PLoS One: Enhancement sugárzás hatásai által urzolsavat a BGC-823 humán adenokarcinóma Gyomor Cancer Cell Line

absztrakt katalógusa

A legújabb kutatások azt mutatják, hogy egyes növényi eredetű polifenolok, azaz urzolsav (UA), amely jelentették, hogy tumorellenes aktivitással, lehet használni, hogy érzékennyé tumorsejtek sugárkezelés gátlásával utak vezetnek sugárkezelés ellenállás. Ez a kísérlet célja az volt, hogy vizsgálja meg a hatások és lehetséges mechanizmusa sugárérzékenyítés által UA BGC-823 sejtvonal humán adenokarcinóma a gyomorrák in vitro katalógusa. UA okozott citotoxicitást dózis-függő módon, és használtuk egy al-citotoxicitási koncentráció UA tesztelésére radioenhancement hatásosság UA a gyomorrák. Sugárérzékenység határoztuk klonogén túlélési vizsgálatot. Túlélni frakció a kombinált csoport besugárzás és al-citotoxicitás UA szignifikánsan csökkent a besugárzás csoport. A javított sugárérzékenyítés hatásosságát társult fokozott G2 /M roham, fokozott reaktív oxigénfajták (ROS), alulszabályozott a Ki-67 szint és javult az apoptózist. Összefoglalva, a UA bizonyított hatásos antiproliferatív hatás és szinergikus hatás, akkor lehetne használni, mint egy potenciális gyógyszer érzékenyítő alkalmazásának sugárkezelés. Katalógusa

Citation: Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L Qian X, et al. (2015) Biztosítja a sugárzás hatásai által urzolsavat a BGC-823 humán adenokarcinóma Gyomor Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169 katalógusa

Szerkesztő: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: január 26, 2015; Elfogadva: június 24, 2015; Megjelent: július 15, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Yang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír. katalógusa

Forrás: támogatták a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Grant No. 81172094), Top Hat Talents Project Jiangsu tartomány (Grant No. 2011ws005), és az orvosi tudomány és technológia fejlesztési projektek Nanjing (Grant No. ZKX10011). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Annak ellenére, hogy csökken a beesési, gyomorrák még mindig tartják az egyik fő oka a rákos halálesetek világszerte. Sebészet továbbra is a támasza gyógyító kezelés; azonban mintegy kétharmadát diagnosztizált betegek gyomorrák van rezekálható lokálisan előrehaladott és /vagy áttétes. Az 5 éves túlélési arány a betegek, akik diagnosztizáltak előrehaladott helyi-regionális gyomorrák és átesett kuratív rezekció alacsony marad, mivel a magas kockázatú helyi kiújulás, vagy távoli áttét is, ha rezekció hitték, hogy gyógyító. [1] A perspektivikus randomizált Intergroup (ok) -0116 vizsgálatban (556 beteg) és retrospektív koreai tapasztalat (990 beteg) csökkenést mutatott a helyi kiújulási arány posztoperatív regionális sugárzás párosul kemoterápia és a magasabb túlélési arány az adjuváns karját. [2] a sugárkezelés a fő helyi-regionális ellenőrzési módszer az rezekálható gyomorrák. [3] A Nemzeti Rákkutató Hálózat (NCCN) irányelvek szerint a sugárkezelés, mint egy hagyományos kezelés gyomorrákos betegek magas a kiújulás kockázata; [4] Van azonban két fő korlátok társított kezelésére gyomorrák sugárzással: (1) öröklött vagy szerzett rezisztenciát sugárterápia; (2) nem specifikus toxicitása felé gyomornyálkahártya és a környező ép szövetek. [2,5] katalógusa

Ahhoz, hogy ezeket korlátozások, tudományos kísérleteket végeztek, hogy keressen egy hatékony radioszenzitizáló gyógynövények kisebb toxicitású és nagyobb hatékonyságot. A legújabb kutatások azt mutatják, hogy sok növényi eredetű polifenolok, beleértve a kurkumin, flavopiridollal, emodin, urzolsavat és stb, lehet használni, hogy érzékennyé tumorsejtek kemoterápiás szerekkel és sugárkezelés gátlásával vezető utak a kezelésre ellenállást. [6,7, 8] Ezek a szerek is megállapították, hogy a védő származó terápia-asszociált toxicitást. [5] urzolsav (UA), pentaciklusos triterpén-sav, mely még ma is az egyik legígéretesebb kemopreventív szer a rák, kimutatták, hogy jelezzen tumorellenes tevékenységek, beleértve a gátló tumor kialakulása és a promóció. [9,10] is indukált tumor sejtek differenciálódását expressziójának szabályozásában differenciálás-specifikus gének egér F9 teratokarci sejteket. [11] Ezen kívül ott volt bizonyíték arra, hogy UA előállított egy anti-angiogén hatás csirkeembrió chorioalantoic membrán és egy anti-invazív aktivitás HT1080 humán fibroszarkóma sejteket. [12,13]

megelőzően azonban a kutatás még bizonyítani, hogy UA növelheti a sugárzás hatása rosszindulatú daganata . A kísérlet célja az volt, hogy feltárja a hatások és a lehetséges mechanizmus in vitro sugárérzékenyítés által UA BGC-823 sejtvonal humán adenokarcinóma gyomorrák, hogy az elméleti támogatást a klinikai használatra. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejtkultúra

BGC-823 sejteket nyertünk Shanghai Intézet Cell Biology (Shanghai, Kína) és tárolt RPMI 1640 tápközegben, amely 10% borjú szarvasmarha szérum 37 ° C hőmérsékleten egy vízzel telített atmoszférában 5% CO _2.

Cell citotoxicitási vizsgálatban

a citotoxicitást úgy határoztuk meg, MTT assay egy korábban publikált [14]. Annak illusztrálására, sejteket szélesztettünk 8 × 10 ^{3 sejt per lyuk 96 lyukú lemezekre és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltünk különböző koncentrációjú UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 mikro g /ml) 48 órán át egy legalább három párhuzamos kutak. Ezután minden egyes rezervoárba hozzáadunk 20 p MTT, állítjuk elő 5 mg MTT 1 ml normál sóoldattal, és inkubáljuk egy további 4H. Közepes minden egyes lyukban helyettesítjük 150ul DMSO. Az abszorbanciát meghatároztuk egy mikrotiterlemez-leolvasó (BIP-RAD), 490 nm-en. A vak kontroll mérőhelyeket használt nullázás abszorbancia. A gátlási arányt (IR%) segítségével számoltuk ki a háttérben korrigált abszorbanciát a következő egyenlet:}

A IC _{50 definíció szerint a szükséges koncentráció 50% -os gátlását a sejtek növekedését.}

Cell csoportosítás és in vitro az ionizáló sugárzás

a sejteket véletlenszerűen 4 csoportba osztjuk: kontroll csoport (a), UA-csoport (B), sugárkezelés (RT) csoport (C), és a kombinált csoport (D ). A BGC-823 sejteket tenyésztettünk 6 mérőhelyes lemezeken, majd B csoport és D kezeltük UA, míg C csoport és D besugároztuk egy 6 MeV elektronsugarat lineáris gyorsító (Elekta, Svédország).

klonogén túlélési vizsgálat katalógusa

sugárérzékenysége határoztuk klonogén túlélési vizsgálatot. A sejteket (500-2000 lyukanként) szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltük UA (0, 6,25 és 10 ng /ml) 24 órán, majd ki vannak téve a növekvő dózisú RT (0, 2, 4, 6 és 8Gy). Miután 10-14 napig tartó inkubálás kolóniák állt több mint 50 sejtet figyeltünk meg. A telepeket mostuk óvatosan, megfestettük etanol /kristályibolya festék, majd megszámoltuk. A kioltás hatékonyságát (PE) számítottuk (átlag telepszámokat /oltott sejtek), és a túlélő frakció (SF) számítottuk ki [jelent telepszámokat /(oltott sejtek × PE)], ahol PE definiáltuk (átlag kolónia számít un-besugárzott ellenőrzése /sejtekkel). D _{0 értékeket úgy számították ki egy multi-cél egy-hit modell [S = 1 - (1-E ^{-d /D0) N], amely képviseli az átlagos dózis halálos expozíció. Érzékenyítődobozok tartozékot arány (SER) számították D 0 aránya a kombinációs kezelés és kizárólag RT. Katalógusa}}

A sejtciklus analízis katalógusa

A hatása sejtciklus elemeztük zt /RN puffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) festés, a gyártó utasításai szerint. 2.5 × 10 ^{5 sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltük UA (0 és 10 ng /ml) 24 órán, majd ki vannak téve a RT (0 és 2Gy) 48 órán keresztül. A sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük, fix 70% -os etanollal -20 ° C-on, PBS-ben mostuk, újra szuszpendáljuk 1 ml PBS-ben, amelyek 1 mg /ml RNáz és 50 ug /ml propidium-jodid, sötétben inkubáljuk 30 percig 37 ° C- és áramlási citometriával elemezzük (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).}

mérése apoptózis

Cells számszerűsítését apoptózis sejtek alkalmazásával értékeltük egy Annexin-V-FITC apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. 2.5 × 10 ^{5 sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltük UA (0 és 10 ng /ml) 24 órán, majd ki vannak téve a RT (0 és 2Gy) 48 órán keresztül. A sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 500ul kötőpufferrel, és 5 jjj Annexin-V-fluoreszcein izotiocianát (FITC), majd 5 jjj a propidium-jodid (PI) adunk hozzá. Az analíziseket egy áramlási citometriával.}

kimutatása a reaktív oxigéngyökök (ROS) generáció

A koncentrációkat az intracelluláris ROS alkalmazásával detektáltuk a membrán-permeábilis fluoreszcens szondák 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetát (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kína), a gyártó utasításai szerint. 1 × 10 ^{6 sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltük UA (0 és 10 ng /ml) 24 órás, majd ki vannak téve, hogy RT (0 és 2Gy) 48 órán keresztül. A sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk DCFH-DA 30 percig, mostuk szérummentes RPMI-1640, és aztán észlelt áramlási citometriával. Az átlagos fluoreszcencia intenzitás (MFI), képviseli intracelluláris ROS szint.}

immunhisztokémiai festését értékelésére a Ki-67 expresszió

Ki-67 fehérje expresszióját értékeltük az avidin-biotin komplex immunhisztokémiai (ZSGB-BIO , Peking, Kína), a gyártó utasításai szerint. 2 × 10 ^{4 sejteket szélesztettünk 6 lyukas lemezeken egy fedőlemez mindegyik is, és éjszakán át hagytuk letapadni. Ezután a sejteket kezeltük UA (0 és 10 ng /ml) 24 órás, majd ki vannak téve, hogy RT (0 és 2Gy) 24 órán keresztül. Ezután a fedőlemezeket fixáltuk 4% paraformaldehiddel, inkubáltuk 0,5% Triton X-100-20min, PBS-sel mostuk, és inkubáltuk 3% H _{2 O 2 15 percig. Öblítés után PBS-sel háromszor mostuk, a sejteket amelyek csatolt a fedőlemezeket inkubáltuk a Ki-67 monoklonális antitestek 60 percen át 37 ° C-on, majd mostuk PBS-ben újra. Biotin-konjugált másodlagos antitestekkel 20 percen át 20-37 ° C-on, PBS-sel mostuk, négy alkalommal, majd megfestjük DAB festést Kit, vízzel mossuk, majd hematoxilinnel ellenfestettük.}}

Statisztikai analízis

Az adatokat számoltak átlag ± SD, és az átlagos összehasonlításokat végeztük egyutas ANOVA. P < 0,05 fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak. A statisztikai elemzést az SPSS, v. 17.0. Katalógusa

Eredmények katalógusa

citotoxikus hatása az UA-BGC-823 sejtek katalógusa

A citotoxikus hatása az UA-BGC-823 sejtek alapján értékeltük az MTT assay. Azt találtuk, hogy UA dózisfüggően növelte citotoxicitás A gyomorrák sejtvonal BGC-823 (1. ábra). A fél-maximális gátló koncentráció (IC _{50) értékei BGC-823 volt 17.5ug /ml. Enyhén citotoxicitás (< 15%) UA a BGC-823, 10 ng /ml-t használtuk a későbbi tervezett kísérletek, hogy ellenőrizzék a radioenhancement miatt közvetlen citotoxikus hatás.}

A sugárérzékenyítés hatásait UA vitro katalógusa

Cell túlélési görbék által mért klonogén túlélési vizsgálat arra ábrán látható 2. összehasonlítva RT csak SF _{2 RT együtt UA jelentősen csökkent BGC-823 sejtekben, SER értékei a kombinált csoportban volt 1,180-szeres és 1,315-szeres. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy UA fokozta a sugárzás hatását BGC-823 dózis-függő módon módon, olyan enyhe citotoxicitás koncentrációban.}

sejtciklus eloszlása ​​és apoptózis indukálása.

Annak vizsgálatára, hogy RT és /vagy UA kezelés nem okoz semmiféle perturbáció a sejtciklus, elemzését BGC-823-vel kezelt sejtek 2Gy besugárzás és /vagy a 10 ng /ml-UA végeztünk. Relatív, hogy a kontroll csoport, 10 ng /ml-UA egyedül a kapott szinte nincs hatással a sejtciklus. Azonban a kombinált csoport UA és besugárzás által indukált sejtciklus a G _{1 fázis (51,87% vs. 60,28%, p = 0,13), és a G 2 /M fázisban (3,14% vs. 13,67%, p <0,01), mint a 2Gy besugárzás csoport (3A és 3C). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kombinált kezelés okozhatta G 1 fázisú és G 2 /M fázis leállását, ami több volt fogékony a káros sugárzás hatásait. A hasonló következtetéseket a sejtciklus adatok által bizonyított korábbi tanulmány. [15] katalógusa}

A kombináció UA és besugárzással is okozhat több apoptotikus sejthalált, amint azt 3B ábra. Az arány az apoptotikus sejtek jelentősen nőtt alkalmazása egyaránt UA és besugárzás BGC-823 sejtek szemben UA vagy IR-kezelés önmagában (78,2% vs 9,6% és 12,5%, p < 0,01 ábra 3D). Katalógusa

UA fokozott RT indukált ROS képződés katalógusa

széles körben elfogadott, hogy a sejtek pusztulását követően ionizáló sugárzásnak való kitettség részben közvetíti ROS. [16] ROS analízis DCF-DA termelt átlagos fluoreszcencia intenzitás (MFI), amely képviselt ROS szint az egyes csoportok (ábra 4A és 4B). K UA egyedül csoport, kizárólag RT-csoport és UA + RT-csoport nőtt 1,15-szeres, 1,53-szeres és 2,09-szeres, mint a kontroll csoportban. A szint ROS a kombinált csoportban jelentősen nőtt képest csak RT csoportba, felfedve, hogy hozzátéve UA RT indukálta több ROS képződés, mint a kizárólag RT. Katalógusa

Az immunhisztokémiai Ki-67 katalógusa

Ki -67 volt ismert, mint a nukleáris antigén, amely gyakran korrelál a sejtproliferációt. Kísérletünk kimutatható a pozitív arány a Ki-67 fehérje immunhisztokémiai festéssel, és az eredményeket ábrán látható 5. Százalék a Ki-67 pozitív sejtek a kombinált csoport jelentősen csökkent összehasonlítva a kontroll csoport, valamint a sugárterápia csoport .

Vita katalógusa

Ez a kutatás vizsgálta a hatásokat és lehetséges mechanizmusa UA mint radioszenzitizáló. Az MTT assay és klonogén túlélési vizsgálat bizonyította, hogy az infravörös kombinált UA jobb volt, mint a citotoxicitást IR egyedül. Ez a hatás megfigyelhető volt mindkét csoportban, különböző al-citotoxicitás koncentrációjú UA, 6.25ug /ml és 10 ng /ml volt. Ebben a dózisban, UA, hogy enyhén citotoxicitást humán adenokarcinóma gyomorrák sejtvonal BGC823 és nem volt jelentős citotoxikus a normál gyomor sejtvonal. [17] Ez azt bizonyítja, hogy UA volt ígéretes sugárérzékenyítés in vitro katalógusa.

Közép-rák sugárterápiás maximalizálása terápiás hatékonyságát a daganatos szövet, miközben minimalizálja a kárt a normál szövetek. Míg kidolgozott tervezés és a legutóbbi fizikai módszerek biztonságosan növeli a sugárdózis daganatos szövet, miközben csökkenti az adagot a környező ép szövetek, [18] jelenlegi besugárzási módszerek még mindig nem tudja sérülésének elkerülése közeli normál szövetekben. További radioterápiás előny lehet találni vizsgálatával biológiai válasz a tumor mikrokörnyezetében, hogy kiderüljön, hogyan lehet növelni a daganat érzékenységének a sugárzásnak vagy gátolja a mellékhatások által sugárzás. [19]

normál szövetek körül gyomorrák, mint például intesztinális és a gyomor, amelyek érzékenyek az ionizáló sugárzás. Ennek eredményeként, az ionizáló sugárzás dózisa felé tumorszövetben kell korlátozni. Sőt, az átlapolt mellékhatásai ionizáló sugárzás növeli a sugárkezelés mellékhatásokat, és még kezelés megszakításának. Sub-citotoxicitás koncentrációja UA kombinált ionizáló sugárzással, azonban fokozhatja a citotoxicitás ionizáló sugárzással, míg az alacsony koncentráció UA szinte ártalmatlan a normális szövetekben. Ez a stratégia növelheti a terápiás index, a daganat szövet növelése nélkül sugárdózis és sugárterápiás mellékhatása. Katalógusa

A mechanizmus azonosítása a radioszenzitizálása UA végeztünk elemzést több lépésben. Először is, elemeztük a sejtciklus eloszlása. Sub-citotoxicitási koncentráció UA nem hozott szignifikáns hatása a sejtciklus, míg össze az ionizáló sugárzást önmagában, a kombinált kezelés fokozott G _{2 /M letartóztatását. A sugárérzékenység sejtek korrelál a sejtciklus és a korrelációs magasabb a G 2 /M fázis és az alsó S fázisban. Ez lehet a legfontosabb oka a fokozott sugárérzékenyítés megfigyelt ebben a vizsgálatban. Másodszor, elemeztük a ROS szintet. A ROS szint a kombinációs csoport jelentősen nőtt összehasonlítva a kontroll csoportban a UA egyedül csoport, vagy akár az ionizáló sugárzás csoport. A túl UA ionizáló sugárzás okozta több ROS képződés. Ionizáló sugárzás által indukált a radiolízis a víz, ami generált ROS, mint például a hidroxil-gyökök és a szuperoxid. Ezek a ROS molekulák fontos szerepet játszott az ionizáló sugárzás által indukált celluláris elváltozások, így például az oxidatív DNS-károsodás, ami potenciálisan mind a klonogén halál és az apoptózist. Harmadszor, ebben a tanulmányban, azt találtuk, hogy a százalékos a Ki-67 pozitív sejtek a kombináció csoport jelentősen csökkent összehasonlítva a kontroll csoport, vagy a sugárkezelés-csoport. Ki-67 néven ismert sejtciklus asszociált antigén és egy hasznos proliferációs marker. Ki-67 fehérje szint korrelál a magasabb proliferációs és áttétek képességét. [20,21] katalógusa}

Végeredményben a jelen tanulmány az első kísérlet bizonyította, hogy UA lehetett kiegészít ionizáló sugárzással szembeni emberi gyomor rákos sejtvonalak . A mechanizmus a javított sugárérzékenyítés hatékonyságát lehet fokozni G2 /M letartóztatás, fokozott ROS és leszabályozott Ki-67 szinten. Közösen, UA bizonyított hatásos antiproliferatív hatás és szinergikus hatás, akkor lehetne használni, mint egy potenciális gyógyszer érzékenyítő alkalmazásának sugárkezelés. Azonban ez nem kétséges, hogy további kutatásokra van szükség, hogy értékelje a megvalósíthatóságát és előnyeit a hagyományos kínai orvoslás, mint sugárzásra, mielőtt a tényleges klinikai alkalmazásokba. További kísérletek és ismétlésben van szükség más tumor típusok és az állati kísérletek, hogy megerősítse a hatékonyságát a javasolt stratégia. Katalógusa

• PLoS One: a mikro-RNS-206: Hatékony gátlása Gyomorrák Progression keresztül c-Met útvonal
• PLoS One: klinikai jelentősége PMS1- metiláció és CpG Island metiláltsági fenotípus prognosztikai markerek gyomorrákos betegeknél