PLoS ONE: WNT /β-kateninai Signalizacijos Pagerina ciklooksigenazę-2 (COX2) transkripcijos veikla Skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

Fonas

Padidėjęs išraiška ciklooksigenazės-2 fermentą (COX2) yra viena iš pagrindinių savybių skrandžio vėžiu (GC), kuri yra pagrindinė priežastis, dėl mirties pasaulis, ypač Azijoje ir Pietų Amerikoje. Nors WNT /β-kateninai signalizacijos kelias buvo įtrauktas į transkripcijos aktyvavimo COX2 geno, tikslus mechanizmas moduliuoti šį atsakymą vis dar nežinoma.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Čia mes studijavo transkripcijos reguliavimas COX2 geno GC ląstelių linijų ir įvertinti, ar šis reiškinys yra moduliuojama WNT /β-kateninai signalizacijos. Mes pirmą kartą nagrinėjo COX2 mRNR išraiška GC ląstelių ir nustatė, kad yra skirtumas išraiška modelis atitiktų aukšto lygio branduolinės-lokalizuota beta-kateninai. Farmakologinio gydymo arba su ličiu ar valproinės rūgšties ir molekulinės indukcija išgryninto kanoninės Wnt3a žymiai glaudesnio COX2 iRNR išraiška nuo dozės ir laiko priklausomu būdu. Serijos išbraukta iš 1,6 KBP COX2 promotoriaus fragmento ir gain- arba netekus funkcijos eksperimentų leido mums nustatyti minimalūs WNT /β-kateninai reaguoja regioną, kurį sudaro 0,8 KBP iš COX2 promotoriaus (pCOX2-0.8), kuri parodė maksimalų atsakymą genų-reporteris tyrimus. Šio pCOX2-0.8 promotoriaus regione aktyvumas buvo dar kartą patvirtino sait-mutagenezes ir DNR-baltymų privalomus tyrimus.

Išvados /Reikšmė

Galime daryti išvadą, kad pCOX2-0.8 minimalus rengėjas yra romanas funkcionalus T-ląstelių faktoriaus /limfoidinio stipriklis faktorius (TCF /LEF) ir atsako elementas (EE Svetainės II; -689 /-684), kad reaguoja tiesiogiai glaudesnio WNT /β-kateninai signalizacijos ir kurie gali būti svarbūs pasireiškimo /progresavimo GC

nurodomoji dalis:. Nuñez F Bravo "S Cruzat F Montecino M De Ferrari" G. (2011) WNT /β-kateninai Signalizacijos Pagerina ciklooksigenazę-2 (COX2) transkripcijos veikla Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 6 (4): e18562. Doi: 10,1371 /journal.pone.0018562

redaktorius: Moray Campbell Roswell Park vėžio instituto, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lapkričio 5, 2010; Priėmė: Kovo 11, 2011 m Paskelbta: Balandžio 6, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Nuñez et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė CTI-vėžys, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica Y TECNOLOGICA (CONICYT) dotacija skaičius PBCT-6 iš Čilės valdžia (MM ir GVD). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

skrandžio vėžys (GC) yra daugiaveiksnė liga, kuriai būdingas labai piktybiniais navikais į skrandžio gleivinę, ir atstovauja antrąją pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje labiausiai paplitęs Azijoje ir Pietų Amerikoje [1], [ ,,,0],2], [3]. Aplinkos susiję rizikos veiksniai yra mityba, uostomasis tabakas vartojimas, nutukimas ir Helicobacter pylori
infekcija [4]. Keli mutacijos naviku slopintuvas genų, įskaitant P53, adenomatozinio polipozės coli (APK), E-cad ir RUNX3 [3], [5], taip pat į onkogenų kaip K-RAS, HER2 ir beta-kateninai [3], [6], [7], buvo dokumentuojami GC. Be to, per išraiškos įvairių genų buvo dokumentuota, įskaitant WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], ir ciklooksigenazės 2 (COX2) fermentas, kuris katalizuoja lemiamą žingsnį prostaglandinų E2 gamybos, pagrindinis tarpininkas iš sąnarių uždegimas [10], [11].

Ji buvo pastebėta, kad COX2 geno ekspresija yra žymiai padidėjo žmogaus skrandžio adenokarcinoma audinių, kai, palyginti su suporuotas skrandžio gleivinės bandinių neturi vėžinių ląstelių [10 ]. Toks padidėjęs išraiška buvo siūloma įtakos invazijos, dydis, metastazių limfmazgiuose, naviko vystymąsi ir blogos prognozės [4] intensyvumą [12], [13]. Atsižvelgiant į tai, didelius duomenų kiekius apibūdinti Chemoterapija prevencinių ir vėžio aktyvumą nesteroidiniams vaistams nuo uždegimo (NVNU), įskaitant selektyviuosius COX2 inhibitorių, kaip potencialių gydymo GC [10], [11], [14].

Transkripcinis kontrolė COX2 geno priklauso nuo molekulinės mechanizmai, sąveikos su COX2 promotoriaus, kuri, atrodo, būti kontroliuojamas naudojant įvairius signaliniu keliu, [15], [16] veiklos, [17]. Iš tiesų, tai iš pradžių buvo nustatyta, kad CRE (-59 /-53) NF-IL6 (-132 /-124) ir NF-κB (-233 /-214) sutarimas sekų COX2 rengėjas buvo būtinos posakio genas [16]. Vėlesni funkciniai studijos COX2 rengėjas nustatė reguliavimo elementų, dalyvaujančių geno transkripcijos serija, įskaitant AP-1, Ap-2, SP-1, C /EBPβ [18], [19], [20] ir baltymų priklausanti T-ląstelių faktoriaus /limfinio stipriklis faktorius (TCF /LEF) šeimos transkripcijos veiksniai, kurie yra itin svarbūs WNT /β-kateninai signalo perdavime [21].

WNT /β-kateninai signalizacijos kelias plačiai pripažįstama kaip vaidina svarbų vaidmenį žmogaus ligos, ypač pradžios ir plėtros vėžio [22], [23], [24]. Įdomu tai, kad naujausi eksperimentai GC kilęs ląstelių parodė ryšį tarp COX2 saviraiškos ir į glikogensintazę kinazės 3β slopinimo (GSK3β) fermentų [25], kuris yra pagrindinis WNT komponentas, kuris fosforilina ß-kateninai ir skatina jos tolesnį skilimą per proteosomos [26]. Tarp WNT /beta-kateninai ir COX2 išraiškos santykiai įvairiose vėžio ląstelių modelių toliau remiama iš šių tyrimų. Pirma, ji buvo pastebėta tešmens epitelį, kad WNT /β-kateninai vaidina netiesioginį poveikį COX2 transkripcijos, kurios galėtų būti tarpininkaujant iki reguliavimą tarpininko faktoriaus PEA3 [27]. Antra, priešingai nei netiesioginio veikimo būdą, Araki ir stulpeliai. [21] pranešė, kad storosios žarnos vėžinių ląstelių yra per COX2 raiškos indukcijos per β-kateninai /TCF priklausomo mechanizmą ir iš dalies pasižymi labai sutarimas TCF /LEF jungimosi vieta (EE: pagrindinė CTTTG) pastatytas 1079 BP srovę nuo transkripcijos pradžios svetainės į COX2 rengėjas. Trečia, buvo pastebėta, kad storosios žarnos vėžiu sergantiems pacientams ir jų ląstelių linijų yra tarp raiškos iš WNT kelią susijusių baltymų LEF-1 ir Pontin52 /TIP49a ir up-reguliavimo COX2 išraiška [28] asociacija. Galiausiai, naudojant chondrocitai, buvo įrodyta, kad LEF-1 kartu su beta-kateninai, reguliuojama COX2 raiškos tiesiogine privalomas iš LEF-1 /β-kateninai kompleksas prie 3'UTR regione COX2 genomo lokuso [29] , Todėl šiuo metu nėra aiškaus vaizdo, ar WNT signalizacijos dalyvauja COX2 genų ekspresiją, arba kaip jos vaidmenį GC pasireiškimo /progresavimą. Čia mes siekėme suprasti, ar yra tiesioginis reguliavimas COX2 genų ekspresiją per WNT /β-kateninai signalizacijos ir nustatyti WNT /β-kateninai reguliavimo elementus promotoriaus regione COX2 geno, kuris gali upregulate COX2 rašybą GC ląsteles.

medžiagos ir metodai

elementų ir auginimo sąlygos

Žmogaus ląstelių linijos MKN45 (japonų rinkimas tyrimų Bioresources, Japonija), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 ir HEK293 (Amerikos tipas kultūra rinkimas; Rokvilis, MD) buvo naudojami šiame tyrime. MKN45, N87, SNU1 ir KATOIII ląstelės buvo auginamos rmpi žiniasklaidos (Gibco); AGS į F12K terpės (Hyclone); WI38 į EMEM (Lanksčiai); ir HEK293 DMEM (Gibco). Kultūra žiniasklaida buvo papildytas 10% FBS (Gibco) (AGS 20%) ir 1% penicilinui /streptomicino. Mobilaus ryšio linijų buvo palaikoma 37 ° C 5% CO _{2 ir prisotinta drėgmės.}

plazmidės ir svetainės nukreiptas mutageninis

SuperTOPFlash-liuciferazė ir PRL-TK renilla- liuciferazės plazmidės [30], sudėtinė aktyvus β-kateninai (S33Y) [31] ir dominuojanti neigiami ΔTCF4 plazmidės [32] buvo aprašyta anksčiau. Chimerinis COX2 promotorius-liuciferazės fragmentai buvo sukurtas PGR metodu iš žmogaus genomo DNR naudojant specifinius pradmenis, kurių sudėtyje yra restrikcijos vietas ir vėliau įterptas į pGL3-Pagrindinė vektoriaus (Promega). Į TBE-II vietos (-689 /-684) iš COX2 promotoriaus mutacijos buvo sukurta naudojant pradmenis pCOX-0,8-TBEMUT su QuickChange sait-mutagesis Kit (Stratagene). Konstruktai buvo patikrinti per tiesioginę seką (ABI-3130 Genetinis analizatorius, Applied Biosystems). Gruntai sekos yra aprašyta S1 lentelėje.

pusiau kiekybiniai testo ir realaus laiko PGR

Viso RNR išskirta į RNaze laisvųjų sąlygomis naudojant TRIZOL (INVITROGEN) ir 2 mikrogramų RNR buvo atvirkštinis transkripcija 200 U viršuje II atvirkštinės transkriptazės (AT) (Invitrogen), naudojant 500 ng oligo (dT) pradmenis. Eksperimentinis nustatymas COX2, c-myc ir CCND1 mRNR lygiais buvo atlikta pagal [33]. Trumpai tariant, kDNR buvo atliktas realiojo laiko PGR į iCycler iQ sistemos (Bio-Rad Laboratories). Kiekvienas 25 mikrol reakcija tūris yra 1 vienetas Platinum Taq DNR polimerazės (Invitrogen), 1x reakcija buferio (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, ir 50 mm KCl), 1,5 mm MgCl _{2, 2,5 mikrogramų BSA 0,01% Glicerolio 200 mkm iš dNTP, 0.3X SYBR Žalioji tirpalo ir 0,4 mkm konkrečių gruntams (žr lentelę S1). buvo nustatyti PGR sąlygos taip: 90 sekundžių 94 ° C temperatūroje, o po to 30 ciklai 30 sekundžių 94 ° C temperatūroje, 30 sekundžių 62 ° C ir 30 sekundžių 72 ° C temperatūroje. Visos nepageidaujamos reakcijos buvo atliekamas trimis egzemplioriais ir gauti kiekvieno geno rezultatai buvo standartizuoti, gautų kartu su beta-aktino. RNR ir PGR produktų kokybė buvo stebima eksperimentų per elektroforezės 1% agarozės gelyje, tamsintas su etidžio bromido.}

Įsiurbimo iš WNT /β-kateninai signalinio kelio

WNT signalizacijos buvo farmakologiškai sukeltas MKN45 pasėtų ląstelių į 6 šulinėlių auginimo plokštėmis 80-90% santakoje (ty 1, 2, 4 ir 8 h inkubacijos) arba su 10-20 mm LiCl (Sigma) arba 5-10 mM valproinės rūgšties (VA; Sigma), kaip buvo aprašyta anksčiau [34], [35]. Tada ląstelės buvo renkami iRNR gavybos ir realaus laiko PGR nustatymo, kaip aprašyta aukščiau. Panašiai, MKN45 ląstelės buvo stimuliuojama 2 valandas su 200 ir 400 ng /ml išgryninto Wnt3a baltymų. Valymas Wnt3a buvo atliktas taip, kaip aprašyta [36].

Transkripcinis veikla COX2 rengėjo

Veiklų iš COX2 rengėjas buvo matuojamas 80-90% susiliejantis MKN45, AGS, WI38 ir HEK293 ląstelės sėjamos 6 gerai kultūros plokščių. Trumpai tariant, ląstelės buvo bendrai perkeltų naudojant FUGENE (Roche) už 24 su pCOX2-liuciferazės arba pSuperTOPFlash žurnalistais ir arba steigiamojo aktyvaus beta-kateninai (S33Y) [31] arba dominuojančios neigiamas ΔTCF4 [32] konstruoja. PRL-TK renilla liuciferazės plazmidė buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. "Firefly ir renilla liuciferazės veikla buvo nustatoma naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą (PROMEGA) A Viktoras-3 daugiaplokštėmis skaitymo priemonę (Perkin Elmer), kaip aprašyta anksčiau [30]. Santykiniai liuciferazės veikla buvo išreikšta dalijant Firefly liuciferazės veiklą su renilla liuciferazės veiklos kiekvieno mėginio (n = 3, kiekvieno trimis egzemplioriais).

chromatino Imunoprecipitacijos (Chip) tyrimai

Chip tyrimai buvo atlikti MKN45 ląstelės, kaip aprašyta anksčiau [37]. Branduolinės beta-kateninai frakcija turi arba TBE Sklypai I, II, III ar IV žmogaus COX2 rengėjas buvo immunoprecipitated su anti β-kateninai antikūnų (Santa Cruz) ir įvertino realaus laiko PGR naudojant specifinius pradmenis (lentelė S1) , Be to, RNR polimerazės II (Pol-II) ir acetilinti Histonas H3 ir H4 (H3ac ir H4ac) frakcija turi arba TBE-II regione (-793 /-594) arba proksimalinės regione (-118 /+ 62 ) iš COX2 rengėjas buvo panašiai vertinama (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac ir H4ac, Šiaurinė). Kaip teigiamą kontrolę mes panaudojome C-myc GBT puslapį [38]. Antikūnų specifiškumas buvo tirta su normaliu triušio IgG (Santa Cruz).

elektroforeziniai mobilumas perėjimas analizė (EJSA)

EJSA buvo atliekama naudojant oligonukleotidai, kurių sudėtyje yra arba laukinio tipo COX2 TBE-II sutarimo seka (žr lentelę S1) arba kuriuos buvo pranešta anksčiau mutantas TBE sekas [39]. Trumpai tariant, laukinio tipo ir mutavęs ^{32P-žymėtųjų oligonukleotidų buvo inkubuojami į privalomas buferį su branduolinių ekstraktų MKN-45 ląstelių 30 min 30 ° C temperatūroje. Vėliau, DNR-baltymų kompleksai buvo atskirtos nuo laisvųjų oligonukleotidų 5% ne denatūravimo poliakrilamido gelyje. Po to, kai elektroforezės gelis buvo džiovinti, ir veikiami Meniniais 1 dieną. Radioaktyviųjų juostų vizualizavimo buvo analizuojami autoradiografiją. Įrišimas specifiškumas buvo tikrinami inkubacijai DNR-baltymų kompleksų An Neženklinto laukinio tipo viršija buvimo ar mutavo oligonukleotidai [21], [39].}

Statistinė analizė

Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent tris kartus su trimis kopijomis. Duomenys parodė, kaip vidurkis ± SD. Keli grupės palyginimai buvo atliekami vieną pusę ANOVA naudojant Statistica 9.0 "programinę įrangą. P
. ≪ 0,05 buvo laikomas reikšminga

Rezultatai

COX2 išraiška koreliuoja su branduolinių β-kateninai lygių GC ląstelių

iš pradžių nustatytų išraiška lygiai COX2 mRNR į žmogiškąjį GC ląstelių linijų MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII ir AGS [40], [41], [42], taip pat WI38 fibroblastų čia naudojamas kaip kontrolinės ląstelių linijos [43], nagrinėjant ar jie koreliuoja su WNT /β-kateninai signalizacijos. Kaip pavaizduota 1 paveiksle, buvo pastebėta stiprūs lygiai COX2 išraiškos kaip anksčiau kaip 26 ciklų PGR amplifikacijos metastazinių ląstelių linijų MKN45, SNU16 ir KATOIII, ir taip pat į AGS ląstelių linija, kuri yra gauta iš pirminio naviko. Šis rezultatas yra susitarusi su anksčiau nustatytais MKN45, KATOIII ir AGS ląstelių COX2 ekspresijos lygį [44], [45], [46]. Priešingai, COX2 iRNR kiekis buvo arba labai mažai WI38 fibroblastų arba neaptinkama N87 ir SNU1 ląstelių (1a paveikslas), o tai rodo, kad šis skirtumas modelio išraiška nėra susijęs su metastazavusiu etapais ar ląstelių transformacijos lygį. Nuostabiausia, branduolinės β-kateninai koncentracija buvo glaudžiai susijusi su COX2 išraiška, nes didelis baltymų buvo pastebėtas MKN45, AGS, SNU16 ir KATOIII ląstelių, lyginant su N87, SNU1 ir WI38 ląstelių (1b paveikslas), o tai reiškia, vaidmenį WNT signalizacijos COX2 iRNR raiškos GC ląsteles.

didinimas COX2 išraiška per WNT /beta-kateninai signalizacijos

siekiant ištirti, ar WNT kaskados dalyvauja COX2 išraiškos, MKN45 ląstelės buvo farmakologiškai skatino skirtingais laiko periodais (ty 1, 2, 4 ir 8 h) arba ličio (LiCl) arba valproinės rūgšties (VA), nes abu vaistai buvo anksčiau įrodyta, kad moduliuoti WNT impulso perdavimui per slopinimo GSK3β aktyvumo ir tokiu būdu padidinant branduolinės lygiai beta-kateninai [34], [35]. Įdomu tai, mes nustatėme reikšmingą stiprinimą COX2 išraiškos sukeltas 10-20 mM LiCl arba 5-10 mM VA, kuris prasidėjo netrukus po inkubacijos su junginių ir jos ypač išaugo po dviejų valandų nuo gydymo (2a pav.) Realaus laiko nustatymas COX2 iRNR lygiui MKN45 ląstelių gydomi panašiai kaip su LiCl arba VA (2 val) nurodė, kad COX2 buvo žymiai iki reguliuojama (2B pav) ir, kad šis poveikis buvo lygiagrečiai su pavaizduoto užregistruotą WNT /β-kateninai tikslinių genų c-MYC [47] ir cikloniniai D1 [48]. Be to, siekiant paneigti galimybę, kad stebimas reiškinys atspindi ne konkrečių narkotikų poveikis veikiančių baltymų, turinčių įtakos skirtingos signalizacijos kaskadomis, mes tiesiogiai taikomas visiškai funkcionalią išgrynintas Wnt3a baltymų MKN45 ląstelių (žr metodus). Šie eksperimentai aiškiai parodė, kad 200-400 ng /ml išgryninto Wnt3a žymiai glaudesnio COX2 iRNR išraiškos po trumpų laikotarpių inkubacijos (2 paveikslas), iš dalies paaiškinti spartų poveikį LiCl ir VA ir remti tiesioginį ryšį tarp kanoninės WNT /beta-kateninai aktyvavimo ir stimuliacija COX-2 rašybą GC ląsteles.

Cheminės naujų erkinio encefalito vietų į COX2 genų

promotoriaus Ankstesni tyrimai parodė, kad WNT /β-kateninai reaguoja EE svetainė ( sutarimas šerdis: CTTTG) yra įsikūręs -1079 /-1,074 bp tiekėjų iš transkripcijos starto vietoje (TSS) žmogaus COX2 geno [21] (Svetainės IV; 3A pav, taip pat žr S1 paveikslą). Daugiau nuskaitymas iš 1600 bp tiekėjų seka iš PSD [49] leido mums nustatyti 3 naujus tariamą TBE svetaines: -877 /-872 BP (Svetainės III; jausmą orientacijos), -689 /-684 bp ir -318 /-313 bp (Sklypai II ir I atitinkamai; tiek antiprasmio orientacijos) (3A pav), kuris yra nekonservatyvius tarp žmogaus ir graužikų COX2 genų (S1 pav). Todėl mes klonuotas į 1600 bp segmentą iš žmogaus COX2 promotoriaus (pCOX2), įskaitant visus keturis TBE susirgimo vietų, į pGL3-pagrindinis vektoriaus, kondensuotą su liuciferazės geno būti vėliau panaudoti reporteris tyrimai (3A pav). Pažymėtina, lygiagrečiai transfekcijq 10 ng šio konstrukto MKN-45 ir HEK293 ląstelės atskleidė, kad pCOX2 rodomas reikšmingą didesnį (9 kartus) bazinio promotoriaus aktyvumą MKN45 ląstelių (3b ir C pav.) Mes iškėlė hipotezę, kad šis didesnis pCOX2 bazinio rengėjas veikla gali būti susijęs su padidėjusiu turinį branduolinės beta-kateninai šioje GC ląstelių linijos (1b pav.) Taigi, MKN45 ir HEK293 ląstelės buvo bendrai perkeltų su pCOX2 į mažesnių dozių per steigiamąjį aktyvaus β-kateninai baltymų (S33Y) [31] buvimą. Kaip pastebėjo 3 paveiksle, pCOX2 veikla iš tiesų buvo sustiprintas abiejų tipų ląstelių, o tai rodo, kad ß-kateninai gali įpareigoti ir tada aktyvuoti TCF /LEF transkripcijos faktorius ne funkcinių TBE svetainėse pCOX2 promotoriaus.

įnašas erkinio encefalito svetainės į COX2 promotoriaus veiklos GC ląstelių

Jei perpjauti į WNT /β-kateninai reaguoja TBE svetainių įnašas nuo transkripcijos veiklos COX2 rengėjas buvo sukurtas keturių pCOX2 delecijas konstruktai: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); ir pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (4A pav.) Šie konstruktai vėliau buvo tiriami jų veiklos per pereinamųjų transfekcija į MKN45 ir AGS ląsteles, naudojant WI38 fibroblastus kaip kontrolinės ląstelių linija. Suderinamas su endogeninių COX2 ekspresijos lygį šiose GC ląstelių linijas (1a paveikslas), pCOX2 išbrauktas išlaikė skirtingą veiklą MKN45 ir AGS ląstelių (4b ir C pav.) Priešingai, ne promotorius veikla buvo aptikta WI38 fibroblastų (4d pav), net tada, kai transfekciją dozės šių ląstelių buvo padidintos 8 kartus (t.y. 50-400 ng) (S2 pav). Svarbu, susitarusi su ankstesnėmis ataskaitomis [50], WI38 ląstelės efektyviai išreiškė liuciferazė-reporteris konstruktą, kuriame yra apie p21 geno (S2 paveikslas) rengėją, nurodydamas, kad šių kontrolinių ląstelių molekulinės mašinos, atsakingas už skatinančius COX2 transkripcija yra neaktyvus , Daugiau eksperimentai parodė, kad transfekcijq į MKN45 ir AGS ląsteles su pCOX2-0.8 konstruktą, kuris turi 859 bp išbrauktas iš 1.6 Kb pCOX2 reporteris (4a paveikslas), lėmė reikšmingą padidėjimą promotoriaus veiklos, palyginti su pCOX2-1.2 reporteris (pav 4A-C). Kaip buvo pastebėta jokių reikšmingų skirtumų tarp 1,6 Kb pCOX2 ir pCOX2-1.2 konstruktų (S3 pav), mes neatliko toliau analizuoja su didesniu konstruktą. Svarbu tai, kad pCOX2-0.8 atstovavo minimalaus dydžio promotoriaus fragmentas eksponuoti didžiausią bazinio veikla, kadangi toliau naikinti arba 159 arba 370 bp iš 5'-gale, kaip yra šiuo atveju su pCOX2-0.65 ar pCOX2-0.4 konstruktai, atitinkamai sumažėjo daugiau nei 2 kartus su pCOX2 baziniu veiklos lygį. Šie rezultatai rodo, kad regionas, apimantis tarp 0,8 ir 0,65 KBP prieš srovę nuo COX2 geno PSD, ir kuri apima romanas EE reagavimo elementas (EE Svetainės II; -689 /-684), gali būti esminis reguliavimo metu bazinis lygis COX2 genų ekspresijos GC ląsteles.

ląstelę pCOX2-0.8 per WNT /beta-kateninai signalizacijos

kitas išnagrinėjo WNT /β-kateninai signalizacijos poveikį ne romano EE Svetainės II. Mes perkeltų MKN45 ląsteles su pCOX2-0.8 reporteris konstrukcija ir bendrai išreiškė steigiamasis aktyviai β-kateninai S33Y baltymų pažymėdama, kad ten buvo reikšmingas (2 kartus) stiprinimas transkripcijos veiklos pCOX2-0.8. Tai β-kateninai tarpininkaujant augimas buvo specifinis, nes pCOX2-0.4 konstruktas nebuvo skatinami šio beta-kateninai per išraiškos būklės (5a pav ir B). Kontroliuoti ir WNT /β-kateninai signalizacijos MKN45 ląstelių mes panaudojome WNT /β-kateninai reaguoja SuperTOPFLASH (STF) Reportažai, vežančių 12 kopijų TBE kartu [32], kuris buvo pernešta atskirai arba iš plazmidžių kodavimo akivaizdoje už mutantas β-kateninai S33Y baltymų. Įdomu, o bendrai išraiška su mutantas β-kateninai S33Y baltymų MKN45 ląstelių pavyko padidinti (1,9 karto) į STF reporteris veikla, aukšto lygio baziniu STF veiklos buvo aptikta mutantas beta-kateninai nėra (5c pav.) Šis rezultatas yra susitarusi su mūsų ankstesnių išvadų aukšto lygio endogeninio branduolinės beta-kateninai šioje ląstelių tipo (žr 1b paveiksle), ir patvirtina, kad ši atominė veiksnys yra funkcionalus. Siekiant dar labiau patvirtina šią išvadą, mes atliekame vienodus eksperimentus HEK293 ląstelių ir gavo iš esmės panašius rezultatus, nors šiuo atveju buvo gautas aiškus dozės ir atsako kreivės, kai pCOX2-0.8 buvo pernešta į Didinamos koncentracijos constitutively aktyvaus beta-kateninai S33Y akivaizdoje baltymas (S4 pav.) Be to, mes nustatėme, kad STF veikla HEK293 ląstelių buvo labai reaguoja į egzogeninės mutantas beta-kateninai (S4C paveikslas) lygių.

Jei toliau tirti į WNT /β-kateninai keliu poveikį veiklos iš pCOX2-0.8 mes atlikome netekus funkcijos eksperimentus su dominuojančia neigiamas TCF4 (ΔTCF) statyti, kuris koduoja transkripcijos veiksnio trūksta 30 likučius iš savo amino-galo ir kad negali įpareigoti ß-kateninai [32] , Mes nustatėme, kad MKN45 ląstelės ΔTCF išraiška sumažino aukštą pCOX2-0.8 baziniu transkripcijos dozės priklausomu būdu (5d pav.) Šis rezultatas patvirtina esminį TCF /LEF transkripcijos veiksnių tarp nuo pCOX2-0.8 promotoriaus sekos veiklos reguliavimo, ir toliau palaiko idėją, kad erkinis encefalitas Svetainės II (-689 /-684) dalyvauja reaguojant į WNT /β-kateninai signalizacijos.

Galiausiai, siekiant tiesiogiai spręsti apie TBE svetainės II vaidmenį WNT /β-kateninai tarpininkaujant reguliavimo COX2 promotoriaus, mes pristatėme sait-mutagenezes pakeisti 2 raktu nukleotidai konsensuso seka EE Svetainės II branduolys (ty pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Šie pakeitimai buvo parodyta anksčiau panaikinti WNT /β-kateninai-tarpininkaujant transkripcijos [39]. Transient transfekciją tyrimai parodė, kad mutacija TBE Svetainės II ženkliai sumažėjo (2-3 kartus) bazinio veikla pCOX2-0.8 statyti į MKN45 ląstelių (5e paveikslas), lyginant su laukinio tipo pCOX2-0.8 promotoriaus konstruktą. Be to, suderinus su mūsų ankstesniais rezultatais, mutacija šio TBE svetainėje II beveik visiškai blokavo β-kateninai tarpininkaujant stiprinimas pCOX2-0.8 konstrukto (S4 pav.) Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad erkinis encefalitas Svetainės II (-689 /-684) yra funkcinis komponentas COX2 genų transkripcijos reguliavimo.

β-kateninai jungiasi prie COX2 geno promotoriaus regione, kuriame yra GBT Svetainės II

Kadangi transkripciškai aktyvus raumeningumo ir chromatino struktūros atspindi padidėjusi lygio Histonas acetilinimo [51], mes nusodinti tinklinės struktūros chromatino fragmentai (vidutinis dydis 300-500 bp), išskirtų iš MKN45 ląstelių per polikloniniq antikūnus specifinis už acetilintu Histonas H3 ir H4. Be to, mes nustatėme, rišimosi RNR polimerazės II (Pol II), kaip parametro paprastai susijusios su transkripcijos veiklos. Mes išnagrinėjo mūsų nuosėdų dviejų promotoriaus sekų sodrinimą: proksimalinio rengėjas (PP) regioną (-118 /+ 62 nuo TSS) ir distalines (-793 /-594), kad COX2 promotoriaus, kurioje yra sutariama GBT Svetainės II ( -689 /-684). Visų pirma, EE Svetainės II buvo skirta, nes ankstesni eksperimentai parodė, lengvatinis privalomas beta-kateninai šį promotoriaus regione (S5 pav.) Kaip teigiamą kontrolę, mes įvertino privalomas tuo TBE svetainėje atsižvelgiant į c-MYC geno (-1447 /-1,144 nuo TSS), kuri anksčiau buvo aprašyta gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse [38] promotoriaus.

ACETILIUOTAS Histonas H3 ir H4, ir Polimerase II fermentas buvo nustatyta, kad jungiasi per proksimalinės promotoriaus regione (6a pav), nurodant, kad chromatino struktūra aplink COX2 promotoriaus ir MKN45 ląstelių yra atviros raumeningumo, todėl susitarus su mūsų ankstesni rezultatai rodo, kad COX2 genas yra aktyviai perrašymo. Pažymėtina, kad β-kateninai baltymas immunoprecipitated iš MKN45 mėginių dažniausiai kartu su promotoriaus regione aprėpiančių -684 /-689 GBT seką į COX2 geno (6B pav.) Šis veiksnys buvo beveik neaptinkama proksimalinio promotoriaus regione, rodo, kad endogeninė atominės β-kateninai pirmiausia įdarbinami į TBE Svetainės II šių ​​GC ląsteles. Kaip ir tikėtasi, endogeninė β-kateninai buvo panašiai privalo c-myc rengėjas TBE svetainėje, tokio lygio, kad yra panašios į stebimas COX2 geno promotoriaus (6c pav.)

Bendrai, šie eksperimentai rodo, kad EE Svetainės II yra tiesiogiai įtraukti į β-kateninai tarpininkaujant transkripcijos aktyvavimo COX2 rengėjas. Siekiant dar labiau patvirtinti šiuos rezultatus mes atliekame elektroforezės mobilumas pamainos tyrimai (EMSA) į branduolinės ekstraktų MKN45 ląsteles. Šiam tikslui mes pasirengę 34, pagrįstus-suporuotas oligonukleotidai; vienas, kuriame yra laukinio tipo -689 /-684 EE Svetainės II seka (ty CTACAAAGA; liekanos pabrėžė atstovaujanti Core), ir du oligonukleotidai, kurių sudėtyje yra missense mutacijas arba tos TBE Svetainės II branduolys (ty CTACGAGGA: TBE-MUT1) arba į šoninio seka (ty CGCCAAAGA: TBE-MUT2), kaip buvo pranešta anksčiau [21], [39]. Kaip parodyta 6D paveiksle, radioaktyvaus laukinio tipo EE zondas galėjo suformuoti atsilikusių DNR baltymų kompleksai, kai inkubuojami su branduolinių ištraukas MKN45 ląsteles. Šie baltymai-DNR kompleksai buvo individuali, kadangi skyrimu, šalto laukinio tipo oligonukleotidų (50 kartų) viršija papildymas smarkiai slopino DNR-baltymų komplekso (pav 6D, Lane 3 ir 4, atitinkamai) išsidėstymą. Mutantas, radioaktyviai žymėtojo preparato TBE-MUT1 zondas buvo negali nei sudaro DNR-baltymų kompleksų savo, nei konkuruoti su laukinio tipo oligonukleotido, kai papildomas viršija kaip šaltas zondo (pav 6D, 5 takelis ir 6, atitinkamai). Panašūs rezultatai buvo gauti, kai antrojo šaltas TBE-MUT2 zondas buvo naudojamas kaip konkurentu (pav 6D, Lane 7). Iš viso, šie rezultatai rodo, kad romanas EE Svetainės II į COX2 rengėjo dalyvauja transkripcijos aktyvavimo COX2 geno įdarbinant mašinas, atsakingą už transdukciją WNT /β-kateninai signalizacijos (6e pav.)

Diskusijos

Ankstesni tyrimai pasiūlė vaidmenį WNT /β-kateninai signalizacijos metu pradžios ir /ar plėtoti įvairių rūšių vėžio per moduliuoja į COX2 geno [25] išraiška. Šiame darbe mes pateikti svarių įrodymų, patvirtinančių tiesioginį vaidmenį WNT /β-kateninai signalizacijos į COX2 išraiškos kontrolės GC ląsteles. Pirma, mes parodė, kad yra stora koreliacija tarp COX2 saviraiškos ir branduolinės turinio beta-kateninai, kuri, atrodo, yra nepriklausomi nuo bet kurios piktybinių auglių ar transformacijos būklės CG ląsteles. Antra, laiko ir priklauso nuo dozės didinimas COX2 išraiška buvo pastebėtas netrukus po indukcijos (2 h) arba farmakologinių junginių imituoja WNT /β-kateninai signalizacijos. Trečia, genų Reporter tyrimai vertinantys COX2 promotoriaus aktyvumą reaguojant į gain- ir netekus funkcijos eksperimentai, įskaitant constitutively aktyvaus β-kateninai baltymų ir dominuojančia neigiamas TCF4 transkripcijos veiksnio, rodo, kad WNT /β-kateninai komponentai dalyvauja transkripcijos reguliavimas COX2 geno

Mes taip pat parodė, kad čia per 2 KBP prieš žmogaus COX2 rengėjas yra keturi spėjamas TBE svetainėse. (branduolys: CTTTG), vienas iš kurių buvo anksčiau studijavo Araki ir stulpeliai [21], [28]. Per genų reporteris tyrimų su skirtingus pCOX2 išbraukta konstruktų mes parodėme, kad pCOX2-0.8 rodomas aukščiausią bazinę transkripcijos veiklą GC ląstelių MKN45 ir AGS. Įdomu tai, kad pCOX2-0.8 išlaikė GBT Svetainės II (-689 /-684) vientisumą nurodant savo pagrindinį indėlį į transkripcijos veiklos COX2 genų reguliavimo. Pažymėtina, kad visiškai pCOX2 EE Svetainės II parašas (t 5'-WWCAAAGS-3 "; S = C /G; W = A /T), panaši į optimalų TCF puslapį aprašytą van de Wetering ir stulpeliai. [52], kuris vėliau buvo naudojamas nustatyti tikras WNT-transkripcijos tikslus Drosophila
genų NKD parsisiųsti ir CG6234
[53].

funkcionalumas šio TBE Svetainės II taip pat buvo patvirtinta mūsų mutagenezes studijas. Taigi, kai mes mutavo į TBE-parašo seka į pCOX2-0.8 konstrukto (MpCOX2-0.8), buvo nustatyta, kad bazinis COX2 rengėjas veikla buvo reikšmingai paveikta MKN45 ląsteles. Be to mūsų lusto ir EJSA analizė patvirtino, kad β-kateninai yra pirmenybė įdarbino prie -689 /-684 COX2 promotoriaus regione GC ląstelių lygyje, panašus, kad rasti c-myc rengėjas [38]. Tokia sąveika pirmenybė atsiranda dėl šioje COX2 geno promotoriaus regione kaip ne β-kateninai yra nustatyta, kad jungiasi prie proksimalinio promotoriaus regione COX2 geno. Iš viso šie rezultatai rodo, kad erkinis encefalitas Svetainės II funkcinė WNT /β-kateninai reaguoja elementas žmogaus COX2 rengėjas. Mūsų duomenys, nepaisant to, neatmeta kitų genomo regionų indėlį į žmogaus COX2 geno [21]. Vietoj to, mes siūlome, kad GC ląstelių sudėtingas interneto sąveikos būna kur EE Svetainės II bendradarbiauja su kitomis reagavimo elementų į viršų reguliuoti COX2 išraiška.

Kadangi mūsų rezultatai GC ląstelių yra susitarusi su tais, pranešė gaubtinės žarnos vėžio ląstelių, tai norisi spėlioti, kad WNT /β-kateninai signalizacijos gali būti panašiai dalyvauja COX2 reguliavimo kitų navikų [21], [28]. Iš tiesų, nuo vidutinio iki stiprių proteino lygio beta-kateninai galima pastebėti maždaug 72% visų analizuotų Žmogaus Atlas Baltymai audinių duomenų bazę [54] vėžiu. Be to, stiprus, vidutinio citoplazmos COX2 dažymo ir kartais membraninis reaktyvumas yra stebimas 50% visų vėžio atvejų, įskaitant žarnos, prostatos, gimdos kaklelio, gimdos gleivinės, urotelinis, kasos, kepenų ir liaukų ląstelių iš skrandžio naviko audinyje.

• PLoS ONE: MicroRNA Tegul-7f slopina auglio invazija ir metastazes nukreipiant MYH9 žmogiškųjų skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Sonic the Hedgehog Kelias yra būtina priežiūra vėžio kamieninių ląstelių Kaip žmogaus skrandžio Cancer