Pozadina pregled
Povećana ekspresija ciklooksigenaze-2 enzima (COX-2) jedna je od glavnih karakteristika rakom želuca (GC), koji je vodeći uzrok smrti u svijet, posebno u Aziji i Južnoj Americi. Iako je Wnt /β-katenina signalni put je bio uključen u aktivacije transkripcije gena COX-2, precizni mehanizam moduliranja ovaj odgovor je još uvijek nepoznat. Pregled
Metodologija /glavne nalaze
Ovdje smo proučavali regulaciji transkripcije gena COX-2 u staničnim linijama GC i procjenjuje da li je ova pojava modulira Wnt /β-katenina signalizaciju. Prvo smo ispitali na ekspresiju COX-2 mRNA u GC stanicama i utvrdili da postoji diferencijal ekspresije u skladu s visokim razinama nuklearne lokalizirani beta-katenina. Farmakološka terapija sa ili litijem ili valproična kiselina i molekularne indukcije s pročišćenom kanonske Wnt3a znatno poboljšane izražavanja CoX2 mRNA u dozi i vremenski ovisan način. Serijski brisanje KBP CoX2 fragment promotora 1.6 i koji stječu ili gubitak-of-funkcije pokusa nam je omogućilo da identificiraju područje minimalnom Wnt /β-katenina odgovarajući se sastoji od 0,8 KBP od COX-2 promotora (pCOX2-0.8), na kojoj je maksimalni odgovor u gen-reporter testovima. Aktivnost ovog pCOX2-0.8 promotorske regije dodatno je potvrđena mutageneze i DNA-protein vezivanja web-usmjerena. Pregled
Zaključci /Značaj pregled
zaključujemo da je pCOX2-0.8 minimalni promotor sadrži faktor novi funkcionalni T-stanica /limfoidna pojačivač faktor (TCF /LEF) -response element (FSME Site II; -689 /-684) koji reagira izravno na poboljšane Wnt /β-katenina signalizacije i koji može biti važna za početak /napredovanja GC pregled
Izvor:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-katenina Signalizacija Poboljšava ciklooksigenaze-2 (COX-2) transkripcijsku aktivnost u želudac stanica raka. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562 pregled
Urednik: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, United States of America pregled
Primljeno: 5. studenoga 2010; Prihvaćeno: 11. ožujak 2011; Objavljeno: 6. travnja 2011 pregled
Copyright: © 2011 Nuñez et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan
financiranja. Ovo djelo bio podržan od CTI raka, PROGRAMA Bicentenario en Ciencia y tecnologia (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) potporom broj PBCT-6 iz čileanske vlade (MM i GVD). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled
U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled
Uvod pregled
rak želuca (GC) je multifaktorijalna bolest, karakterizirana vrlo malignih neoplazmi u sluznici želuca, te predstavlja drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu s najvećom učestalosti u Aziji i Južnoj Americi [1], [ ,,,0],2], [3]. Ekološke povezani čimbenici rizika uključuju prehranu, potrošnja onjušiti, pretilost i Helicobacter pylori pregled infekcija [4]. Nekoliko mutacija u tumor-supresorskih gena, uključujući P53, adenomatozna polipoza coli (APC), E-kadherina i RUNX3 [3], [5], i u onkogenima kao K-ras, HER2 i P-katenina [3], [6], [7], su dokumentirani u GC. Osim toga, tijekom ekspresije različitih gena je dokumentirano, uključujući WNT2B [8], tC1 (C8orf4) [9] i ciklooksigenaze 2 (CoX2) enzim koji katalizira ključni korak u proizvodnji prostaglandina E2, ključni medijator upale zglobova [10], [11]. pregled primijećeno je da je ekspresija COX-2 gena značajno povećana u humanim tkivima adenokarcinoma želuca, u usporedbi s uparenim želučane sluznice uzoraka bez stanica raka [10 ]. Kao povećana ekspresija je predloženo da utječe intenzitet invazije, veličini metastaza u limfnim čvorovima, razvoj tumora i loše prognoze [4], [12], [13]. U tom pogledu, velike količine podataka opisuju kemijsku preventivno i antitumornu aktivnost nesteroidnih protuupalnih lijekova (NSAID), uključujući selektivne inhibitore COX-2 kao potencijalni tretman za GC [10], [11], [14]. Pregled kontrole transkripcije gena COX-2 ovisi o molekularnoj strojeva u interakciji s COX-2 promotora, koji izgleda kao da se kontrolira putem aktivnosti raznih signalnih putova [15], [16], [17]. Doista, u početku je utvrđeno da CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) i NF-kB (-233 /-214) sljedove na COX-2 promotora su bili neophodni za ekspresiju gen [16]. Naknadne funkcionalne studije na COX-2 promotora identificirati niz regulatornih elemenata koji sudjeluju u transkripciju gena, uključujući i AP-1, AP-2, SP-1, C /EBPβ [18], [19], [20] i bjelančevina pripadnost faktor T-stanica /limfoidnih pojačivač faktor (TCF /LEF) obitelj transkripcijskih faktora, koji su ključni za Wnt /β-katenina prijenosa signala [21]. pregled Wnt /β-katenina signalni put je široko priznat kao igra važnu ulogu u ljudskoj bolesti, osobito u razvoj i nastanak raka [22], [23], [24]. Novije pokusi GC izvedene stanice pokazuju odnos između ekspresije COX-2 i inhibicije glikogen sintetaze kinaze-3β (GSK3β) enzima [25], koji je ključni Wnt komponenta koja fosforilira P-katenina i potiče njegovu kasniju degradaciju putem proteasomalni [26]. Odnos između Wnt /beta-katenina i COX-2 izražavanja u različitim modelima stanice raka i dalje je podržan od sljedećih studija. Prvo, što je primijetio u mliječnoj epitela koji Wnt /β-katenina igrati neizravan utjecaj na COX-2 prepisivanje, koji bi mogao biti posredovan up-regulaciji posredničkog faktora PEA3 [27]. Drugo, i za razliku od indirektnog načina djelovanja, Araki i stupaca. [21] izvijestio da je u stanicama karcinoma debelog crijeva postoji indukcija u COX-2 izražavanja kroz β-katenina /TCF ovisnih mehanizma, a dijelom karakterizira konsenzus TCF /LEF vezanja (TBE: jezgra CTTTG) položen 1079 bp uzvodno od transkripcije početka stranica u COX-2 promotora. Treće, uočeno je da kod pacijenata oboljelih od raka debelog crijeva i izvedenih staničnih linija postoji povezanost između prekomjerne ekspresije u Wnt signalnog puta povezan s proteinima LEF-1 i Pontin52 /TIP49a i up-regulaciji COX-2 izražavanja [28]. Konačno, korištenje hondrociti, pokazano je da LEF-1, zajedno s P-katenina reguliranim COX-2 ekspresiju izravno vezanje na LEF-1 /β-katenina kompleksa u 3'UTR područja od COX-2 genomske lokusa [29] , Dakle, u ovom trenutku ne postoji jasna slika o tome da li Wnt signalni sudjeluje u ekspresiji COX-2 gena, ili kao njegove uloge u GC početak /progresije. Ovdje smo nastojali shvatiti da li postoji izravna regulacija ekspresije COX-2 gena preko Wnt /β-katenina signalizaciju i identificirati Wnt /β-katenina regulacijske elemente u promotorske regije COX-2 gena koji može poticati COX-2 transkripciju u GC stanicama. pregled Materijali i metode pregled Stanice i uvjeti uzgoja ljudska staničnih linija MKN45 (japanski Zbornik istraživačkih Bioresources, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 i HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) su bili korišteni u ovom istraživanju. MKN45, N87, SNU1 i KATOIII stanice su uzgojene u RMPI mediju (Gibco); AGS u F12K medija (Hyclone); WI38 u EMEM (Gibco); i HEK293 u DMEM (Gibco). Medij kulture je nadopunjen s 10% FBS (Gibco) (AGS 20%) i 1% penicilina /streptomicina. Staničnih linija su održavane na 37 ° C u 5% CO 2 i sa zasićenom vlazi. Pregled plazmidi i mutagenezom pregled SuperTOPFlash-luciferaza i pRL-TK renilla- luciferaze plazmidi [30], konstitutivni aktivni β-katenina (S33Y) [31], a dominantno-negativnih ΔTCF4 izraz plazmidi [32] su prethodno opisano. Himerni COX2 fragmenti promoter-luciferaze se generira PCR-om iz ljudske genomske DNA pomoću specifičnih primera koji sadrže restrikcijska mjesta i nakon toga umetnut u pGL3-Basic vektor (Promega). Mutacije u mjestu TBE-II (-689 /-684) od COX-2 promotora su uporabom primera pCOX-0,8-TBEMUT s QuickChange mjesno usmjerenom mutagesis kit (Stratagene). Izvedene su potvrđena putem izravnog sekvenciranja (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Sekvence primera su opisani u Tablici S1. Pregled Semikvantitativna i RT-PCR pregled Ukupna RNA se ekstrahira u RNA se free uvjeta upotrebom TRIZOL (Invitrogen) i 2 ug RNA je reverzibilno prepisana sa 200 u of Superscript II reverzna transkriptaza (RT) (Invitrogen), korištenjem 500 ng oligo (dT) primerima. Eksperimentalno određivanje CoX2, c-myc i razine mRNA CCND1 provedena je prema [33]. Ukratko, cDNA su bili podvrgnuti real-time PCR u iCycler iQ sustava (Bio-Rad Laboratories). Svaki volumen 25 ul reakcija je sadržavala 1 jedinica Platinum Taq DNA polimeraze (Invitrogen), 1 x reakcijskog pufera (20 mM Tris-HCl pH 8.4 i 50 mM KCl), 1,5 mM MgClz 2, 2,5 ug BSA, 0,01% glicerola 200 uM dNTP, 0.3X SYBR Green rješenje i 0,4 uM specifičnih početnica (vidi Tablicu S1). PCR uvjeti su bili kako slijedi: 90 sekunda na 94 ° C, a zatim 30 ciklusa od 30 sekundi pri 94 ° C, 30 sekundi na 62 ° C i 30 sekundi na 72 ° C. Sve su reakcije izvedene u tri Rezultati dobiveni za svaki gen su normalizirani onima dobivenim paralelno s P-aktin. Kvaliteta RNA i PCR produkata se prati tijekom pokusa preko elektroforezom na 1% agaroznim gelovima, obojani s etidij bromidom, pregled indukcije Wnt /β-katenina signalnog puta pregled Wnt signaliziranja je farmakološki inducirati u stanicama MKN45 nasađene kultivacijskih ploča 6 i na 80-90% konfluencije (tj 1, 2, 4 i 8 sati inkubacije) ili sa 10-20 mM LiCl (Sigma) ili 5-10 mM valproinske kiseline (VA, Sigma) kako je prethodno opisano [34], [35]. Zatim su prikupljeni za vađenje mRNA i Real Time PCR-određivanje kao što je gore opisano. Slično tome, MKN45 stanice stimulirane tijekom 2 sata sa 200 i 400 ng /mL pročišćenog Wnt3a proteina. Pročišćavanje Wnt3a provodi se kao što je opisano [36]. Pregled transkripcijskom aktivnošću spomenute cox2 promotora pregled Aktivnost COX-2 od promotora se mjeri u 80-90% konfluentne MKN45, AGS, WI38 i HEK293 stanice nasađene u 6 posuda za kulture. Ukratko, stanice su ko-transficirane koristeći Fugene (Roche) na 24 s pCOX2-luciferaza ili pSuperTOPFlash reportera i bilo konstitutivan aktivan beta-katenina (S33Y) [31] ili dominantnog negativnog-ΔTCF4 [32] konstruktima. PRL-TK Renilla luciferaze plazmid se rabi kao internom kontrolom. Krijesnice i aktivnosti Renilla luciferaze je određena korištenjem Dual-Luciferase reporter assay (Promega) u Victor-3 Multiplate čitača instrumenta (Perkin Elmer), kao što je prethodno opisano [30]. Relativni luciferaze aktivnosti su izražene dijeljenjem krijesnice aktivnosti luciferaze s aktivnošću Renilla luciferaze za svaki uzorak (N = 3, svaki po tri puta). Pregled kromatina imunoprecipitacijski (chip) Testovi pregled Studije Chip su provedeni u MKN45 stanicama kako je ranije opisano [37]. Udio nuklearne P-katenina vezan bilo za KME mjesta I, II, III ili IV u COX-2 promotora ljudskog bio imunoistaloži s anti β-katenina antitijela (Santa Cruz), a procjenjuje se u realnom vremenu-PCR pomoću specifičnih primera (Tablica S1) , Dodatno, frakcije RNA polimeraze II (Pol II) i acetiliranih histona H3 i H4 (H3ac i H4ac) vezan bilo na TBE-II regije (-793 /-594) ili proksimalnom području (-118 /+ 62 ) od COX-2 promotora sličan je ocijenjen (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac i H4ac, na sjeveru države). Kao pozitivna kontrola, korištena FSME stranice c-myc [38]. Specifičnost antitijela ispitana je s normalnom zec-IgG (Santa Cruz). Pregled Electrophoretic pokus pokretljivost pomaka (EMSA) pregled EMSA je izvedena pomoću oligonukleotida sadrže bilo divljeg tipa cox2 TBE-II konsenzus sekvencu (vidi Tablica S1) ili ranije izvijestili mutanta KME sekvence [39]. Ukratko, divljeg tipa i mutiranih 32P-obilježeni oligonukleotidi su inkubirani u puferu za vezanje s nuklearnim ekstrakata MKN-45 stanica kroz 30 min na 30 ° C. Nakon toga, DNA-protein kompleksi su razdvojeni od slobodnih nukleotida na 5% non denaturaciju poliakrilamidnom gelu. Nakon elektroforeze, gel se osuši i prenese na film, 1 dan. Vizualizaciju radioaktivnih vrpci analizirana autoradiografijom. Specifičnost vezanja je provjerena inkubacijom DNA-protein kompleksa u prisutnosti suviška neoznačenog divljeg tipa i mutiranih nukleotida [21], [39]. Pregled Statistička analiza pregled Svaki pokus je ponovljen najmanje tri puta s tri ponavljanja. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Usporedbe Više grupe su izvedeni s jednosmjernim ANOVA pomoću softvera STATISTICA 9.0. P pregled. ≪ 0.05 je smatrana značajnom pregled Rezultati CoX2 izraz korelira s nuklearnim razine β-katenina u GC stanicama pregled U početku smo odredili izraz razine COX-2 mRNA u ljudskim GC staničnih linija MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII i AGS [40], [41], [42], kao i WI38 fibroblasta ovdje koristi kao kontrola stanične linije [43], ispitivanje bilo da su u korelaciji s Wnt /β-katenina signalizaciju. Kako je prikazano na slici 1, visoka razina ekspresije COX-2 su promatrani kao što je ranije 26 ciklusa PCR amplifikacije na metastatskim stanicama MKN45, SNU16 i KATOIII, a također i u staničnoj liniji AGS, koji proizlazi iz primarnog tumora. Ovaj rezultat je u skladu s razinama CoX2 ekspresije prethodno otkrivenih u MKN45, KATOIII i AGS stanica [44], [45], [46]. Nasuprot tome, razine CoX2 mRNA ili vrlo niska u WI38 fibroblasta ili nedetektabilna u N87 i SNU1 stanica (Slika 1A), što ukazuje da ova diferencijal uzorak ekspresije nije povezan s metastatskim faze ili razine transformacije stanica. Izuzetno, razine nuklearnog β-katenina su usko povezani s COX-2 izražavanja, jer su uočeni visoke razine proteina u MKN45, AGS, SNU16 i KATOIII stanica, u usporedbi sa N87, SNU1 i WI38 stanica (Slika 1B), što podrazumijeva ulogu WNT signalizacije u izrazu CoX2 mRNA u GC stanicama. pregled Poboljšanje COX-2 izražavanja putem Wnt /beta-katenina signalizaciju pregled kako bi se ispitati ako je Wnt kaskada je uključen u COX-2 izražavanja, MKN45 stanice su farmakološki stimulira različite periode vremena (odnosno 1, 2, 4 i 8 sati) bilo sa litijem (LiCl) ili valproična kiselina (VA), budući da su obje droge su prethodno već pokazali da moduliraju Wnt signaliziranja putem inhibicije aktivnosti GSK3β, a time se povećava nuklearno razine beta-katenina [34], [35]. Zanimljivo, opazili smo značajno poboljšanje COX-2 ekspresije induciranu 10-20 mM LiCl ili 5-10 mM VA, koji je započeo ubrzo nakon inkubacije sa spojevima i maksimuma nakon dva sata tretiranja (slika 2A). Stvarnom vremenu određivanje razine CoX2 mRNA u MKN45 stanicama slično tretiranih LiCl ili VA (2 sata) pokazuje da CoX2 bila značajno je povećana (slika 2B) i da je taj učinak je paralelno s jednim promatrana Wnt /β-katenina ciljne gene c-myc [47] i ciklin D1 [48]. Dalje, kako bi se isključila mogućnost da je promatrana pojava ogleda nespecifične učinke lijekova koji djeluju na proteine koji utječu na različite signalne kaskade, primjenjuju se neposredno potpuno funkcionalan pročišćeni Wnt3a proteina MKN45 stanica (vidi Metode). Ti pokusi jasno pokazali da 200-400 ng /ml pročišćene Wnt3a značajno poboljšanu ekspresiju mRNA CoX2 poslije kratkog razdoblja inkubacije (Slika 2), djelomično objašnjava brzi učinak LiCl i VA i podržavanje izravnu povezanost između kanonskog Wnt /beta-katenina aktivacija i stimulacija COX-2 transkripcije u GC stanicama. pregled Identifikacija novih KME lokacija u promotoru gena Netlogu COX-2 Prethodne studije pokazale su da /β-katenina reagiraju tBE stranica Wnt ( konsenzus jezgra: CTTTG) nalazi se na -1079 /-1,074 bp uzvodno od početnog mjesta za transkripciju (TSS) ljudske COX-2 gena [21] (Site IV Slika 3A, vidi također sliku S1). Daljnje skeniranje uzvodne sekvence 1600 bp iz TSS [49] nam je omogućilo da identificiraju 3 nove navodne KME stranice: -877 /-872 bp (Site III, smislene orijentacije), -689 /-684 bp i -318 /-313 bp (Sites II i ja, odnosno, kako u suprotnom smjeru) (slika 3A), koji nisu konzervirane između čovjeka i glodavca COX-2 gena (Slika S1). stoga klonirana 1600 bp segment iz ljudske COX-2 promotora (pCOX2), uključujući sve četiri FSME mjestima, u pGL3-Basic vektor koji je spojen na gen luciferaze koja se koriste kasnije kod reporter analiza (slika 3A). Izvanredno, usporedo transfekciji 10 ng ovog konstrukta u MKN-45 i HEK293 stanica pokazala je da pCOX2 pokazale su značajno veći (9 puta), bazalnu promotorsku aktivnost MKN45 stanicama (slika 3b i C). Mi smo pretpostavili da je to veća aktivnost pCOX2 bazalni promotor može biti povezana s povišenim sadržajem nuklearnog beta-katenina u ovom GC stanične linije (Slika 1B). Stoga MKN45 i HEK293 stanice su kotransfektirane sa pCOX2 u prisutnosti nižih doza konstitutivni aktivnog β-katenina proteina (S33Y) [31]. Kao što je vidljivo i na slici 3, pCOX2 aktivnost zaista je pojačan u oba tipa stanica, što ukazuje da je P-katenina može vezati i aktivirati TCF /LEF transkripcijskih faktora na funkcionalne KME mjesta unutar pCOX2 promotora. Pregled Doprinos KME stranice za CoX2 promotorske aktivnosti u GC stanicama pregled Kako secirati doprinos Wnt /β-katenina reagiraju na KME stranica na transkripcije aktivnosti COX-2 promotora četiri pCOX2 brisanja konstrukti su generirani: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0.8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); i pCOX-0.4 (-371 /+ 35 bp) (Slika 4A). Ti konstrukti su zatim ispitani na njihovu aktivnost putem transfekcije u MKN45 i AGS stanice, koristeći WI38 fibroblaste kao kontrola stanične linije. U skladu s endogenim razinama CoX2 ekspresije u navedenim GC staničnih linija (Slika 1A), pCOX2 delecije zadržao različite razine aktivnosti u MKN45 i AGS stanica (Slika 4B i C). Nasuprot tome, nema promotora aktivnost otkrivena je u WI38 fibroblasta (Slika 4D), čak i kada su povećane doze transfekcije u tim stanicama 8 puta (tj od 50 do 400 ng) (Slika S2). Važno je, te u dogovoru s prethodnim izvješćima [50], WI38 stanice učinkovito izrazili luciferaza-reporter konstrukt sadrži promotor p21 gena (Slika S2), što znači da je u tim kontrolnim stanicama molekularna strojevi odgovorni za izazivanje COX-2 prepisivanje nije aktivan , Daljnji pokusi su pokazali da unos u MKN45 i AGS stanice s pCOX2-0.8 konstrukt, koji ima 859 bp izbrisana iz 1,6 kb pCOX2 reporter (slika 4a), rezultiralo značajnim povećanjem aktivnosti promotora u usporedbi s novinarom pCOX2-1.2 (Slika 4A-C). Kako nije bilo nikakvih značajnih razlika između 1,6 kb pCOX2 i pCOX2-1.2 konstrukata (Slika S3), nismo obaviti dodatno analizira s većim konstrukt. Važno je, pCOX2-0.8 zastupa minimalnu veličinu promoter fragment koji pokazuje maksimalnu bazalnu aktivnost, budući daljnje brisanja bilo 159 ili 370 bp iz 5'-kraju, kao što je to slučaj sa pCOX2-0.65 ili pCOX2-0.4 konstrukata, odnosno , smanjena više od dva puta razine pCOX2 bazalnom. Ovi rezultati pokazuju da je područje između 0,8 i 0,65 kbp uzvodno od TSS gena COX-2, a koji obuhvaća element za novi TBE odgovora (FSME Site II; -689 /-684), mogu biti ključna komponenta u regulaciji bazalna razina ekspresije COX-2 gena u GC stanicama. pregled reguliranje prema pCOX2-0.8 preko Wnt /beta-katenina signalizaciju pregled Zatim smo ispitali učinak Wnt /β-katenina signalizacije na roman TBE Site II. transfektirane smo MKN45 stanica s pCOX2-0.8 reporter konstrukta i co-izrazio konstitutivni aktivni β-katenina S33Y protein promatrajući kako postoji značajna (2-struki), povećanje transkripcije aktivnosti pCOX2-0.8. To β-katenina posredovano povećanje bilo je specifično jer nije pCOX2-0.4 konstrukt stimulirana u ovom P-katenina prekomjerna ekspresija uređaj (slika 5A i B). Kontrola za Wnt /β-katenina signalizacija u MKN45 stanica koristili smo Wnt /β-katenina reagiraju SuperTOPFLASH (StF) reportera koji nosi 12 kopija KME u tandemu [32], koji je transfektiran sam ili u prisutnosti plazmida kodiranje za mutant β-katenina S33Y proteina. Zanimljivo, a ko-ekspresija s mutiranim β-katenina S33Y proteina MKN45 stanicama je u mogućnosti povećati (1,9-puta) aktivnost StF reportera, visoke razine bazalni STF aktivnosti su otkrivene u odsutnosti mutiranog P-katenina (Slika 5C). Ovaj rezultat je u skladu s našim prethodnim nalazima visoke razine endogenog nuklearnog beta-katenina u ovom tipu stanice (vidi Slika 1B), te potvrđuje da je ovaj nuklearni faktor je funkcionalan. Kako bi se dodatno potvrdili ovaj zaključak, izveli smo identične eksperimente u HEK293 stanica dobivenih uglavnom isti rezultati, iako u ovom slučaju se ne dobije bistra krivulja doza-odgovor kada pCOX2-0.8 je transfektiran u prisutnosti rastućih koncentracija od tvorbene aktivne beta-katenina S33Y protein (Slika S4). Osim toga, otkrili smo da STF aktivnost u HEK293 stanica bila je vrlo osjetljiv na razinama egzogenog mutanta P-katenina (Slika S4C). Pregled Kako bi se dodatno istražiti učinke Wnt /β-katenina put na aktivnost od pCOX2-0.8 proveli smo gubitak-funkcije pokusa s dominantnog negativnog TCF4 (ΔTCF) konstrukt koji kodira transkripcijski faktor nedostaje 30 ostataka iz svog amino-kraju, a da se ne može vezati P-katenina [32] , Našli smo da se u MKN45 stanice ΔTCF izraz smanjio visoke razine pCOX2-0.8 bazalnog transkripcija na način koji ovisi o dozi (Slika 5D). Ovaj rezultat potvrđuje ključnu ulogu TCF /LEF transkripcijskih faktora među regulatorima aktivnošću pCOX2-0.8 sekvenca promotora i dalje podupire ideju da je TBE Site II (-689 /-684) uključen je u odgovoru na WNT /β-katenina signalizacije. pregled na kraju, da se izravno obratite ulogu KME Mjesta II u Wnt /β-katenina posredovanu regulacije COX-2 promotora, uveli smo po ciljanom mutagenezom promjenu u 2 ključa nukleotidi konsenzusne sekvencije TBE Site II jezgre (tj pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Te promjene su već pokazala da se ukine Wnt /β-katenina-posredovanu transkripciju [39]. Prolazne transfekcije studije su pokazale da mutacija FSME Mjesta II značajno smanjen (2-3 puta) bazalna aktivnost pCOX2-0.8 konstrukt u MKN45 stanicama (slika 5e) u usporedbi s divljim tipom pCOX2-0.8 promotora konstrukt. Osim toga, te u dogovoru s našim prethodnim rezultatima, mutacija ovog KME stranicama II gotovo u potpunosti blokirana β-katenina posredovane unapređenje pCOX2-0.8 konstrukta (Slika S4). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da TBE Site II (-689 /-684) je funkcionalna komponenta u CoX2 gena regulaciji transkripcije. Pregled β-katenina veže za gen promotorske regije COX-2 koji sadrži FMSE Mjesta II pregled Zbog transkripcijski aktivna konformacija kromatina strukture očituje povišenom razinom acetilacije histona [51], istaloži se umreženih kromatina fragmenata (prosječna veličina 300-500 bp) su izolirane iz MKN45 stanica korištenjem poliklonskih antitijela specifična za acetiliranih histona H3 i H4. Slično tome, otkrili smo vezanje RNA polimeraze II (Pol II) kao parametar se obično povezuje s transkripcijskom aktivnošću. Ispitali smo obogaćivanje u našim taloga dvije promotorske sekvencije: proksimalnog promotora (PP) područje (-118 /+ 62 iz TSS) i distalni kraj (-793 /-594) od COX-2 promotora sadrži konsenzus KME Site II ( -689 /-684). Posebno, TBE Site II ciljano dok prethodni eksperimenti pokazuju preferencijalnog vezivanja P-katenina ovom području promotora (Slika S5). Kao pozitivna kontrola, istražili smo vezivanje na FSME lokaciji na promotor gena c-myc (-1447 /-1,144 od TSS), koji je prethodno opisan u stanicama raka debelog crijeva [38]. Pregled acetiliziranih histoni H3 i H4 i enzim polimeraza II nađeno je da se vežu u regiji proksimalnog promotora (Slika 6A), što ukazuje da je struktura kromatina oko COX-2 promotor MKN45 stanicama u otvorenom konformaciji, čime se u skladu s prethodnim rezultatima koji pokazuju da je CoX2 gen aktivno prepisivanje. Posebice, β-katenina protein je imunoistaloži od MKN45 uzoraka govore u suradnji s promotorske regije prostire na KME slijed -684 /-689 u COX-2 gena (Slika 6b). Ovaj faktor bio je gotovo neprimjetan u regiji proksimalnog promotora, što ukazuje na to da endogena nuklearna β-katenina primarno privučeni na FSME Mjesta II u tim GC stanicama. Kao što se očekivalo, endogene β-katenina na sličan vezan na c-myc promotor FSME stranice, pri razinama koje su usporedive s onima koje su primijećene u genskom promotoru COX-2 (slika 6C). Pregled Zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da je TBE Site II je izravno uključen u β-katenina posredovane transkripcije aktivacije COX-2 promotora. Kako bi se dodatno potvrditi ove rezultate koje izvode elektroforetskih eseji mobilnost pomak (EMSA) iz nuklearnih ekstraktima MKN45 stanica. U tu svrhu smo pripremili 34 na temelju združena oligonukleotida; jedan sadrži divlji tip -689 /-684 TBE Site II sekvenca (tj CTACAAAGA, ostaci podcrtana predstavlja jezgru), a dva nukleotida koji sadrže misscnsc mutacije u obje jezgre KME Mjesta II (tj CTACGAGGA: KME-MUT1) ili u bočnih sekvencija (tj CGCCAAAGA: FSME-Mut2), kao što je prethodno opisano [21], [39]. Kao što je prikazano na Slici 6D, radiološki divljeg tipa TBE proba sposobna za formiranje zaostale DNA-protein komplekse i kada se inkubira sa ekstrakti jezgre od MKN45 stanica. Te protein-DNA kompleksima su specifični jer dodavanje suviška hladnog oligonukleotida divljeg tipa (50 puta) značajno inhibira nastajanje DNA-protein kompleksa (Slika 6D, linija 3 i 4, redom). Mutant Radio-obilježeni TBE-MUT1 sonda ne mogu tvoriti DNA-protein kompleksa po sebi, niti da se natječe sa divljim tipom oligonukleotid, kad se doda u suvišku kao hladnog probe (Slika 6D, linija 5 i 6, redom). Slični rezultati su dobiveni kada je druga hladna TBE-Mut2 sonda upotrijebiti kao konkurenti (Slika 6D, stupac 7). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je roman TBE Site II u COX-2 promotora koji su uključeni u aktivacije transkripcije gena COX-2 zapošljavanjem mašineriju odgovoran za prenošenje Wnt /β-katenina signalizaciju (Slika 6e). Pregled Rasprava pregled Prethodne studije ukazuje na ulogu Wnt /β-katenina signalizacije tijekom početka i /ili razvoj različitih vrsta raka preko modulaciji ekspresiju COX-2 gena [25]. U ovom radu smo predstavili jake dokaze izravnu ulogu za Wnt /β-katenina signalizaciju u kontroli COX-2 izražavanja u GC stanicama. Prvo, mi smo pokazali da postoji široka korelacija između ekspresije COX-2 i nuklearnu sadržaj beta-katenina, što se čini da je neovisan od bilo malignosti ili transformacije stanja CG stanica. Drugo, vremenski i dozno-ovisnog poboljšanje COX-2 ekspresije uočeno brzo nakon indukcije (2 h), s dodatkom farmakoloških spojeva oponaša Wnt /β-katenina signalizaciju. Treće, reporter testovi gena ocjenjuje CoX2 aktivnost promotora kao odgovor na koji stječu i gubitak-of-funkcije eksperimenti, uključujući i konstitutivno aktivnog β-katenina proteina i dominantnog negativnog faktora TCF4 transkripcije, pokazuju da su Wnt /β-katenina dijelovi uključeni u regulaciji transkripcije gena COX-2 pregled Mi smo i ovdje pokazala da u roku od 2 kBP uzvodno od COX-2 promotora ljudskog postoje četiri navodni KME mjesta. (jezgra: CTTTG), od kojih je jedan je prethodno pozabaviti Araki i Stupci [21], [28]. Preko reporterskog gena testova s različitim pCOX2 brisanje konstrukata smo pokazali da pCOX2-0.8 prikazan najveću bazalnu transkripcijsku aktivnost u GC stanicama MKN45 i AGS. Zanimljivo, pCOX2-0.8 zadržala KME Site-II (-689 /-684) integritet ukazuje na svoj ključni doprinos regulaciji transkripcije aktivnosti gena COX-2. Osobito, kompletan pCOX2 TBE Site II signature (tj 5'-WWCAAAGS-3 ', S = C /G, W = A /T), nalik na optimalan TCF stranice su opisali van de Wetering i stupaca. [52], koji je kasnije koristi za prepoznavanje prave Wnt-transkripcije ciljeve u Drosophila pregled gena NKD pregled i CG6234 pregled [53]. Pregled funkcionalnost ovog KME mjesta II je potvrdio naše mutageneze studija. Dakle, kad smo mutirali u TBE-potpis slijeda u pCOX2-0.8 konstrukta (MpCOX2-0.8), utvrđeno je da je aktivnost bazalnih CoX2 promotora je značajno utjecalo na MKN45 stanica. Osim toga naš čip i EMSA analize potvrdili su da β-katenina prioritetno regrutirao do -689 /-684 COX-2 promotorske regije u GC stanicama, na razini koja sliči onoj na c-myc promotora [38]. Tu interakciju prvenstveno pojavljuje na tom području promotora gena COX-2 kao što je bez β-katenina je pronađeno da se vežu na regiju proksimalnog promotora gena COX-2. Zajedno ovi rezultati pokazuju da TBE Site II funkcionalna Wnt /β-katenina koji reagira u COX-2 promotora ljudskog. Naši podaci, međutim, ne isključuje doprinos ostalih genomskih regija u ljudskom COX-2 gena [21]. Umjesto toga, predlažemo da se u GC stanicama prisutan kompleks web interakcija gdje TBE Site II surađuje s drugim elementima kao odgovor na gore regulira ekspresiju COX-2. Pregled Kako su naši rezultati u GC stanice su u skladu s onima prijavio za stanice raka debelog crijeva, to je primamljiva da nagađati da Wnt /β-katenina signalizacije mogu se isto tako su uključeni u COX-2 regulacije u drugim tumorima [21], [28]. Doista, umjerena do visoka razina proteina P-katenina može se promatrati u ca. 72% svih slučajeva raka analiziranih u ljudskom Atlas bazi proteina tkiva [54]. Isto tako, jaka do umjeren citoplazmatski COX-2 bojanja i povremene Membranozni reaktivnost je promatrana u 50% svih vrsta raka, uključujući i debelog crijeva, prostate, grlića maternice, endometrija, urothelial, gušterače, jetre i žljezdane stanice iz želuca tumorskog tkiva.