PLOS ONE: Amélioration des effets des rayonnements par l'acide ursolique dans la cellule BGC-823 Human Cancer adénocarcinome gastrique Line

Résumé

Des recherches récentes ont suggéré que certains polyphénols dérivés de plantes, à savoir, l'acide ursolique (UA), qui sont rapportés pour avoir des activités antitumorales, pourraient être utilisées pour sensibiliser les cellules tumorales à la radiothérapie par des voies inhibitrices conduisant à une résistance à la radiothérapie. Cette expérience a été conçue pour étudier les effets et mécanisme possible de radiosensibilisation par UA dans la lignée cellulaire BGC-823 de cancer gastrique adénocarcinome humain in vitro
. UA a causé la cytotoxicité d'une manière dose-dépendante, et nous avons utilisé une concentration sous-cytotoxicité UA pour tester l'efficacité radioenhancement avec UA dans le cancer gastrique. Radiosensibilité a été déterminée par un test de survie clonogénique. Surviving fraction du groupe combiné avec une irradiation et sous-cytotoxicité UA considérablement baissé par rapport au groupe d'irradiation. L'efficacité de radiosensibilisation améliorée a été associée à G2 améliorée /M arrestation, l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS), régulé à la baisse Ki-67 niveau et l'amélioration de l'apoptose. En conclusion, comme UA a démontré puissant effet anti-prolifération et l'effet synergique, il pourrait être utilisé comme un sensibilisateur de médicament potentiel pour l'application de la radiothérapie

Citation:. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L Qian X, et al. (2015) Amélioration des effets des rayonnements par l'acide ursolique dans BGC-823 adénocarcinome Human Cancer gastrique Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169

Editeur: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, Université de Californie, Berkeley, ÉTATS-UNIS

Reçu le 26 Janvier 2015; Accepté le 24 Juin 2015; Publié: 15 Juillet 2015

Droit d'auteur: © 2015 Yang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. pris en charge par des subventions de la national science Foundation naturel de la Chine (Grant n ° 81172094), Top Six talents projet de la province du Jiangsu (Grant No. 2011ws005), et de la science médicale et de la technologie Projets de développement de Nanjing (Grant No. ZKX10011). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Malgré une baisse de l'incidence, le cancer gastrique est toujours considéré comme l'une des principales causes de décès liés au cancer dans le monde entier. La chirurgie reste le pilier de tout traitement curatif; Toutefois, environ deux tiers des patients atteints de cancer gastrique ont résécable maladie localement avancée et /ou métastatique. Le taux de survie à 5 ans des patients qui ont été diagnostiqués avec un cancer gastrique avancé loco-régionale et ont subi une résection curative restent faibles en raison du risque élevé de récurrence ou de lointaines métastases locales, même si la résection était considérée comme curative. [1] Une perspective randomisée Intergroupe (INT) -0116 essai (556 patients) et de l'expérience coréenne rétrospective (990 patients) ont montré une réduction du taux de récidive locale avec un rayonnement régional postopératoire couplé à une chimiothérapie et un taux de survie plus élevé dans le bras adjuvant. [2] la radiothérapie est la principale modalité de contrôle loco-régional pour le cancer gastrique inopérable [3] Le national Comprehensive cancer Network (NCCN) lignes directrices recommandent la radiothérapie comme traitement standard pour les patients atteints de cancer gastrique avec un risque élevé de récidive. [4] Cependant, il existe deux limites majeures associées au traitement du cancer gastrique à un rayonnement (1) intrinsèque ou acquis une résistance à la radiothérapie; (2) Toxicité non spécifique vers la muqueuse gastrique et les tissus normaux environnants. [2,5]

Pour répondre à ces limitations, les tentatives scientifiques ont été faites pour rechercher un radiosensibilisateur efficace à partir d'herbes avec une toxicité plus faible et plus grande efficacité. Des recherches récentes ont suggéré que de nombreux polyphénols d'origine végétale, y compris la curcumine, le flavopiridol, l'émodine, l'acide ursolique et etc, peuvent être utilisés pour sensibiliser des cellules tumorales aux agents chimiothérapeutiques et la radiothérapie en inhibant les voies conduisant à une résistance au traitement. [6,7, 8] Ces agents ont également été trouvés pour être protecteur de toxicités associées à la thérapie. [5] l'acide ursolique (UA), un acide triterpène pentacyclique, qui est considéré comme l'un de l'agent chimio-prévention le plus prometteur pour le cancer, a été montré pour inciter antitumorale activités, y compris l'inhibition de l'initiation de la tumeur et de la promotion. [9,10] Il a également induit la différenciation des cellules tumorales par régulation de l'expression de gènes spécifiques de différenciation dans les cellules de tératocarcinome F9 de la souris. [11] en outre, il y a eu des preuves démontrant que UA produit un effet anti-angiogénique dans poussin membrane chorioalantoic et une activité anti-invasive dans HT1080 cellules de fibrosarcome humain. [12,13]

Cependant, la recherche antérieure n'a pas encore de démontrer si UA peut renforcer les effets de rayonnement dans les tumeurs malignes . L'expérience a été conçue pour explorer les effets et éventuel mécanisme in vitro de radiosensibilisation par UA dans la lignée cellulaire BGC-823 d'un cancer gastrique adénocarcinome humain pour fournir le soutien théorique pour l'utilisation clinique.

Matériel et méthodes

BGC-823 cellules de culture cellulaire ont été obtenus à partir de Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Chine) et stockés dans RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau bovin à 37 ° C dans une atmosphère saturée en eau avec 5% de CO _2.

cellule essai de cytotoxicité

la cytotoxicité a été déterminée par un dosage MTT effectué une publiée précédemment. [14] Pour illustrer, les cellules ont été étalées à 8 × 10 ^{3 cellules par puits dans des plaques à 96 puits et laissées se fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations d'UC (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) pendant 48 heures dans un minimum de trois puits réplicats. Chaque puits a ensuite été ajouté MTT 20 ul, préparée en mélangeant 5mg MTT avec une solution saline normale 1ml, et incubé pendant une 4h supplémentaire. Milieu de chaque puits a été remplacée par 150ul du DMSO. Absorbance a été déterminée avec un lecteur de microplaques (PEB-RAD) à 490nm. Les puits témoins à blanc ont été utilisées pour la réduction à zéro d'absorbance. Le taux d'inhibition (IR%) a été calculée en utilisant l'absorbance d'arrière-plan corrigé par l'équation suivante:.}

CI _{50 a été définie comme la concentration requise pour 50% d'inhibition de la croissance cellulaire}

cellule groupement et in vitro rayonnements ionisants

Les cellules ont été répartis au hasard en 4 groupes: groupe témoin (A), le groupe UA (B), la radiothérapie (RT) groupe (C), et le groupe combiné (D ). Les cellules BGC-823 ont été cultivées dans des plaques à 6 puits, puis du groupe B et D ont été traitées avec UC, tandis que le groupe C et D ont été irradiés à l'aide d'un 6 MeV linéaire du faisceau d'électrons de l'accélérateur (Elekta, Suède).

clonogénique test de survie

radiosensibilité a été déterminée par un test de survie clonogénique. 500-2000 cellules (par puits) ont été plaquées dans des plaques à 6 puits et on les a laissées se fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec UC (0, 6,25 et 10 ug /ml) pendant 24 heures et ensuite exposées à des doses croissantes de RT (0, 2, 4, 6 et 8GY). Après 10-14 jours d'incubation, les colonies consistaient de plus de 50 cellules ont été observées. Les colonies ont été soigneusement lavés, colorés avec de l'éthanol /cristal colorant violet, puis comptés. L'efficacité de placage (PE) a été calculé comme (moyenne le nombre de colonies /cellules ensemencées), et la fraction survivante (SF) a été calculé comme [signifie le nombre de colonies /(cellules ensemencées × PE)], où PE a été définie comme (moyenne le nombre de colonies pour non irradiés contrôles /cellules ensemencées). D _{0 valeurs ont été calculées par un modèle multi-cible simple hit [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], ce qui représente la dose moyenne d'une exposition létale. le rapport d'amplification de sensibilisateur (SER) a été calculée en D 0 rapport entre le traitement combiné et RT seul.}}

Cycle cellulaire analyse

tampon iodure de propidium /RNase L'influence du cycle cellulaire a été analysé à l'aide (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) coloration selon les instructions du fabricant. 2,5 × 10 ^{5 cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits et on les a laissées se fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec UC (0 et 10 ug /ml) pendant 24 heures et ensuite exposées à la température ambiante (0 à 2 Gy) pendant 48 heures. Les cellules ont été recueillies par trypsinisation, fixé dans 70% d'éthanol à -20 ° C, lavées dans du PBS, remises en suspension dans 1 ml de PBS contenant 1 mg /ml de RNAse et 50 pg /ml d'iodure de propidium, mises en incubation dans l'obscurité pendant 30 min à 37 ° C, et analysées par cytométrie en flux (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).}

mesure de l'apoptose

cellules quantification des cellules de l'apoptose a été évaluée en utilisant un kit de Annexin-V-FITC Apoptosis Detection (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) selon les instructions du fabricant. 2,5 × 10 ^{5 cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits et on les a laissées se fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec UC (0 et 10 ug /ml) pendant 24 heures et ensuite exposées à la température ambiante (0 à 2 Gy) pendant 48 heures. Les cellules ont été recueillies par trypsinisation et remises en suspension dans 500 pi de tampon de liaison, et 5 ul d'isothiocyanate Annexine-V-fluorescéine (FITC), puis 5 ul d'iodure de propidium (PI) ont été ajoutés. Les analyses ont été réalisées avec une cytométrie en flux.}

Détection d'espèces réactives de l'oxygène (ROS)

La concentration intracellulaire de ROS ont été détectées en utilisant les sondes fluorescentes membrane perméable à la 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacétate (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Chine) selon les instructions du fabricant. 1 × 10 ^{6 cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits et on les a laissées se fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec UC (0 et 10 ug /ml) pendant 24 heures, puis exposés à la température ambiante (0 à 2 Gy) pendant 48 heures. Les cellules ont été recueillies par traitement à la trypsine, remises en suspension DCFH-DA pendant 30 min, lavé par du RPMI 1640 sans sérum, puis détectée par cytométrie en flux. L'intensité de fluorescence moyenne (MFI) a représenté le niveau de ROS intracellulaire.}

La coloration immunohistochimique pour Ki-67 évaluer l'expression

Ki-67 expression de la protéine a été évaluée par immunohistochimie le complexe avidine-biotine (ZSGB-BIO , Beijing, Chine) selon les instructions du fabricant. 2 × 10 ^{4 cellules ont été étalées dans des plaques 6 puits avec une lamelle pour chaque puits, et autorisés à fixer pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été traitées avec UC (0 et 10 ug /ml) pendant 24 heures, puis exposés à la température ambiante (0 à 2 Gy) pendant 24 h. Ensuite, les lamelles couvre-objet ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde, mises en incubation avec 0,5% de Triton X-100 pendant 20 minutes, lavées dans du PBS et mises en incubation avec 3% de H _{2 O 2 pendant 15 minutes. Après un rinçage avec du PBS trois fois, les cellules qui ont été fixés sur les lamelles couvre-objet ont été mises en incubation avec Ki-67 anticorps monoclonaux pendant 60 minutes à 37 ° C, puis lavées dans du PBS à nouveau. anticorps biotine conjugué secondaire pour 20min à 20-37 ° C, lavées avec du PBS quatre fois, puis colorés par DAB Coloration Kit, lavé avec de l'eau, puis de contraste avec l'hématoxyline.}}

L'analyse statistique

Les données ont été rapportées en tant que moyenne ± écart-type, et la moyenne des comparaisons ont été effectuées par une ANOVA. P < 0,05 a été acceptée comme statistiquement significative. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant SPSS, v. 17.0.

Les effets cytotoxiques de

Résultats de UA sur BGC-823 cellules

L'effet cytotoxique de UA sur BGC-823 cellules a été évaluée sur la base du test MTT. Nous avons constaté que UA dose-dépendante a augmenté de cytotoxicité dans la lignée cellulaire de cancer gastrique BGC-823 (figure 1). La concentration inhibitrice demi-maximale (IC _{50) valeurs pour BGC-823 était 17.5ug /ml. Légère cytotoxicité (< 15%) d'UC pour BGC-823, 10ug /ml, a été utilisé pour des expériences planifiées ultérieures, de contrôler l'radioenhancement en raison d'un effet cytotoxique direct}

Les effets de radiosensibilisation de UA dans. in vitro

courbes de survie cellulaire mesurée par un test de survie clonogénique ont été illustrés sur la figure 2. par rapport à la RT uniquement, SF _{2 de la RT associée à UC significativement diminuée chez BGC-823 cellules, les valeurs de SER des groupes combinés étaient 1.180 fois et 1,315 fois. Ces résultats indiquent que UA renforcé l'effet de rayonnement de BGC-823 d'une manière dose-dépendante d'ici légères concentrations de cytotoxicité.}

distribution et l'induction de l'apoptose
cycle cellulaire.

Afin de déterminer si la température ambiante et /ou le traitement d'UC pourrait provoquer des perturbations du cycle cellulaire, une analyse de BGC-823 cellules traitées avec 2Gy irradiation et /ou 10 pg /ml d'UC a été réalisée. Par rapport au groupe témoin, 10 ug /ml d'UC seul a produit presque aucun effet sur le cycle cellulaire. Cependant, le groupe combiné d'UC et l'irradiation induite par l'arrêt du cycle cellulaire au G _{1 phase (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) et le G 2 /M phase (3,14% VS 13,67%, p <0,01) par rapport au groupe d'irradiation 2Gy (figure 3A et 3C). Ces résultats suggèrent que le traitement combiné peut avoir causé G 1 phase et G 2 /phase M arrestation, qui a été plus sensibles aux effets nocifs du rayonnement. Les conclusions similaires à partir des données du cycle cellulaire a été prouvée par l'étude précédente. [15]}

La combinaison de UA et l'irradiation pourrait également provoquer la mort cellulaire plus apoptotique comme le montre la figure 3B. La proportion de cellules apoptotiques sensiblement augmenté par l'application des deux UA et de l'irradiation dans BGC-823 cellules par opposition à UA ou IR traitement seul. (78,2% VS 9,6% et 12,5%, p < 0,01, figure 3D)

UA a augmenté RT induit la formation de ROS

Il est largement admis que la mort cellulaire après exposition à des rayonnements ionisants est partiellement médiée par ROS. [16] l'analyse ROS utilisant DCF-DA a produit l'intensité de fluorescence moyenne (MFI), qui représente le niveau de ROS intracellulaire de chaque groupe (figure 4A et 4B). Les IMF de groupe UA seul, seul groupe RT et le groupe UA + RT augmenté de 1,15 fois, 1,53 fois et 2,09 fois par rapport au groupe de contrôle. Le niveau de ROS du groupe combiné a augmenté de manière significative par rapport au seul groupe RT, révélant que l'ajout d'UC à RT induit une formation plus ROS que la radiothérapie seule.

coloration immunohistochimique de Ki-67

Ki -67 était connu comme un antigène nucléaire, ce qui est souvent corrélé avec la prolifération cellulaire. Notre expérience a détecté le taux positif de la protéine Ki-67 par coloration immunohistochimique, et les résultats ont été illustrés sur la figure 5. Pourcentage de Ki-67 cellules positives du groupe combiné a diminué significativement par rapport au groupe de contrôle, ainsi que le groupe de radiothérapie .

Discussion

Cette recherche a examiné les effets et mécanisme possible d'UA comme radiosensibilisateur. Le test MTT et dosage de la survie clonogénique a démontré que l'IR combinée à d'UC était supérieure à la cytotoxicité que IR seul. Cet effet a été observé dans les deux groupes avec différentes concentrations sub-cytotoxicité de UA, 6.25ug /ml et 10 ug /ml. A cette dose, UA avait légèrement cytotoxicité à la ligne humaine adénocarcinome gastrique des cellules cancéreuses BGC823 et n'a pas eu une cytotoxicité significative à la lignée cellulaire gastrique normale. [17] Cela a démontré que l'agriculture urbaine était un radiosensibilisation prometteur in vitro
.

au centre de radiothérapie du cancer est de maximiser l'efficacité thérapeutique de tissu tumoral tout en minimisant les dommages aux tissus normaux. Alors que la planification élaborée et des techniques physiques récentes peuvent augmenter en toute sécurité la dose de rayonnement au tissu tumoral tout en réduisant la dose à entourant les tissus normaux, [18] les techniques de radiothérapie actuelles ne peuvent toujours pas éviter de blesser les tissus à proximité normaux. En outre avantage radiothérapeutique peut être trouvée en examinant la réponse biologique du microenvironnement de la tumeur afin de découvrir comment augmenter la sensibilité d'une tumeur à un rayonnement ou d'inhiber les effets secondaires par rayonnement. [19]

Les tissus normaux autour de cancer de l'estomac, tels que l'intestin et l'estomac, sont sensibles aux rayonnements ionisants. Par conséquent, la dose de rayonnement ionisant vers un tissu tumoral doit être limité. De plus, les effets secondaires qui se chevauchent des rayonnements ionisants renforceront les effets secondaires radiothérapie, et même interrompre le traitement. concentration sous-cytotoxicité UA combinée à des rayonnements ionisants, cependant, peut augmenter la cytotoxicité par les rayonnements ionisants, alors que la faible concentration UA ​​est presque inoffensif pour les tissus normaux. Cette stratégie peut augmenter l'indice thérapeutique pour le tissu tumoral sans augmenter la dose de rayonnement et l'effet radiothérapeutique de côté.

Pour identifier le mécanisme de radiosensibilisation d'UC, nous avons effectué une analyse en plusieurs étapes. Tout d'abord, nous avons analysé la distribution du cycle cellulaire. concentration sous-cytotoxicité UA n'a donné aucun effet significatif sur le cycle cellulaire, alors que comparer avec un rayonnement ionisant seul, le traitement combiné amélioré G _{2 /M arrestation. La radiosensibilité des cellules est corrélée au cycle cellulaire, et la corrélation est plus élevée dans le G 2 /M et la phase inférieure dans la phase S. Cela peut être la plus importante raison sous-jacente pour la radiosensibilisation accrue observée dans cette étude. Deuxièmement, nous avons analysé les taux de ROS intracellulaires. Le niveau ROS du groupe combiné a augmenté de manière significative par rapport au groupe de contrôle, le seul groupe UA, ou même le groupe de rayonnement ionisant. L'ajout d'UC aux rayonnements ionisants induit une formation plus ROS. les rayonnements ionisants induit la radiolyse de l'eau, qui a généré ERO, tels que des radicaux hydroxyle et superoxyde. Ces molécules ROS ont joué un rôle important dans ionisant lésions cellulaires radio-induits, tels que les dommages oxydatifs à l'ADN, conduisant potentiellement à la fois la mort clonogénique et l'apoptose. Troisièmement, dans cette étude, nous avons constaté que le pourcentage de Ki-67 cellules positives du groupe de combinaison a considérablement diminué par rapport au groupe témoin ou le groupe de radiothérapie. Ki-67 est connu comme un antigène associé du cycle cellulaire et un marqueur de prolifération utile. Ki-67 niveau de la protéine est corrélée avec une plus grande capacité de prolifération et de métastases. [20,21]}

En conclusion, la présente étude est la première tentative de démontrer que UA pourrait en synergie avec les rayonnements ionisants contre les lignées cellulaires de cancer gastriques humaines . Le mécanisme sous-jacent de l'efficacité de radiosensibilisation amélioré peut être le G2 amélioré /M arrestation, l'augmentation de ROS et régulé à la baisse le niveau Ki-67. Collectivement, comme montré UC puissant effet anti-prolifération et l'effet de synergie, il pourrait être utilisé comme sensibilisateur médicament potentiel pour l'application de la radiothérapie. Cependant, il est sans aucun doute que des recherches supplémentaires sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et les avantages de l'utilisation de la médecine traditionnelle chinoise comme radiosensibilisateurs avant les applications cliniques réelles. D'autres expériences et réplications sont nécessaires dans d'autres types de tumeurs et dans les essais sur les animaux afin de confirmer l'efficacité de la stratégie proposée.

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