PLoS ONE: Enterococcus faecalis Infekcija uzrokuje upalu, intracelularne Oxphos neovisan ROS proizvodnje, te oštećenja DNA nastalih u ljudskom rak želuca Cells

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Achlorhydria uzrokovane npr atrofični gastritis omogućuje bakterijskog rasta, što uzrokuje kronične upale i oštećenja mukozne stanice zaražene osobe vožnje želudac malignih i rak. Enterococcus faecalis pregled ( E. Faecalis pregled) može kolonizirati achlohydric želudac i zbog toga smo htjeli proučiti utjecaj E. faecalis pregled infekcija na upalni odgovor, reaktivni metaboliti kisika (ROS) formacija, mitohondrijski respiratorni i mitohondrijske genetske stabilnosti u želučanim stanica sluznice. pregled

Metode pregled

Da bi se odvojile promjene izazvane bakterijama iz onima u upalnim stanicama smo uspostavili in vitro E. faecalis
infekcije Model sustava pomoću želučane linijske stanice karcinoma MKN74. Ukupna ROS i superoksida mjeri fluorescentnom mikroskopijom. Cellular potrošnja kisika bila je obilježena neinvazivno koristeći XF24 mikroploče na temelju respirometrom. Genska ekspresija je pregledao microarray i putevi odgovor su identificirani Gene Set Analiza (GSA). Odabranih gena transkripti su provjereno kvantitativnom realnom vremenu lančanom reakcijom polimeraze (PCR) QRT-. Mitohondrijske mutacije određuje sekvenciranje. Pregled

Rezultati pregled

Infekcija MKN74 stanica s E. faecalis pregled inducirana proizvodnja unutarstanični ROS kroz stazu, neovisno o oksidativne fosforilacije (oxphos). Nadalje, E. faecalis pregled infekcija izazvana mitohondrijsku DNA nestabilnost. Nakon infekcije, geni koji kodiraju upalne proteine ​​odgovor su transkripcijski doregulirani a DNA kontrole gena oštećenja popravak i staničnog ciklusa podregulirani. Rast stanica usporava kada zaražena održiv E. faecalis pregled i odgovorila na način ovisan o dozi do E. faecalis pregled lizat. pregled

Zaključci pregled

Infekcija s E. faecalis pregled inducirao oxphos neovisan unutarstanični ROS odgovor i oštetio mitohondrijskog genoma u kulturi želuca stanica. Konačno bakterije inducirao NF-kB upalni odgovor, kao i umanjena za oštećenje DNA odgovora i izraz kontrola gena staničnog ciklusa. Pregled

Transkript profiliranje pregled

Array Express pristupni broj e-MEXP-3496.

Izvor: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis pregled Infekcija uzrokuje upalu, unutarstanični Oxphos-Nezavisni ROS Proizvodnja i DNK oštećenja u raku stanica želuca. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147 pregled

Urednik: Shree Ram Singh, Nacionalni institut za rak, United States of America pregled

Primljeno: 28. kolovoz 2012; Prihvaćeno: 2. travnja 2013; Objavljeno: 30. travanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Financiranje:. AMDM je podržavaju zajedništvo iz portugalskog znanosti, tehnologije Foundation. LFH je podržan od strane danskog MRC. Udarcima je podržan od strane danskog društva za rak, a Sveučilište u Kopenhagenu sund. TMB i OW su podržani od strane grant od Novo Nordisk Zaklade za bioinformatiku centra. CD i LJR podržava Nordea-Fondena. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je među deset najčešćih oblika raka, a sa globalnom godišnjom stopom smrtnosti od oko 700.000, to je drugi najčešći uzrok smrtnosti od raka u svezi [1]. Crijevna vrsta raka želuca razvija kroz niz patoloških događaja počevši s kroničnom upalom, atrofičnog gastritisa, intestinalne metaplazije i konačno raka. [2] pregled

Kronična upala i rak povezan je u nekoliko studija bolesnika i genetski modificiranim miševima, te se vjeruje da je uključen u patogenezu od oko 25% svih slučajeva raka svijetu [2] - [4]. Karakteristike karcinoma povezanih upalom uključuju prisutnost kemokina i citokina u tumorskim tkivima, ima potencijal da stimuliraju proliferaciju tumorskih stanica i opstanak malignih stanica [5], [6]. Kronična upala je također favorizira hiperprodukciju oštećuju DNA reaktivnih vrsta kisika (ROS), čija je proizvodnja može biti u vezi s oksidativne fosforilacije (oxphos) reakcije u mitohondrijima (oxphos ovisna) ili proizvedena od izvan mitohondrija najčešće po nikotinamid adenin dinukleotid fosfata ( NADPH) oksidaze (oxphos-nezavisni) (za pregled vidi, [7] - [9]). Kronična proizvodnja oštećenja ROS uzrok DNA, čime se nakupljanje mutacija što zauzvrat može aktivirati onkogena i /ili onemogućili tumor supresor gena, čime se povećava rizik od razvoja raka. [3] pregled

Najčešći faktor rizika za razvoj rak želuca je kronična bakterijska infekcija želuca s Helicobacter pylori pregled ( H. pylori pregled) [10]. Kronična infekcija želuca s H. pylori
utječu na želučanu pH ravnotežu i može prouzročiti achlorhydria ili hyperchlorhydria [11]. Iako je ova bakterija je klasificiran kao klasa jednog kancerogen, to nije uvijek povezana s povećanim rizikom od razvoja raka želuca. Na primjer, H. pylori
zaraženi pacijenti s dvanaesnika i visoke razine želučane kiseline imaju smanjen rizik od razvoja raka želuca u odnosu na one iz opće populacije [11] - [13]. Nasuprot tome, bolesnici s atrofični gastritis i smanjenog izlučivanja želučane kiseline imaju povećan rizik od razvoja želučanog raka [11], [13], [14]. Povećani rizik za rak u achlorhydric pojedinaca moglo biti zbog bakterijskog rasta ostalih bakterija u lumenu želuca [15]. U oba achlorhydric ljudi i kod životinja bakterijski rast uzrok kronični gastritis koji se razvija u intestinalne metaplazije i na kraju rak želuca [16] - [18]. Među bakterija u želucu achlorhydric miševa bili su enterokoka pregled vrsta, koje su gram-pozitivne koka u mogućnosti da opstane u sredinama sa pH kao niska kao i 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis pregled ( E. Faecalis pregled) član ljudske komenzalnih mikrobiota i jedan je od najčešćih bakterija u probavnom sustavu [19]. Unatoč tome, E. faecalis pregled može djelovati kao ljudski patogen [21], a utvrđeno je značajno povećan broj u oralnim kancerogenih lezija i humanih karcinoma debelog crijeva [22], [23]. U odnosu na ovu E. faecalis pregled je u stanju proizvoditi N-nitrozamina i inducirati genetske nestabilnosti u epitelnih stanica kolona kroz oksidativnog oštećenja DNA [24], [25]. pregled

Gastritis je povezana s infiltracijom imunoloških stanica u tkiva, što otežava secirati djelovanje imunoloških stanica iz koje sluznice stanica sluznice in vivo pregled. Stoga su koristili in vitro
modela iz kulture tkiva koja nam je omogućilo da ispita kako izolirani mukozne stanice odgovaraju na bakterije i molekularnih mehanizama kojima crijevne bakterije, kao što su E. faecalis
izazvati oštećenja u želučanog epitela. Koristeći ovaj model ispitali smo utjecaj E. faecalis pregled infekcije želuca kulturama stanica adenokarcinoma o proizvodnji ROS, staničnog disanja, rast, DNA oštećenja /popravak i upalnih reakcija. pregled

materijali i postupci

Kultura stanica, E. faecalis pregled i uvjetima rasta

Ljudski MKN74 želučanog adenokarcinoma stanične kulture iz japanske zbirke Research Bioresources banke stanica (JCRB # JCRB0255) su održavane u 1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml streptomicina i 100 u /ml penicilina (Invitrogen) na 37 ° C i 5% CO _{2 vlažnoj atmosferi. Infekcije su provedeni s E. faecalis pregled soj (ATCC 29212). Bakterije su rasle su u 5% krvnom agaru pločama na 37 ° C. Optička gustoća (OD) za bakterije uzgajaju u RPMI 1640 mediju bio je izmjeren na 550 nm na UV-1601 spektrofotometra (Shimadzu, Kyoto, Japan) (Slika S1). E. faecalis pregled lizat je pripremio smrzavanja /odmrzavanja bakterijskom suspenzijom tri puta, dok ultrazvuka suspenzije između svakog ciklusa. pregled}

Infekcija stanica želuca za izolaciju RNA i DNA

Za 24 h infekcija 80% konfluentni MKN74 stanice su isprane s PBS-om i inkubiraju na antibiotike mediju. Preko noći odrastao kolonije E. faecalis pregled dodani su kulturi MKN74 stanica pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 50 bakterija po stanici. 5 dana infekcije se provodi tretiranjem 65% spojeno MKN74 stanica s E. faecalis pregled na moi od 10 ili s koncentracijom proteina od lizat 40 ug /ul. Svaka 24 sata, stanice su isprane s PBS-om i svježi medij i doda se bakterije ili lizat. Kontrolne stanice su obrađene na sličan način u odsutnosti bakterije ili bakterijskog lizata. In vitro
studije su provedena pomoću želučane stanica raka liniju za testiranje štetan učinak E. faecalis pregled na želučanih stanica adenokarcinoma. Te stanice se razlikuju od normalnih epitelnih stanica želučane noseći nekoliko kromosomske aberacije, ali nude prednost što je ponovljiva model sustava koji u mnogočemu replicira događaji koji se zbivaju u želucu. Uspoređivanje inficirane stanice na neinficirane stanice daje pouzdanu sliku oštećenja i promjene u ekspresiji gena uzrokovane infekcijom, pregled izolacija

RNA i DNA pregled

Nakon infekcije, RNA i DNA su ekstrahirani dodavanjem Trizol reagens (Invitrogen) u svaku tikvicu za kulturu. RNA je izolirana prema proizvođača protokol. Intermedijer faza sadržava DNA se istaloži dodavanjem 100% etanola. Uzorci su centrifugirani na 4 ° C, 3500 g, tijekom 6 minuta. Fenol-etanola supernatant se ukloni, a preostali ekstrakcija DNA je učinjeno pomoću NucleoSpin tkiva priborom (Macherey-Nagel, Düren, Njemačka). RNA i DNA koncentracije bile su mjerene na NanoDrop ND-1000 spektrofotometar. RNA brojevi integriteta mjereni su na 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California) prema proizvođača protokol. Pregled

Mjerenje ROS i superoksida pregled

Dva dana prije infekcije 8 × 10 ^{4 MKN74 stanice su smještene u svaku jažicu na Lab-Tek TM komore Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 stanice su obojene tijekom dva sata prije infekcije 2 plex smjese za detekciju. ROS i superoksid bojenje je izvedena pomoću ROS /Detection Kit RNS (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) prema proizvođača upute. MKN74 stanice su zaražene MOI od 50 tijekom 30 minuta i analizirani pod Zeiss LSM 510 konfokalne mikroskopom pomoću softvera LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Njemačka). Nezaraženih obojeni MKN74 stanice su korišteni kao negativna kontrola. Pregled}

Lokacija E. faecalis pregled tijekom infekcije pregled

8 × 10 ^{4 MKN74 stanica /dobro su posađene u 8-komorna staklenim dnom tobogan (Thermo Fisher Scientific) 24 sata prije bojanja. Kako bi se identificirali lokalizacije E. faecalis pregled nakon infekcije mi posebno obojeni plazma membranu s CellMask TM Deep Red plazma membrana mrlja (C10046, Invitrogen) i stanične stijenke bakterija pomoću BacLight TM Green bakterijska mrlja (B-35000, Molecular probe, invitrogen) prema dva protokola respektivno. Stanice i bakterije su isprane 3 puta u PBS-u prije infekcije. Stanice su inficirane na MOI od 100 4 sata i analizirani Zeiss LSK 510 konfokalnom mikroskopu koristeći softver LSM 510 (Zeiss). Ovaj eksperiment je ponovljen tri puta i 8 champers ispitani su svaki put. Pregled}

XF24 Microplate temelji respirometrom pregled

respirometrom od MKN74 stanica je provedeno pomoću XF24 izvanstanične Flux Analyzer (Morski konjic biomedicine, North Billerica, MA ). Polovica stavljene MKN74 stanice inficirane su s E. faecalis pregled na MOI od 50 tijekom 4, 8 ili 24 sata, dok je druga polovica je ostale neinficirane. Nakon inkubacije, bakterije su uklonjene primjenom 4% penicilin /streptomicin (5 U /ml), te 4% cefotaksim (100 ug /ml) (ACS Dobfar generičkog S. A., Luksemburg, Belgija). Stanice su inkubirane u CO _{2 slobodna inkubator na 37 ° C tijekom 1 sata kako bi se temperature i pH uravnoteže. Mikroploča sa stanicama se zatim stavi u XF24 i stopa potrošnje kisika svakoj jažici mjerena je tijekom 100 minuta. Lijekovi oligomycin (0,5 uM), FCCP (0.3 | iM) i antimycin A (2,0 uM) u red dodano u svaku jažicu. Više detalja su dostupne u Datoteke S1. Pregled}

mitohondrijske DNA Nestabilnost pregled

Učestalost mutacija u D-petlje mitohondrijske DNA, određene su pomoću PCR amplifikacije uz korištenje primara C6-CA5 (tablica S1 ). Amplificirani fragmenti klonirani su u pCR2.1 vektora (Invitrogen) i umeci od 328 kolonija je amplificirana upotrebom primera VectorD-petlja (Tablica S1). Amplificirani fragmenti su pročišćeni i sekvencirane koristeći ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit i ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Da bi se odredilo mutacije, sekvence su korišteni kao upite protiv Cambridge referentne sekvence dobivene iz MitoMap (http://www.mitomap.org. Pogledana veljače 9. 2012.). Pregled

Microarray i GSA pregled

RNA s integritetom RNA broj 8 ili noviji od tri kontrole i tri uzorka infekcija (uz održiv E. faecalis pregled ili E. faecalis pregled lizat 40 ug /ul) 24 sat i 5 dana eksperimenti su dostaviti u RH microarray Center na sveučilišne bolnice u Kopenhagenu. RNA je pojačan i označen pomoću 3 'IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) u skladu s proizvodnjom upute. 250 ng ukupno RNA korištena je kao ulaz. Obilježeni su uzorci hibridizirana GeneChip genoma U133 plus 2 polja (Affymetrix). Nizovi su isprane i obojene s phycoerytrin streptavidinom konjugiranim upotrebom Affymetrix protokom Station® 450, i nizovi su skenirane na Affymetrix GeneArray® 2500 skener za generiranje fluorescentnih slika, kao što je opisano u Affymetrix GeneChip® protokola. 24 intenziteta stanica datoteke RAW (Cel-datoteke) ostvareni su u GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). Neobrađeni Cel-datoteke su javno dostupni na ArrayExpress s brojem za pristup e-MEXP-3496. Predobrada od microarrays za gen set analize (GSA) je učinio s R /Bioconductor [26], [27]. Prilagodba Pozadina, kvantilnih normalizacija i završno sažimanje sonda postavljena izraz intenzitete je izvela GCRMA algoritma [28] za svako eksperimentalno stanje, odvojeno (File S2). pregled

Kvantitativna Reverse transkripcije PCR pregled

cDNA sintetizira eksponent III Prvo dvolančanih sinteza Mix za qPCR (Invitrogen). ekspresije gena je analizirana QRT-PCR pomoću SYBR zelenija q-PCR SuperMix na ABI PRISM (Invitrogen). Klice su konstruirane pomoću Primer-Blast softver iz NCBI [29]. Reakcije su provedene na sustavu ABI PRISM 7900HT Sequence Detection (SDS) od Applied Biosystems. Podaci su normalizirani na ekspresiju GAPDH mRNA. Pregled

pokus rasta pregled

8000 stanica raspodijeljeno u svaku jažicu šest 24 jažica i inkubirane na 37 ° C i 5% CO _{2 za dva dana prije liječenja. Stanice su tretirane u kvadruplikatima kako slijedi; 4 čašice nezaražene kontrolnih stanica, 4 bunara tretirana s 400 ug /ul E. faecalis pregled lizat, 4 bunara liječeni 40μg /ul lizat, 4 bunara liječeni 4 ug /ul lizat i 4 bunara liječenih održiv E. faecalis pregled na moi od 10. Jedan ploče stanica fiksirana svaki dan. Fiksiranje je učinjeno ispiranjem s PBS i fiksacijsku s 1 ml 10% formalinu tijekom 10 minuta. Vežu stanice su obojene s 1 ml 0,1% kristalno ljubičastog (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) i pločice su mućkane tijekom 30 minuta. Stanice se ispere, osuši i kristal violetom se ekstrahira s 500 ul 10% octene kiseline. Apsorbancija je mjerena na 620 nm na PowerWave XS (BioTek instrumenata, Winooski, Vermont). Pregled}

Statistička analiza pregled

Jedna klasifikacija analiza varijance (ANOVA) korišten je za testiranje razlika u maksimalnoj dišnog kapaciteta ATP promet i oxphos neovisan potrošnju kisika. ANOVA se nadalje koristio za testiranje razlike u rastu stanica tijekom različitih tretmana s E. faecalis pregled. Kada je ANOVA pokazala značajne razlike među tretmanima, Tukeys iskreno značajan postupak se koristi za testiranje razlika između stope potrošnje kisika ili broj stanica. mtDNA mutacija frekvencije su ocijenjeni od strane hi-kvadrat i Fisher-ovog točnog testa. ROS Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost najmanje dvadeset nezavisna mjerenja i analiziran nesparenoj dvokrakog t pregled -test. Rezultati QRT-PCR su izraženi kao srednja vrijednost najmanje tri neovisna eksperimenta izmjerene u tri tehničkim ponavljanja, i analiziran nesparenoj dvokrakog t pregled -test. Razlike između skupova podataka su smatrane značajne na P vrijednosti ≤0.05. Stupci pogrešaka = ± SEM, osim ako nije drugačije naznačeno. pregled

Identifikacija reguliranih puteva je učinio GSA metode, GAGE ​​[30], poboljšane iskoristiti dostupne informacije indukcija-represije (za opsežne podatke i izračune vidi File S2). Staze su predstavljena lista gena (genske skupova) skinuti s Molekularna Potpisi baze podataka (MSigDB) 3.0 [31]. C2 skup biranim setova gena (kanonske putevima i ekspresije gena potpisa genetskim i kemijskim perturbacija) pomoću genske simbole identifikatore. Gene set p-vrijednosti su korigirane za multiplu ispitivanje procjenjujući stopu lažnih otkriće i razinu značajnosti postavljena je na 1%. Pregled

Rezultati pregled

E. faecalis pregled infekcije izazivaju unutarstanični ROS i superoksid proizvodnja pregled

ostalo i što smo ranije pokazali da je achlorhydric gastrin KO miš je imao bakterijskog bujanja s enterokoka pregled koji se obično nisu dio želučane flore [ ,,,0],20]. Iako enterokoka pregled općenito se smatra da su niske patogenosti, zadobio rastinje u achlorhydric miševa povezana s upalnim odgovorom i na kraju ti miševi razvijaju rak želuca [20], [32]. Za karakterizaciju patološki proces unutar stanica želuca ispitane kako je bakterija pod utjecajem želučanog epitela. Pomoću sondi praćenje unutarstanični proizvodnju Ros, otkrili smo da 30 minuta infekcije stimulirana značajan porast intracelularne ROS formacije (Slika 1A). Sa sondama specifičnim za proizvodnju superoksida pokazali smo da ROS uglavnom sastojao od superoksida u MKN74 stanica (Slika 1A). Intenzitet fluorescencije se kvantificira korištenjem softvera LSM 510 i statistički značajan porast u intracelularnom ROS i superoksida u zaraženim stanicama u odnosu na neinficirane kontrolnih stanica uočeno (Slika 1B). Našli smo dokaze da predloženi invaziju stanica bakterije pa smo zaključili da je intracelularni ROS je proizveden od strane zaraženih stanica, a ne internalizira E. faecalis pregled (Slika 1 C-D). pregled

infekcija smanjuje mitohondrijsku aktivnost i povećava oxphos neovisan potrošnje kisika

Izvor ROS pronađen nakon bakterijske infekcije ili mogao biti generiran izvanstanične bakterija [33] i /ili proizvedena iz stanica [34], [35]. Intracelularni ROS ili se mogu proizvesti u oxphos ovisan ili neovisan način. Kako ispitati i nakon toga karakteriziraju mogući unutarstanični produkciju ROS povezan s E. faecalis pregled infekcije; izmjerili smo kako je bakterijska infekcija utječe na mitohondrijsku disanje mjerenjem ATP promet, respiratorni kapacitet i oxphos neovisan potrošnju kisika (slika 2). Da se osigura da rezultati odražavaju disanje samo MKN74 stanice, sve bakterije su uklonjene prije mjerenja. Nije bilo značajne razlike u ATP prometu kontrolnih stanica uzgojenih na 4-24 sata, a značajan 2 i 4 smanjenja strukim (p < 0.001) ATP prometu bili prisutni na kontrolne stanice i inficirane stanice inkubirane 8 i 24 sata redom (Slika 2). Odgovarajući korelacija je nađena u respiratornom kapaciteta, gdje su i kapaciteti inficiranih stanica značajno 2- i 4 puta manji (p 0,01) u usporedbi s kontrolnim stanicama nakon 8 i 24 sata nakon infekcije (Slika 2B). Oxphos neovisan potrošnja kisika od kontrolnih stanica bila je nepromijenjena na stanicama koje su rasle kroz 4-24 sati. Naprotiv, oxphos neovisno potrošnja kisika od stanica zaraženih bakterijama povećao sa -50% od ukupnog unosa kisika nakon 4 sata infekcije postati primarni utilizatora kisik (p < 0.001) (Slika 2C). To upućuje na zaključak da je E. faecalis pregled interakciju s epitelnim stanicama induciranim stvaranja ROS i potrošnju kisika od ostalih unutarstanični enzimskih sustava od oksidativne fosforilacije. Izraz NOX1-5 i Duox1-2 je ispitana u liniji stanica želučane; Međutim, izraz nije bio pod utjecajem infekcije (Tablica S2). pregled

E. faecalis pregled infekcija uzrokovana mitohondrijska DNA nestabilnost pregled

Mi smo ranije pokazali da infekcija patogenim H. pylori pregled sojevi inducirane mutacije u mitohondrijskog genoma u kulturi stanica humanog [36]. S obzirom da je infekcija s E. faecalis
povećanje intracelularne ROS smo ispitali je li to također izazvao genomske mtDNA nestabilnost. Ukupna učestalost mitohondrijska D-loop regije mutacije bila je značajno viša u MKN74 kulturama stanica zaraženih E. faecalis pregled (45,5%) u odnosu na ne-inficiranim kontrolnim kulturama stanica (23,0%; p < 0.01) (Slika 3). Nadalje, inficirane stanice pokazuju veći broj prijelaza (36.4%) od kontrolnih stanica (21,8%, p < 0.05). Delecije (0% kontrola /3,9% inficirane), insercije (1,1% kontrola /2,6% inficirane) i transversions (0% kontrola /2,6% inficiranih), potonji se obično vidi kao posljedica ROS, češće su otkrivene u inficirane Stanice. Tako je infekcija s E. faecalis pregled uzrokuje mutacije u želučanih stanica (Slika 3). pregled

Infekcija zavede NFκB dominira upalni odgovor i ROS odgovor pregled

Da bi dobio dodatnu biološku uvid u stanične odgovore na stanica želuca u E. faecalis pregled infekcija smo proveli analizu microarray uvidom u globalne promjene u ekspresiji gena u stanicama inficiranim održiv E. faecalis pregled ili tretirani s E. faecalis pregled lizat. Umjesto da se usredotoči na ekspresiju pojedinih gena koje smo upotrijebili GSA [30] identificirati puta i postupke aktiviraju ili inhibiraju infekcije. Fokusirajući se na skupine gena umjesto pojedinačnih gena povećava robusnost, osjetljivost i biološku relevantnost i za umjereno reguliranim skupine gena. To se postiže jačanje omjer signala i šuma, što je moguće interpretirati skromne promjene u pojedinim genima [37]. GSA testirani 2403 kompleta gena i rezultiralo 484 uređeni putevi se statistički značajno za bilo živih infekcija i /ili se lizat podražaja (Slika S2). Fokusirajući se na tim putevima statistički značajnih za live infekcije, neki od setova gena prosude bi najbolje opisali trenutnu studiju ručno su podijeljeni u tri skupine (slike 4, 5 A i 6 A). Razmatrajući upale i ROS, E. faecalis pregled infekcija uzrokuje značajno doreguliranje nekoliko puteva koji su uključeni u imune odgovore, uključujući grozdovi kemokin receptora i kemokina signaliziranje gena, gena koji sudjeluju u G-protein vezanog liganda receptora vezivanja i NFκB aktiviranjem gena (Slika 4, gornji šest setovi gena). Osim dva gena kompleta koji sadrže gene reagirati na pro-upalnih oksidiranih fosfolipidi su snažno regulira prema gore. Oksidirani fosfolipidi su proizvodi ROS i funkcije u pro-upalne način [38], [39] (slika 4, gen postaviti sedam i osam). Potpora prisutnost ROS, gen set od 30 gena koji se izražava kao odgovor na ROS je aktivirana (Slika 4, donji gen set). Poznato je da su važni za ROS lipopolisaharida (LPS) -driven proizvodnju nekoliko upalnih citokina [40], međutim, gram-pozitivne bakterije kao što su E. faecalis pregled ne izražavaju LPS. Stoga smo ispitali kako je ekspresija individualnih gena koji kodiraju pro-upalnih citokina i kemokina su izvedena kao odgovor na ne-stimuliranim LPS infekciju tijekom 24 sata i 5 dana infekcije (Tablica 1). Brojni geni uključeni u upalnom NFκB puta bili značajno je povećana za vrijeme E. faecalis pregled infekcija, uključujući interleukin-1B (IL-1ß), interleukin-1 receptor kinaze povezane s 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, i faktora tumorske nekroze-α (TNF α), većina kojih se može dalje širiti na NF-kB aktivaciju odgovor [41] - [44]. Među njima je bilo nekoliko citokina prethodno identificirane u H. pylori
posredovanih infekcija, kao što su IL-8 i vaskularni endotelni faktora rasta (VEGF), i koji je povezan s angiogenezom i s uznapredovalim rakom želuca, IL-1ß koji je snažan inhibitor lučenja kiseline, a također i TNF-a, A regulator stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze [43] - [45]. Osim toga, citokin IL-23α koja promovira incidenciju tumora i rast [46] i vrlo je proizveden u H. pylori pregled koloniziraju sluznicu [47] bilo doregulirani uz, IL-11, što je stanica tjemeni citokin koji blokira lučenje želučane kiseline, potiče atrofičnog gastritisa i želučanog tumorigenesis [48], [49]. Među ostalim genima naći za prikaz visoke i značajne izražajnu razinu tijekom infekcije su IL-1α, IL-32, faktor diferencijacije rasta 15 (GDF15) i kemokina (C-motiv) ligand 22 (CCL22). Osim toga, doreguliranjem superoksid dismutaza 2 (SOD2), koji se pretvara superoksida do vodikovog peroksida, vidljiva. IL-8, interferona regulatorni faktor 1 (IRF-1) i TNFa su potvrđene od strane QRT-PCR (Slika 4 B). Pregled

oštećenja popravak DNA se uređuju u E. faecalis pregled infekcija pregled

Analiza put pokazuje da je ekspresija gena koji sudjeluju u popravka oštećenja DNA bila je značajno podregulirani u odnosu na neinficirane stanične kulture, nakon 24 sata od infekcije (slika 5A). QRT-PCR je potvrdio da je izraz (MMR) gena nekoliko mismatch popravak podregulirani oboje nakon 24 sati i 5 dana E. faecalis pregled infekcije (slika 5, B). 24 sata inficirane stanice PMS1 i MSH6 bila značajno podregulirani (4 puta i 1,8 struko, odnosno P 0,001). Značajan podreguliranjem MSH2 (3 puta), MSH3 (1.9 puta), MSH6 (2 puta) i PMS1 (3 puta) (p 0,05) (slika 5, B) uočeno je u stanicama 5 dana nakon infekcije. Izražajnu preklopive promjene odabranih DNA oštećenja popravka gena nakon infekcije prikazane su u tablici S3. Ovi rezultati ukazuju na to da E. faecalis pregled infekcija regulira prema dolje glavne popravka DNK puteve koji ostvaruju genomske nestabilnosti sličan infekcija s H. pylori pregled [36], [50], [51]. pregled

Infekcija s E. faecalis pregled inhibira kontrolu staničnog ciklusa i rast MKN74 stanica pregled

za vrednovanje promjena u rastu stanica izazvana E. faecalis pregled infekcije, istražili smo utjecaj bakterija na ekspresiju gena za kontrolu staničnog ciklusa i na rast MKN74 stanica. Genski skupovi koji sadrže kontroli staničnog ciklusa i kontrolnu točku geni podregulirani nakon 24 sata od infekcije s bakterija sposobnih za život sugerira značajnu usporavanje u proliferaciju stanica, ali i povećan rizik od mutacija u novih stanica (slika 6A). Nasuprot tome, ovi putovi doregulirani u stanicama inficiranim bakterijski lizat sugerira da su ove stanice dalje dijeljenjem nakon 24 sata (Slika 6A). Mi smo sljedeći mjeriti proliferaciju stanica 5 dana i utvrdili da izvediv bakterije uzrokuju širenje MKN74 stanica usporiti ili zaustaviti u potpunosti (slika 6 B). Staničnaproliferacija su također pogođeni kada se inkubira s bakterijskom lizat. Nakon 24 sata, stanice se lizat pomiješa se dalje dijeljenjem (kako je prikazano na slici 6A) i dok 4. dana nije bilo razlike između neinficirane stanice i stanice zaražene lizata. Međutim, na dan 4 bilo je značajno manje stanica nakon inkubacije s bakterijskog lizata u odnosu na neinficirane kontrolnim stanicama. Na dan 5 uočeno je odnos doza-odgovor između koncentracije lizata i rast stanica (slika 6B), što pokazuje da i infekcije E. faecalis
ometa rast stanica. Sličan rezultat je primijećeno u ljudskim limfocitima u kojem su tri dana inkubacije s E. faecalis pregled lizat izazvanog staničnog ciklusa [52]. Kao što je ovaj posao bio završen u izoliranom sustavu, smanjuje proliferaciju inficiranih stanica može se pripisati nedostatku stimulacije faktora rasta odgovorom imunološke stanice. Pregled

Rasprava

mikrobiološki uzročnici Procjenjuje se da će izazvati oko 1,2 milijuna slučajeva raka svake godine. [5] Studije na ljudima i nekoliko životinjskih modela pokazala da achlorhydria omogućuje bakterijskog rasta u želucu, što može uzrokovati želučane kronične upale, koja se razvija u rakom želuca [20], [53], [54]. Potpora etiološki ulogu drugih bakterija u želučanog malignoma su iskorjenjivanja studije H. pylori pregled infekcija koje omogućuju želučane kolonizacije crijevnih bakterija [55], a nakon toga želuca razvoj raka [56]. To upućuje na zaključak da ostali igrači od H. pylori pregled mogu biti uključeni u upalnim potaknut želučane malignih bolesti. Molekularni događaji po kojima kronične želučane infekcije tih bakterija utječu na stanice raka i uzrokovati oštećenja tih stanica je slabo razumio. Pregled

Otkrili smo da je infekcija s E. faecalis pregled izazvana unutarstanični proizvodnju ROS. Oksidativna fosforilacija mitohondrijima bila je niska nakon infekcije, što pokazuje da ROS proizvodnja uglavnom je generirana u oxphos neovisan način u zaraženim stanicama. Unutarstanični oxphos neovisan ROS se mogu proizvesti u epitelnim stanicama ne-fagocitozna NADPH (NOx), oksidaze, kao odgovor na pr Stimulacija citokina [57], a glavni su non-mitohondrijske izvori ROS [58]. To NOX enzimi prijevoza elektrona kroz staničnu membranu, koja stvara superoksida i drugih ROS [59]. U ljudskim stanicama epitela nalaze se dvije NOX homologus (NOX2 i NOX5) [60]. U našoj studiji ti enzimi nisu bili za prepisivanje regulira prema gore, no to se ne može isključiti mogućnost da su povišene razine ROS je posljedica aktivacije tih enzima, iako je to potrebno dodatno istražiti.