PLoS ONE: Mir-29a Koči staničnu proliferaciju i inducira staničnog ciklusa kroz silazni p42.3 u ljudske želučane Cancer

Sažetak pregled

Kao novo identificirani i karakterizirani gena, p42.3 je povezana sa stanicom proliferacija i torn smjeru. Ekspresija p42.3 je reguliran u ljudskoj raka želuca (GC), ali njegov temeljni mehanizam djelovanja, nisu jasni. MikroRNA (miRNAs) poznati su da imaju vitalnu ulogu u mnogim regulatorne staničnih procesa. Ovdje smo iskoristili bioinformatika i eksperimentalni pristup istražiti regulatorni odnos između miRNAs i gena p42.3. Pokazali smo da je Mir-29a mogao potisnuti izraz p42.3 kako na mRNA i proteina putem direktno vežu na njegov 3'UTR. Nadalje, inverzni odnos između dobivenog Mir-29a i p42.3 izražavanja u želučanim staničnim linijama karcinoma i uzoraka GC tkiva, posebno u slučajevima kada je regulirani p42.3. Uzeti zajedno, mi smo razjašnjen prethodno nepriznate uloge Mir-29a i ukazao da Mir-29a može funkcionirati, barem djelomično, ciljajući gen p42.3 u ljudskom GC pregled

Izvor:. Cui Y Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) Mir-29a Koči staničnu proliferaciju i inducira staničnog ciklusa kroz silazni p42.3 u ljudskim karcinoma želuca. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872 pregled

Urednik: Alfons Navarro, Sveučilište u Barceloni, Španjolska pregled

Primljeno: 28 veljača 2011; Prihvaćeno: 13. rujna 2011; Objavljeno: 5. listopada 2011 pregled

Copyright: © 2011 Cui i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane potpore iz Nacionalnog Basic Research programa Kine 973 programa (2010CB5293, Nacionalni Visoka tehnološka istraživanja i razvoj programa Kine (863 programa) (2006AA02A402, Nacionalna zaklada Prirodoslovlje Key programa (br 30830055) i Ministarstva . za javno zdravstvo, Kina (br 200802094) da FJY se donatori imali nikakvu ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, odluka o objavi, ili pripremu rukopisa

suprotstavljenih interesa. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi. pregled

Uvod pregled

p42.3 je novi gen koji je nedavno bio izoliran i identificiran od strane mRNA diferencijalne prikaz tehnika (mRNADD). kompletne dužine cDNA p42 .3 je oko 4,0 kb, i gen kodira 389 amino kiselina (aa), protein koji se procjenjuje da ima molekulsku masu od 42.3 kDa. Daljnja istraživanja su pokazala da je njen izraz staničnog ciklusa ovisna u rak želuca (GC) staničnim linijama. Njegovi proteinski ekspresijski vršne tijekom M faze staničnog ciklusa, prije postupno smanjuje nakon diobe stanica; to znači da p42.3 mogu biti uključeni u regulaciji staničnog ciklusa. Nadalje, odsutnost p42.3 malim smetaju RNA (siRNA) rezultira u povećanju CHK2 i smanjenom ciklina B1, koji su dva ključna proteina koji sudjeluju u regulaciji staničnog ciklusa [1], [2]. A RT-PCR i imunohistokemijske analize pokazuju da p42.3 je reguliran u GC usporedbi s uzorcima normalnih tkiva funkcionalna istraživanja su pokazala da je došlo do ispražnjenja p42.3 ne samo da može uzrokovati inhibiciju proliferacije GC stanica i formiranja kolonija in vitro pregled, ali može značajno smanjiti torn smjeru na miševe [3]. Iako su prethodne studije predložili ključnu ulogu gena p42.3 u patologiji GC, posebne temeljne mehanizme njegovog djelovanja tek treba razjasniti.

mikroRNA (miRNAs) sastoje se od klasi malih (~ 22 nukleotida), endogeni, nekodirajući RNA koje se zna da igraju važnu regulatornu ulogu u ekspresiji gena. [4] Primarni Mirna transkript naziva pri-MIRNA [5], koji je prepisao RNA polimeraze II ili III [6], [7]. PRI-Mirna zatim cijepa na Drosha-DGCR8 mikroprocesor kompleksa za proizvodnju prethodnik ukosnica molekule (pre-Mirne), koji potom izvozi iz jezgre u citoplazmu by exportin-5 /Ran-GTP. Uz pomoć kompleksa koji sadrži RNA-ze kockar i RNA-binding protein dvostruke uzvojnice, TRBP je ~70-nukleotida pre-Mirna prerađuje u zrelim Mirna [8]. Funkcionalna nit zrelog Mirna učita u RNK-inducirana utišavanje kompleks (RISC), koji sadrži proteine, argonaute (prije) i Tnrc6, dok je druga nit se obično razgrađuje [9]. Zrela Mirna vodi RISC na nesavršene komplementarne sekvence u ciljanim mRNA potisnuti srodnu mRNA prijevod, promicati prijepis propadanje, ili oboje [10]. Procjenjuje se da je većina geni koji kodiraju vjerojatno su regulirani miRNAs i, mada se Mirna mogu regulirati više od jedne ciljne gene, neki geni mogu regulirati više miRNAs [11]. Pregled

Uzgoj dokazi pokazuju da su miRNAs uključeni u širokom rasponu fizioloških i patoloških procesa, uključujući razvoj, diferencijaciju, proliferaciju i apoptozu [12.13,14,15]. Iako abnormalnosti Mirna izraza su utvrđene u mnogim ljudskim tumorima, uključujući i debelog crijeva, želuca i raka dojke [16], [17], broj takvih tumora i dalje se širi. Međutim, detaljna funkcije Mirne tumora tek treba razjasniti. Pregled

Nedavna istraživanja pokazuju da je Mir-29 ima složene funkcije u različitim bolestima. Mir-29a se može ponašati kao tumor-supresor u oba pluća i staničnim linijama raka gušterače, a time i egzogeni prekomjerna ekspresija rezultira miR-29a do značajnog smanjenja u invazivni potencijal i proliferaciju tih staničnih linija [18]. Tumor supresor uloga Mir-29a također podržan od strane motrenom smanjenom u širokom spektru solidnih tumora, uključujući neuroblastoma, sarkoma i tumora na mozgu [19]. Nasuprot tome, miR-29a je reguliran u indolentnu humani kronična limfocitna leukemija (CLL), B-[20] i akutne mijeloidne leukemije (AML) [21], što sugerira moguću ulogu tumor promoter. Osim toga, nenormalna ekspresija Mir-29a mogu se naći u mnogim ne-malignih bolesti, uključujući fibrozu jetre, [22], dijabetes [23] i Alzheimerove bolesti [24]. Iako su mnogi geni već su potvrdili da su izravni ciljevi Mir-29a, poput PPM1D [25], PI3K [26] i neuronske navigator 3 [24], oni predstavljaju vrlo mali dio ukupnih gena koji Mir-29a ciljevi. pregled

u ovom izvještaju, možemo pokazati da p42.3 ekspresija je bila pod kontrolom na razini i mRNA i proteina Mir-29a putem izravnog ciljanja 3'UTR p42.3. Mir-29a mogao potisnuti proliferaciju stanica i inducirati prekid staničnog ciklusa, barem djelomično, putem silazni p42.3 izražavanja. Osim toga, otkrili smo da je izraz p42.3 proteina obrnuto je povezana s izrazom Mir-29a u ljudskim GC tkiva. Pregled

Rezultati

p42.3-3'UTR je navodno na meti MIR analizirani su -29a pregled

pretpostavljenim miRNAs koji su bili predviđeni za cilj gen p42.3 za više od jedne baze podataka. Gornja dva miRNAs koji su predviđeni za tri puta su odabrani za daljnje potvrde i ostale tri miRNAs, uključujući i Mir-29a, čiji je navodni veznih mjesta su blizu onima u prva dva i odabrani su kao kandidati za validaciju. Mir-29a je bio predviđen za TargetScan i miRGEN bazama podataka, što ukazuje da je njegov navodni vezanja bio na pozicijama 213-219 od p42.3-3'UTR (Slika 1A). Ostali kandidati nisu navedene ovdje. Pregled

Izravno ciljaju p42.3-3'UTR od Mir-29a pregled

Test gen reporter je bio zaposlen za provjeru je li p42.3 bio izravan meta Mir-29a. Divljeg tipa i mutanta p42.3-3'UTR sadrži pretpostavljenu vezno mjesto Mir-29a klonirani su u pojedinačne plazmidi i spoje s reporter gen. Fluorescentni intenzitet reporter-gena znatno smanjena u skupini koja je kotransfeciran sa WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 i pcDNA3.1 /pri-Mir-29a u odnosu na kontrolu. Osim toga, nije bilo značajnijeg pada fluorescentnog intenziteta u skupini koja je istovremeno transfektirana MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Slika 1B), što dodatno potvrđuje da je Mir-29a inducira downregulation izražavanja p42.3 gena putem specifičnog vezanja potencijalnog mjestu p42.3-3'UTR. pregled

Izražavanje Mir-29a i p42.3 obrnuto srazmjerne u staničnim linijama GC

Da bi se ustanovilo vezu između p42 0,3 i Mir-29a, proučavali smo endogene izraz Mir-29a i p42.3 u šest ljudskih GC staničnih linija (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 i AGS) i jedan normalni epitel želuca stanična linija (GES-1; Slika 2A-C). Otkrili smo da je razina p42.3-mRNA bila je značajno viša od normalne kontrole u svim GC staničnim linijama, s izuzetkom SGC-7901, gdje razlika nije bila statistički značajna. Razina izraz p42.3 je varijabla na razini proteina, ali bila je značajno viša u svim staničnim linijama GC u usporedbi s GES-1.We je također pokazala da Mir-29a izraz bio nizak u četiri od GC staničnim linijama ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 i AGS), koji je otkrio obrnuti odnos s p42.3 izražavanja. Iako je izraz Mir-29a bila visoka u SNU-1, to nije bila statistički značajna. Važno je napomenuti da je visoka ekspresija Mir-29a u MKN-28 je bio izuzetak. Pregled

Mir-29a regulira ekspresiju p42.3 pregled

Kako bi se procijenilo je li p42.3 je potisnuta MIR -29a, tretirani smo MKN-45 stanica sa oponaša i inhibitori Mir-29a za 48 sati kako bi se egzogeno nad- i dodatno regulira ekspresiju Mir-29a konkretno; Zatim se odredi izraz p42.3. Nakon transfekcije MKN-45 stanica sa oponaša je miR-29a ekspresija povećana za približno 10 puta, dok je tretman s inhibitorima smanjenje sadržaja miR-29a za više od 50% (slika 3A-B). To navodi na zaključak da su i oponaša i inhibitori Mir-29a radili učinkovito u našim eksperimentima. Prekomjerna ekspresija Mir-29a može značajno potisnuti ekspresiju p42.3 na obje razine mRNA i proteina, što je bio sličan učinak na odsutnost p42.3 strane p42.3 siRNA (si-p42.3). Također, otkrio je da CHK2 se regulira prema gore i cyclinB1 je regulirani nakon odsutnost p42.3 strane p42.3 siRNA. Zanimljivo, slična učinci djeluju na CHK2 i cyclinB1 prekomjernom ekspresijom Mir-29a u MKN-45 stanica (Slika 3C-D). Osim toga, transfekcija inhibitora Mir-29a dramatično smanjenje ekspresije Chk2 i povećana p42.3 i cyclinB1 izraz (Slika 3E-F). To navodi na zaključak da je Mir-29a mogao reguliraju ekspresiju gena p42.3 u MKN-45 stanica. Pregled

Mir-29a inhibira proliferaciju stanica in vitro pregled

Prema podacima iz stanične proliferacije test došli smo krivulje apsorbancija na valnoj duljini od 450 nm nakon transfekcije za različite trajanja. Pronašli smo da je stanična proliferacija je bila značajno inhibirana nakon transfekcije MKN-45 stanica sa p42.3 siRNA kroz 48 sati i 72 sata, a Slično je navedeno nakon stanice su transfektirane s oponašatelja Mir-29a. Međutim, stupanj represije postignuto miR-29a oponaša bila veća od p42.3 siRNA induciran smanjenom (Slika 4A). Naprotiv, rast stanica je unaprijeđen za oko 10%, u odnosu na negativnu kontrolu kada transfektirane s inhibitorima Mir-29a 48 sati, ali je došlo do pada na 72 sati (slika 4b). To pokazuje da je Mir-29a može inhibirati proliferaciju stanica preko potiskujući izražavanje p42.3. Pregled

Mir-29a blokira progresiju staničnog ciklusa pregled

odsutnost p42.3 strane p42.3 siRNA može rezultirati u zaustavljanje staničnog ciklusa; dakle, istraživali smo da li Mir-29a moglo utjecati na progresiju staničnog ciklusa putem ciljanja gen p42.3. Nakon MKN-45 stanice su transfektirane s p42.3 siRNA 48 h, otkrili smo da je stanični ciklus je blokiran u fazi G1 (dodani 75-93%, P pregled < 0,05), u usporedbi s negativnom kontrolom ( 66,18%). Otkrili smo da oponaša Mir-29a također može izazvati G1 faze uhićenja u MKN-45 stanica nakon tretmana u trajanju od 48 sati (75.56%, P izvoznici < 0,05; Slika 5).

izraza Mir-29a i p42.3 proteina u GC i njihova korelacija s kliničkopatološkim karakteristike

Korištenje kvantitativnog real-time PCR tehnike, Mir-29a je otkriven u 60 parova GC tkiva i njihovu odgovaraju ne-raka u susjedstvu tkiva, dok su razine p42.3 proteina također je procijenjena u tim tkivima, Western blot. Od 60 GC tkiva uzoraka, p42.3 izraz lica bio je visok u 35 slučajeva (35/60, 58,33%) u odnosu na njihove usklađene bez raka susjedna tkiva. U 25 slučajeva u kojima su regulirani p42.3 izraz, Mir-29a izraz je bio visok u 21 slučajeva. Mir-29a izraz bio nizak u 27 slučajeva (27/60, 45%). Gore navedeni podaci ukazuju na obrnuti odnos između Mir-29a i izražavanja p42.3 proteina u uzorcima tkiva ( P
= 0.000, Tablica 1 i Slika 6), ali je koeficijent korelacije nije bilo dobro (r = -0.316 ). pregled

Nadalje, mir-29a i izraz p42.3 proteina su ocijenjeni s obzirom na kliničkopatološkim karakteristike 60 pacijenata od kojih su uzeti uzorci tkiva. Naši nalazi sugeriraju da nije bilo očitih veza između p42.3 proteina i Mir-29a izražavanja, odnosno, s kliničkopatološkim značajki (tablica 2). Pregled

Rasprava pregled

Gen p42.3 je vrlo konzervirana kod sisavaca i kao onkogena, može igrati važnu ulogu u progresivnom transformacije normalnih želuca epitelnih stanica u stanice karcinoma. Njegova diferencijal izraz u fazama staničnog ciklusa otkriva da p42.3 mogu biti uključeni u regulaciji staničnog ciklusa. To je dodatno potvrđuju naši rezultati, koji su pokazali da p42.3 utišavanje mogao promijeniti izraz dva ključna proteina, CHK2 i ciklin B1, koje su uključene u regulaciju staničnog ciklusa. Korištenje gubitak-of-funkcije eksperimente, pokazali smo da p42.3 mogu stimulirati proliferaciju stanica i kako je izvijestio, naši rezultati pokazuju da p42.3 je izraženo u GC tkiva u usporedbi sa susjednim sluznici nemaju veze s rakom. [3] Međutim, molekularni mehanizmi koji nastaju u ovom nenormalnom ekspresijom p42.3 gena u GC slabo shvaćena, kao što je vidljivo iz nedostatka dostupnoj literaturi. MiRNAs mogu regulirati ekspresiju gena ciljajući na vezna mjesta na ciljne mRNA [27] i u humanim karcinomima, mnogi miRNAs već bili uključeni. Međutim, funkcija samo nekoliko je shvatio do sada, posebno u GC [28]. Pregled

U ovom izvješću, odabrali smo Mir-29a za daljnje istrage sustav reporter gena i na kraju otkrio da je p42. 3 je bio izravan ciljani gen Mir-29a. Naši podaci predložio da četiri baze podataka (TargetScan, microRNA.org, mikrokozmos cilja Verzija 5 i miRGen) korištene su učinkoviti, ali ne savršeno, alati za predviđanje Mirna ciljeva i pod uvjetom eksperimentalne dokaze za poboljšanja temeljnog algoritam. Pregled

Mi smo pokazali da izraz p42.3 obrnuto je povezano sa mir-29a izražavanja u četiri GC staničnim linijama. U tri od tih, MKN-45, MGC-803 i AGS, to je vidljivo kako na mRNA i proteina, ali to nije bio slučaj u SGC-7901 stanične linije. Osim toga, miR-29a ekspresije nije bila je niska u staničnim linijama MKN-28 i SNU-1. Uzeti zajedno, ova opažanja nam je omogućilo da pretpostavljaju da ova regulatorna uloga Mir-29a je komplicirano u staničnim linijama GC i da Mir-29a može imati različite uloge u različitim staničnim podrijetla. Međutim, podrobnosti mehanizama Mir-29a funkcija u staničnim linijama GC zahtijevaju daljnje istraživanje. Pregled

U našoj studiji, Mir-29a prekomjerna ekspresija može izazvati slične učinke onima postići prigušenje p42.3 strane p42.3 siRNA. Oba p42.3 mRNA i protein su regulirani nakon stanice su transfektirane s p42.3 siRNA ili miR-29a oponaša i staničnu proliferaciju i staničnog ciklusa su potisnuti kad se stanice su podvrgnuti istim smetnje. To sugerira da Mir-29a mogu biti uključeni u patogenezu GC preko represije izražavanja p42.3 gena. Međutim, pronašli smo iz krivulja rasta koji je stupanj represije od strane Mir-29a oponaša bila veća nego p42.3 siRNA. Prema našem mišljenju, glavni razlog za to može biti da su određene miRNAs može regulirati stotine gena za kontrolu staničnu funkciju. U ovom istraživanju, Mir-29a može inhibirati proliferaciju stanica, barem djelomično, ciljajući p42.3. Pregled

pokazao Naši podaci da, iako je stopa visoke ekspresije Mir-29a je 55% (33 /60) u GC, p42.3 izraz lica bio je nizak u 21 od tih slučajeva. To navodi na zaključak da je Mir-29a može imati ključnu ulogu u GC tkiva s niskom razinom ekspresije p42.3. Pregled

U ovom istraživanju, potvrđene smo da p42.3 je izravna meta Mir-29a. Također smo pokazali da miR-29a mogu inhibirati proliferaciju stanica i blokiraju stanični ciklus, barem djelomično, putem represiju p42.3 ekspresije u GC. Zaključujemo da Mir-29a može igrati ključnu ulogu u regulaciji ekspresije p42.3 u GC. Zanimljivo je da su otkrili da p42.3 gen mogao reguliraju ekspresiju Mir-29a (podaci nisu prikazani ovdje), ali je temeljni mehanizam regulacije će se istražiti u budućnosti. Pregled

Materijali i metode pregled

Bioinformatika pregled

Četiri učinkovita računalna rješenja koja koriste različite vrednovanje sustava [29] - [32] su korišteni za predviđanje regulatornih miRNAs koje ciljaju p42.3 gen, uključujući TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), mikrokozmos cilja Version 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv~~HEAD=dobj /mikrokosmos /htdocs /ciljevi /v5 /) i miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Ciljevi su bili odabrani za daljnju potvrdu iz skupine miRNAs koje su zajedničke svim rezultata dobivenih iz više od jednog pretragu. Pregled

Uzorci tkiva

Šezdeset para patohistološki potvrdio GC i susjedne ne-raka tkiva uzorci su dobiveni od bolesnika podvrgnutih kirurškom resekcija na Renji bolnici učlanjene u Šangaj University Jiaotong School of medicine, Kina između srpnja 2007. i siječnja 2009. godine uskladiti nemaju veze s rakom susjedna tkiva dobiveni su na minimalnoj udaljenosti od 5 cm od mjesta tumora. Istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Šangaj Jiaotong istraživanje i informirani pristanak koji je dobiven od svih bolesnika, a pisani pristanak dobiveni su od svakog pacijenta. Pregled

Stanične linije i uvjeti uzgoja

Ljudski GC stanične linije SGC-7901, MKN-28 MKN-45, MGC-803, SNU-1 i AGS i GES-1 normalan želuca epitelu stanična linija, koje su kupljene od ATCC (SAD), održavane su u RPMI 1640 mediju (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Stanice su uzgojene na 37 ° C u CO 5% _{2 inkubator. Otopina tripsina (0.25%) se koristi za odvajanje stanica od tikvice za kulturu. Pregled}

Konstruiranje vektora pregled

konstruirali vektori ekspresije pri-miR-29a se najprije amplificiran s klicama konstruiranim od primer 5.0 software Premier (Tablica 3) i zatim su klonirani u pcDNA3.1 (Invitrogen). Za proizvodnju plazmida koji sadrži pretpostavljenu vezno mjesto Mir-29a, i divljeg tipa i mutanta sekvence iz položaju 111 do 380 od p42.3-3'UTR su kemijski sintetizirani (Slika 1A), a zatim su klonirana u nizvodno gena EGFP na Bam pregled HI i Eko pregled RI mjesta u pcDNA3 /EGFP vektor (Saierbio, Tianjin, Kina). pregled

reporter gena pregled

MKN-45 stanice su posađene u trostrukim jažicama 24 jažica na dan prije transfekcije. PcDNA3.1 (+) /primarne miR-29a su ko-transfektirane s divljim tipom i mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR respektivno. Zatim, 0,5 ug pcDNA3.1 (+) /primarne-Mir-29a i 0,5 ug /pcDNA3 EGFP /p42.3-3'UTR dodano u svaku jažicu, a 0,1 ug vektora pDsRed-C1 (Clontech ) koji izražava RFP dodani su svaki i endogeni referenca. Stanice koje su bile transficirane samo s pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR ili pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+), korišteni su kao kontrole. Stanice su sakupljene 48 sati nakon transfekcije i analizirani na temelju intenziteta EGFP i RFP fluorescencije detektirani pomoću fluorescencije spektrofotometar F-4500 (Hitachi, Japan). Pregled

Cell transfekcija pregled

Transformacija MKN-45 stanice je izvedena korištenjem reagens lipofektamin 2000 (Invitrogen) slijedeći protokol proizvođača. MKN-45 stanice su posađene u ploče sa 6 jažica ili ploče s 96 jažica na 30% konfluencije, dan prije transfekcije. Oponaša (100 nm, GenePharma) i inhibitori (200 nm, RIBOBIO) Mir-29a su korišteni za egzogeno nad- i dodatno regulira ekspresiju Mir-29a. Za utišavanje ekspresije p42.3 gena, a MKN-45 stanice su transfektirane s siRNA prema p42.3 (SI-p42.3, 100 nM, GenePharma). Kontrola RNA (nazvana kao NC) je ne-homologna bilo ljudski genom. Sekvence nukleotida oligo su prikazani u tablici 4. pregled

realnom vremenu RT-PCR pregled

Ukupna RNA je izolirana koristeći Trizol reagensa (Invitrogen) i zatim se pomiješa s RNaza-slobodne DNase I ( Fermentas, San Diego, CA, USA). Ukupna RNA (500 ng) je reverzno prepisana pomoću PrimeScript RT seta (Takara, Dalian, Japan). Sekvencijama se koriste za pojačavanje p42.3 i GAPDH prikazani su u tablici 3. Za analizu ekspresije zrelog Mir-29a, 2 ug od ukupne RNA je podvrgnuta reverzna transkripcija pomoću All-in-One Mirna Q-PCR Otkrivanje Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kina). Kvantitativna realnom vremenu PCR za zrelu Mir-29a i U6 provodi se u skladu s uputama proizvođača koji koriste ABI 7300 real-time PCR sustav i specifičnih početnica designed by GeneCopoeia, Kina. Relativni izraz p42.3 i Mir-29a se normalizira na endogeni referenca (GAPDH i U6 mali nuklearni RNK pojedinačno) i u odnosu na kontrolu. Rezultati su prikazani kao mnogostrukost promjene, izračunavana je primjenom postupka (-ΔΔCT) 2 [33]; relativni odnos izraz < 1.0 se smatra kao niska, a omjer > 1.0 se smatra visoko izraz [14] pregled

Western blot pregled

Ukupni protein iz kulture stanica i tkiva. ekstrahira se RIPA puferu za lizu koji sadrži PMSF, prema uputama proizvođača (Beyotime, Shanghai, Kina). Koncentracija proteina je mjerena pomoću Bradford postupka [34]. Sve u svemu, 40 ug proteina su elektroforezom preko 10% SDS poliakrilamidnim gelovima i zatim se prenesu na PVDF membranu (Millipore). Membrana se inkubira s p42.3 antitijela (1:500, Abmart, Kina), CHK2 antitijela (1:1,000, CST), cyclinB1 antitijela (1:1,000, CST) ili GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kina) na 4 ° C preko noći. Sekundarna antitijela su označeni s HRP (Kang Chen, Kina) i signali su detektirani pomoću ECL kita (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Nakon toga, slike su analizirani ImageJ 1,43 softvera. Ekspresija proteina se normalizira na endogeni referenca (GAPDH) i u odnosu na kontrolu. Relativna omjer izraz < 1,0 se smatra kao niske ekspresije, a omjer > 1,0 se smatra kao visoka ekspresija [14] pregled

Razmnožavanje stanica Test pregled

bere MKN-45 stanice. (približno 5 x 10 ^{4 stanice) nasađene su u kulturu ploče s 96 jažica. Staničnom proliferacijom je mjerena na 24 sata, 48 sati i 72 sati nakon transfekcije, respektivno, pomoću brojanja Kit-8 (DOJINDO, Japan), u skladu s protokolom proizvođača. Apsorbancija pri valnoj duljini od 450 nm, što pokazuje pozitivan odnosu prema sposobnosti stanične proliferacije, određena je spektrofotometrom (E-LIZA MAT-3000). Pregled}

staničnog ciklusa Test pregled

Četrdeset -eight sati nakon transfekcije, stanice su podizati korištenjem 0.25% tripsina i ispere u DPBS (Gibco); Potom su fiksirani u 70% etanolu pri -20 ° C tijekom 24 sati. Za protočnom citometrijskom analizom (EPICS XL Beckman Coulter), stanice su inkubirane u RNA (Fermantas) na 37 ° C tijekom 30 min, tretira s PI (Sigma), pa se suspendira u 300 ul DPBS. Pregled

Statistička analiza

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD iz najmanje tri odvojena pokusa. Značaj je analizirana s t-test i ne-parametarskih testova (Mann-Whitney U test i Kruskal-Wallis H test). Statistička značajnost korelacije između ekspresije Mir-29a i p42.3 proteina izračunata je hi-kvadrat testom i Spearmanov rang korelacije. Statistička analiza provedena je pomoću SPSS 13.0 softvera (IBM, SAD), a razlike su smatrane statistički značajna na P izvoznici < 0.05. Pregled