Ploche ONE: Zlepšenie účinky žiarenia od Ursolová kyselina v BGC-823 ľudský adenokarcinóm žalúdka bunková línia rakoviny

abstraktné

Nedávne výskumy naznačujú, že niektoré polyfenoly rastlinného pôvodu, tj Ursolová kyselina (UA), ktoré sú evidované majú protinádorové aktivity, môžu byť použité pre citlivosť nádorových buniek k radiačnej terapii tým, že zabráni ciest čo vedie k odolnosti proti rádioterapie. Tento experiment bol navrhnutý tak, aby skúmala účinky a možné mechanizmus radiosensitization o UA v bunkovej línii BGC-823 z ľudského adenokarcinóme rakoviny žalúdka in vitro
. UA spôsobil cytotoxicitu spôsobom závislým od dávky, a bol použitý v koncentrácii nižšej cytotoxicitu UA testovať radioenhancement účinnosť pri UA u karcinómu žalúdka. Radiosenzitivita bola stanovená testom klonogenní prežitie. Prežívajúce zlomok skupine s kombinovanou s ožarovaním a sub-cytotoxicity UA značne znížili v porovnaní so skupinou ožarovania. Zlepšená účinnosť radiosensitization bola spojená so zvýšenou G2 /M zástavy, zvýšenej reaktívne formy kyslíka (ROS), down-regulované Ki-67 úrovne a lepšej apoptózu. Záverom, ako je preukázané UA silný antiproliferačný účinok a synergický účinok, že by mohli byť použité ako potenciálny liečivá zvyšujúce citlivosť pre aplikáciu rádioterapie

Citácia :. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, L Yu , Qian X, et al. (2015) Zlepšenie účinky žiarenia od Ursolová kyselina v BGC-823 ľudský adenokarcinóm žalúdka Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169

Editor: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Spojené štáty americké

prijatá: 26.ledna 2015; Prijaté: 24.júna 2015; Uverejnené: 15.července 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Podporované grantom z Národného Natural Science Foundation Číny (Grant No. 81172094), prvý šestke Talents projekt provincii Jiangsu (Grant č 2011ws005) a lekárskej vedy a technológie rozvojové projekty Nanjing (Grant č ZKX10011). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Napriek poklesu výskytu rakoviny žalúdka je stále považovaná za jednu z hlavných príčin úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete. Chirurgia je aj naďalej základom akéhokoľvek kuratívnu liečbu; Avšak, približne dve tretiny pacientov s diagnózou rakoviny žalúdka majú neodstrániteľným lokálne pokročilého a /alebo metastáz. Miera 5-ročné prežitie u pacientov, ktorí boli diagnostikovaní s pokročilým loco-regionálnej rakoviny žalúdka a podstúpili kuratívny resekcii zostáva nízka vzhľadom na vysoké riziko lokálnej recidívy alebo vzdialených metastáz aj keď resekcie bolo veril byť liečivá. [1] Perspektívne randomizovanej Intergroup (INT) -0116 štúdie (556 pacientov) a retrospektívnej kórejskej skúsenosti (990 pacientov) preukázala zníženie lokálnych recidív s pooperačnou regionálne žiarením v kombinácii s chemoterapiou a vyššiu mieru prežitia vo pomocnú ruku. [2] Rádioterapia je hlavným loco-regionálne kontrolné metóda pre neodstrániteľný rakoviny žalúdka [3] Národné Comprehensive Cancer Network (NCCN) usmernenia odporúčajú rádioterapiu ako štandardná liečba u pacientov s karcinómom žalúdka s vysokým rizikom recidívy .; [4] Avšak, existujú dva hlavné medze spojené s liečbou rakoviny žalúdka so žiarením: (1) vnútorné alebo získaná rezistencia na rádioterapiu; (2) nešpecifické toxicity voči žalúdočnej sliznice a okolité normálne tkanivá. [2,5]

Na riešenie týchto obmedzení, boli vykonané pokusy učené k hľadaniu účinnej radiosenzitizér z bylín s nižšou toxicitou a vyššej účinnosti. Nedávne výskumy naznačujú, že mnoho polyfenoly rastlinného pôvodu, vrátane curcumin, flavopiridolem, emodínov, Ursolová kyselina a atď, môžu byť použité pre citlivosť nádorových buniek k chemoterapeutickým činidlám a rádioterapie inhibíciou dráhy vedúce k rezistencii liečby. [6,7, 8], boli tiež zistilo, že tieto prostriedky byť chránené pred terapie spojených s toxicitou. [5] Ursolová kyseliny (UA), čo je pentacyklický kyselina triterpény, ktorý je považovaný za jeden z najsľubnejších chemopreventivního činidlo pre rakovinu, bolo preukázané, že výzvu protinádorovú činnosti, vrátane inhibícia iniciácie a propagácie tumoru. [9,10] takisto indukovanú diferenciáciu nádorových buniek pomocou regulácie expresie diferenciačných špecifických génov v myšiach teratokarcinomu F9 buniek. [11] Okrem toho, tam bol dôkaz o tom, že UA vyrobené anti-angiogénny účinok kurčiat chorioalantoic membráne a anti-invazívnej aktivity v ľudských HT1080 buniek fibrosarkómu. [12,13]

Avšak, pred výskum má ešte preukázať, či UA môže zvýšiť účinky žiarenia v malígny nádor , Experiment bol navrhnutý tak, aby skúmať účinky a možný mechanizmus in vitro radiosensitization od UA v BGC-823 bunkové línie ľudského adenokarcinóme karcinómu žalúdka poskytovať teoretickú podporu pre klinické použitie.

Materiály a metódy

bunkovej kultúre

BGC-823 bunky boli získané od Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Čína) a uložené v médiu RPMI 1640 s 10% teľacím hovädzie sérum pri 37 ° C vo vodou nasýtenej atmosfére 5% CO _2.

Cell test cytotoxicity

cytotoxicita bola stanovená testom MTT predviedol uverejnené skôr. [14] Pre ilustráciu, bunky boli nanesené na 8 × 10 ^{3 buniek na jamku do 96-jamkových doštičiek a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené rôznymi koncentráciami UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) počas 48 hodín v minimálne troch replikovať studne. Každej jamky bolo potom pridané 20ul MTT, pripraví zmiešaním 5 mg MTT s 1 ml normálneho fyziologického roztoku a inkubované po dobu ďalších 4 hodín. Médium v ​​každej jamke bol nahradený 150ul DMSO. Absorbancia bola určená čítačkou mikrodoštičiek (BIP-RAD) v 490 nm. Prázdne kontrolné jamky boli použité pre nulovanie absorbancie. Miera inhibície (IR%) bola vypočítaná za použitia pozadia korigovaná absorbancia sa podľa tejto rovnice :.}

IC _{50 bola definovaná ako koncentrácia potrebná pre 50% inhibíciu bunkového rastu}

Cell zoskupenia a in vitro ionizujúceho žiarenia

Bunky boli náhodne rozdelené do 4 skupín: kontrolná skupina (a), UA skupiny (B), radiačná terapia (RT), skupina (C), a v kombinácii skupina (D ). Bunky BGC-823 boli kultivované v 6-jamkových doštičkách a potom sa skupina B a D sa liečilo UA, pričom skupiny C a D boli ožiarené za použitia 6-MeV elektrónový lúč lineárneho urýchľovača (ELEKTA, Švédsko).

klonogenní test prežitie

radiosenzitivity bola stanovená testom klonogenní prežitie. Bunky (500-2000 na jamku) boli nanesené na 6-jamkové doštičky a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené UA (0, 6,25 a 10 ug /ml) počas 24 hodín a potom sa vystaví zvyšujúcim sa dávkam RT (0, 2, 4, 6 a 8Gy). Po 10-14 dňoch inkubácie, kolónie sa skladala z viac ako 50 buniek boli pozorované. Kolónie boli premyté opatrne, zafarbené etanol /kryštál červeného farbiva, a potom počítané. Účinnosť pokovovanie (PE) sa vypočítala ako (priemerný počet kolónií /buniek osev), a prežívajúce frakcie (SF) sa vypočítala ako [znamenať kolónií /(bunky somár × PE)], kde PE bola definovaná ako (priemer kolónií pre un-ožiarené Riadenie /bunky osev). D _{0 hodnoty boli vypočítané pomocou viac-cieľový single-hit modelu [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], čo predstavuje priemernú dávku smrtiacej expozície. Zvýšenie senzibilizátor pomer (SER) sa vypočítala ako D 0 pomer medzi kombinovanej liečby a len RT.}}

bunkového cyklu analýza

Vplyv bunkového cyklu bola analyzovaná s použitím propidiumjodidom /RNázy pufra (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), farbenie podľa pokynov výrobcu. 2,5 x 10 ^{5 boli bunky umiestnené do 6-jamkových doštičiek a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené UA (0 a 10 ug /ml) počas 24 hodín a potom sa vystaví na teplotu miestnosti (0 a 2Gy) po dobu 48 hodín. Bunky boli zbierané trypsinizací, fixované v 70% etanolu pri teplote -20 ° C, premyté v PBS, resuspendované v 1 ml PBS s obsahom 1 mg /ml RNázy a 50 ug /ml propidium jodidu, inkubované v tme po dobu 30 minút pri teplote 37 ° C, a analyzované pomocou prietokovej cytometrie (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).}

meranie apoptózy

bunky kvantifikácia apoptózy buniek bola hodnotená pomocou annexin-V-FITC Kit Apoptosis Detection (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. 2,5 x 10 ^{5 boli bunky umiestnené do 6-jamkových doštičiek a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené UA (0 a 10 ug /ml) počas 24 hodín a potom sa vystaví na teplotu miestnosti (0 a 2Gy) po dobu 48 hodín. Bunky boli zbierané trypsinizací, a resuspendované vo 500ul väzbového pufra a 5 ul annexinu-V-fluorescein isothiokyanátem (FITC), a potom bolo pridané 5 ul z propidium jodidu (PI). Analýzy boli vykonané pomocou prietokovej cytometrie.}

Detekcia reaktívne formy kyslíka (ROS) generovanie

Koncentrácia intracelulárneho ROS boli detekované za použitia membránové priepustné pre fluorescenčné sondy 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetát (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. 1 x 10 ^{6 bunky boli nanesené na 6-jamkové doštičky a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené UA (0 a 10 ug /ml) po dobu 24 hodín, a potom sa vystaví na teplotu miestnosti (0 a 2Gy) po dobu 48 hodín. Bunky boli zbierané trypsinizací, resuspendované DCFH-DA po dobu 30 minút, premyté pomocou bezsérového RPMI 1640, a potom detekuje pomocou prietokovej cytometrie. Priemerná intenzita fluorescencie (MFI), v zastúpení vnútrobunkovej hladiny ROS.}

Imunohistochemické farbenie pre posudzovanie Ki-67 expresie

Ki-67 expresia proteínu bola hodnotená na základe komplexného imunohistochemických avidín-biotín (ZSGB-BIO , Peking, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. 2 x 10 ^{4 bunky boli nanesené na 6-jamkových doštičkách s krycím sklíčkom pre každú jamku a ponechané prichytiť sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené UA (0 a 10 ug /ml) po dobu 24 hodín, a potom sa vystaví na teplotu miestnosti (0 a 2Gy) po dobu 24 hodín. Potom sa krycie sklíčka boli fixované v 4% paraformaldehydu, inkubované s 0,5% Triton X-100 za 20 minút, premyté v PBS a inkubované s 3% H 2O _{2 po dobu 15 minút. Po opláchnutí PBS trikrát, bunky, ktoré boli pripojené na krycie sklíčka boli inkubované s Ki-67 monoklonálnych protilátok na 60 minút pri 37 ° C, a potom sa premyje v PBS znovu. Biotín-konjugované sekundárnej protilátky za 20 minút pri 20-37 ° C, premyjú sa PBS po dobu štyrikrát, potom sa zafarbia podľa DAB Farbiace súprava, premyje sa vodou a potom kontrastne hematoxylínom.}}

Štatistická analýza

Dáta bola označená ako priemer ± SD, a znamenajú porovnanie boli vykonané jednocestnú ANOVA. P < 0,05 bola prijatá ako štatisticky významné. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou SPSS, v. 17.0.

Výsledky

cytotoxické účinky UA na BGC-823 buniek

Cytotoxický účinok UA na BGC-823 buniek hodnotená na základe MTT testu. Zistili sme, že UA v závislosti od dávky zvyšuje cytotoxicitu v žalúdočnej rakovina bunkové línie BGC-823 (obrázok 1). Inhibičná koncentrácia polovicu maximálnej (IC _{50) hodnoty pre BGC-823 bol 17.5ug /ml. Mierne cytotoxicity (< 15%) UA pre BGC-823, 10 ug /ml, bol použitý pre ďalšie plánované experimenty, ku kontrole na radioenhancement vďaka priamemu cytotoxický účinok}

Na radiosensitization účinky UA v. vitro

prežitie buniek krivky meranej testom klonogenní prežitie bolo znázornené na obr 2. v porovnaní s RT iba, SF _{2 RT v kombinácii s UA vo výrazne znížil BGC-823 bunky, SER hodnoty kombinovaných skupín boli 1,180 a 1,315-krát-krát. Tieto výsledky ukazujú, že UA zvyšuje radiačnej účinok BGC-823 v závislosti od veľkosti dávky v závislosti na v miernej koncentrácii cytotoxicity.}

distribúcie bunkového cyklu a indukcie apoptózy.

Pre zistenie, či RT a /alebo liečbu UA môže spôsobiť nejaká odchýlka bunkového cyklu, analýza BGC-823 buniek ošetrených 2Gy ožarovanie a /alebo 10 ug /ml UA bol vykonaný. V porovnaní s kontrolnou skupinou, 10 ug /ml UA sám sa získa takmer žiadny vplyv na bunkový cyklus. Avšak, v kombinácii skupina UA a ožiarením indukované zastavenie bunkového cyklu u _{1 fáza G (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) a G 2 /M fáze (3,14% VS 13,67%, p <0,01) v porovnaní so skupinou ožarovania 2Gy (obr 3A a 3C). Tieto nálezy naznačujú, že kombinovaná liečba môže spôsobiť G 1 fázu a G 2 /M fázy zatknutie, ktorý bol náchylnejší k škodlivými účinkami žiarenia. Obdobné závery z údajov bunkového cyklu sa ukázalo, že predchádzajúce štúdie [15].}

Kombinácia UA a ožarovanie by tiež mohla spôsobiť viac proapoptotický bunkovú smrť ako je znázornené na obr 3B. Podiel apoptotických buniek významne zvýšil o uplatnenie ako UA a ožiarenia v BGC-823 buniek na rozdiel od UA alebo IR liečbe samotným. (78,2% v porovnaní s 9,6% a 12,5%, p < 0,01 3D, obr)

UA zvýšil RT vyvolanú tvorbu ROS

je všeobecne uznáva, že odumieranie buniek po vystavení ionizujúcemu žiareniu je čiastočne sprostredkovaná ROS. [16] ROS analýza pomocou DCF-DA produkoval priemernú intenzitu fluorescencie (MFI), ktorá zastúpené intracelulárne hladiny ROS v každej skupine (obr 4A a 4B). MFI UA samotným skupiny, RT samotnú skupinu a skupinu UA + RT sa zvýšil o 1,15-násobnom, 1,53-krát a 2,09-krát v porovnaní s kontrolnou skupinou. Hladina ROS kombinačné skupine významne zvýšil v porovnaní s iba RT skupiny, odhalila, že pridanie UA na teplotu miestnosti indukované viac tvorbu ROS, než len RT.

Imunohistochemické farbenie Ki-67

Ki -67 bol známy ako nukleárna antigén, ktoré sa často koreluje s bunkovou proliferáciou. Náš experiment zistená pozitívna počet Ki-67 proteínu imunohistochemické farbenie, a výsledky boli znázornené na obr 5. Percento Ki-67 pozitívnych buniek kombinovanej skupiny značne znížili v porovnaní s kontrolnou skupinou, ako aj terapeutickej skupiny radiačnej .

Diskusia

Tento výskum skúmal účinky a možný mechanizmus UA ako radiosenzitizér. MTT test a test klonogenní prežitie preukázala, že IR v kombinácii s UA bol lepší v cytotoxicite ako samotný IR. Tento účinok bol pozorovaný u oboch skupín s rôznymi koncentráciami sub-cytotoxicity UA, 6.25ug /ml a 10 ug /ml. Pri tejto dávke, UA mal mierny cytotoxicitu pre ľudský adenokarcinóm žalúdka bunková línia rakoviny BGC823 a nemal významnú cytotoxicitu pre normálne bunkové línie žalúdka. [17] To ukazuje, že UA bol sľubným radiosensitization in vitro
.

strednej k vzniku rakoviny ožarovaním je maximalizácia terapeutickú účinnosť na nádorové tkanivá a zároveň minimalizuje poškodenie normálnych tkanív. Kým prepracovanejšie plánovanie a posledné fyzické techniky môžu bezpečne zvýšiť dávku žiarenia na nádorové tkanivá a zároveň znížiť dávku na okolité normálne tkanivá, [18] Súčasná rádioterapie techniky stále nemôže nedošlo k zraneniu osôb v okolí normálneho tkaniva. Ďalej rádioterapeutickej prínos možno nájsť tým, že skúma biologickú odpoveď v mikroprostredie nádoru odkryť, ako pre zvýšenie citlivosti nádoru k žiareniu alebo inhibíciu vedľajších účinkov žiarenia. [19]

normálneho tkaniva okolo rakoviny žalúdka, ako je črevná a žalúdka, sú citlivé na ionizujúce žiarenie. V dôsledku toho, ionizujúcim žiarením, dávka na nádorové tkanivá musia byť obmedzené. Okrem toho budú prekrývajúce vedľajšie účinky ionizujúceho žiarenia zvýšiť rádioterapie nežiaduce účinky, a dokonca aj prerušiť liečbu. Koncentrácia nižšia ako cytotoxicita UA v kombinácii s ionizujúcim žiarením, však môže zvýšiť cytotoxicitu ionizujúcim žiarením, zatiaľ čo nízka koncentrácia UA je takmer neškodný pre normálne tkanivá. Táto stratégia môže zvýšiť terapeutický index pre nádorové tkanivo bez zvýšenia dávky žiarenia a rádioterapeutickej vedľajšie účinky.

Ak chcete určiť mechanizmus radiosensitization z UA, sme vykonali analýzu v niekoľkých krokoch. Najprv sme analyzovali rozloženie bunkového cyklu. Koncentrácia sub-cytotoxicita UA nepriniesla žiadny významný účinok na bunkový cyklus, zatiaľ čo v porovnaní s ionizujúcim žiarením sám, kombinovanú liečbu zvýšenú G _{2 /M zástava. Radiosenzitivita buniek je v korelácii s bunkového cyklu, a korelácia je vyššia v skupine G 2 /M fázy a nižšia v S fáze. To môže byť najdôležitejšie hlavným dôvodom pre zvýšenie radiosensitization pozorované v tejto štúdii. Po druhé sme analyzovali vnútrobunkové hladiny ROS. Hladina ROS v kombinovanej skupine signifikantne vyššia v porovnaní s kontrolnou skupinou, sa samotným UA skupiny, alebo dokonca ionizujúceho žiarenia skupiny. Prídavok UA ionizujúcemu žiareniu indukované väčšiu tvorbu ROS. Ionizujúcim žiarením indukované rádiolýzou vody, ktorý generované ROS, ako sú hydroxylové radikály a superoxidu. Tieto ROS molekuly hrajú dôležitú úlohu v ionizujúceho žiarenia indukovanej bunkovej lézie, ako je napríklad poškodenie oxidačný DNA, čo môže viesť ako k klonogenní smrti a apoptózy. Po tretie, v tejto štúdii sme zistili, že percento Ki-67 pozitívnych buniek kombinačné skupiny značne znížili v porovnaní s kontrolnou skupinou, alebo skupinou rádioterapie. Ki-67 je známy ako bunkového cyklu spojeného antigénu a užitočný proliferačnú marker. Ki-67 na úrovni proteínu koreluje s vyššou proliferácie a metastáz schopnosti. [20,21]}

Na záver, táto štúdia je prvý pokus demonštrovať, že UA by mohli pôsobiť synergicky s ionizujúcim žiarením na ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných , Základný mechanizmus zlepšeného radiosensitization účinnosť môže byť zvýšená G2 /M zástava, zvýšenie ROS a down-regulované Ki-67 úrovne. Súhrnne ako UA preukázala silnú antiproliferačný účinok a synergický účinok, že by mohli byť použité ako potenciálny liečivá zvyšujúce citlivosť pre aplikáciu rádioterapie. Avšak, to je bez pochýb, že je potrebný ďalší výskum, aby posúdila uskutočniteľnosť a výhody používania tradičnej čínskej medicíny ako radiosenzitizéry pred skutočných klinických aplikácií. Ďalšie experimenty a replikácie sú potrebné v iných typov nádorov a v štúdiách na zvieratách na opätovné potvrdenie účinnosti navrhovanej stratégie.

• Ploche ONE: microRNA-206: Účinná inhibícia progresie karcinómu žalúdka prostredníctvom c-Met Pathway
• Ploche ONE: klinický význam MLH1 metylácie CPG ostrova a Methylator fenotyp ako prognostických markerov u pacientov s žalúdočnej Cancer