sains (figure 2A). Aucune différence significative n'a été trouvée dans le TGF-b expression. Cellules
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groupes infectés par le (Fig 1C). Nous avons examiné l'expression de cytokine intracellulaire par CD24 + CD38 + B cellules. Comme le montre la figure 2B, l'expression des cytokines de CD24 + CD38 + cellules B étaient différentes de non-CD24 + CD38 + B (cellules au total B moins CD24 + CD38 + b) dans les cellules qu'ils ne produisent pas de niveaux élevés d'IFN-y et TNF-a lorsqu'elles sont stimulées par le PMA /ionomycine, mais ont exprimé des niveaux très élevés d'IL-10, à la fois dans des conditions non stimulées et stimulées. Nous avons comparé la production d'IL-10 à partir de différents sous-ensembles de cellules B et a constaté que CD24 + CD38 + cellules B dans tous les groupes d'étude sécrétées beaucoup plus élevé d'IL-10 que les non-CD24 + CD38 + des cellules B, à la fois dans des conditions non stimulées ainsi que PMA /ionomycine conditions stimulées (figure 2C). Nous considérons donc le CD24 + CD38 + en fraction principale de l'IL-10 produisant sous-ensemble de cellules B. Dans le H
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groupe infecté par, les sujets asymptomatiques avaient pourcentage plus élevé d'IL-10 des cellules exprimant CD24 en + CD38 + B cellules que des sujets sains tout en H
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infectés par les patients obèses avaient des cellules IL-10 exprimant inférieurs à CD24 + CD38 + B cellules de patients asymptomatiques (figure 2C). Nous avons ensuite multiplié la fréquence de l'IL-10 + cellules dans le CD24 + CD38 + cellules B avec le pourcentage de CD24 + CD38 + cellules dans la cellule totale de B pour obtenir le "nombre" de cellules IL-10 exprimant dans les cellules B, et a constaté que les deux H
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sujets asymptomatiques infectés par le et les sujets fumeurs avaient des niveaux plus élevés d'IL-10 + B cellules que des sujets sains (P < 0,001 et P < 0,01, respectivement). Dans le H
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infectés par le groupe, le tabagisme et l'obésité abaissent considérablement les fréquences de l'IL-10 + cellules B (P < 0,001 pour les deux). provenant de sujets asymptomatiques
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infectés par les sujets asymptomatiques. Le tabagisme et l'obésité réduit l'IL-10 expression dans CD24 cellules CD38 + + B.
H
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sujets asymptomatiques infectés par avaient plus d'activité tolérogène médiée par CD24 + CD38 + B cellules que le tabagisme et les sujets obèses
. pylori
-infection. CD4 + T cellules co-cultivées avec autologues CD24 + CD38 + - cellules B appauvri avaient significativement élevé la production d'IL-2, IL-17, IFN-g et le TNF-a, de CD4 + cellules T coculture avec des cellules entières B, dans H
. pylori
infectés par les patients asymptomatiques (figure 3A). Chez les sujets fumeurs et les sujets obèses, cet effet n'a pas été observé. De même, CD8 + Les cellules de H
T. pylori
sujets asymptomatiques infectés par le co-cultivées avec autologues CD24 + CD38 + - cellules B appauvri considérablement amélioré IFN-g et le TNF-a sécrétion que celles co-cultivées avec des cellules entières B ( La figure 3B). Encore une fois, cet effet n'a pas été observé chez les sujets fumeurs et les sujets obèses. La suppression de l'expression T de cytokines de cellules semble être médiée par le CD24 + CD38 + cellules B, étant donné que la plus faible production de cytokines a été observée dans les cellules CD4 + et CD8 + T cellules de co-cultivées avec CD24 + CD38 + B seules cellules. Au total, ces données ont démontré que le CD24 + CD38 + cellules B dans H
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sujets infectés par le supprimé CD4 + et CD8 + T cellules pro-inflammatoires production de cytokines dans H
. pylori
infectés par les sujets asymptomatiques. Le tabagisme et l'obésité ont inhibé les mesures réglementaires de CD24 cellules CD38 + + B.
IL-10 la sécrétion par les cellules CD24 + CD38 + B sur H
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stimulation dans différents sujets:
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sujets infectés par. la production d'IL-10 est essentielle à la fonction des cellules B de régulation [12,13]. la signalisation du récepteur de type Toll est un mécanisme majeur de la régulation positive de l'IL-10 dans les cellules B, et a été montré pour moduler l'expression des cytokines dans les H
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infection [22,23]. Nous avons vérifié si la présence de H