Абстрактный
Фон
<р> повышенная экспрессия циклооксигеназы-2 фермента (COX2) является одной из основных характеристик рака желудка (GC), которая является ведущей причиной смерти в мире, особенно в Азии и Южной Америке. Хотя передача сигналов /β-катенин путь Wnt участвует в активации транскрипции гена COX2, точный механизм модулирования этот ответ до сих пор неизвестна.
Финансирование:. Эта работа была поддержана CTI-Раке, Programa Bicentenario ан Ciencia у Tecnología (PBCT) - Comisión Насиональ де Investigación Cientifica у Tecnologica (НКНТИ) номер гранта PBCT-6 от чилийского правительства (ММ и ДГС). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение материалы и методы Клетки и условия культивирования Индукция /β-катенина сигнального пути Wnt Активность промотора COX2 измеряли в 80-90% сливающийся MKN45, AGS, WI38 и HEK293 клетки высевают в 6-луночные культуральные планшеты. В кратком изложении, клетки совместно трансфицируют с использованием Fugene (Roche) в течение 24 с pCOX2-люциферазы или репортеров pSuperTOPFlash и либо конститутивной активного бета-катенина (S33Y) [31] или доминантно-негативного ΔTCF4 [32] конструктов. Рениллы люциферазы плазмида PRL-ТК был использован в качестве внутреннего контроля. Firefly и рениллы люциферазные деятельность определяли с использованием Dual-люциферазы анализа (Promega) в Victor-3 читателя многодисковое инструмента (Perkin Elmer), как описано ранее [30]. Относительная люциферазные деятельность выражается путем деления светлячка активности люциферазы с рениллы активности люциферазы для каждого образца (N = 3, каждый в трех экземплярах). Результаты выражение COX2 коррелирует с ядерными уровнями β-катенина в клетках GC Усиление экспрессии COX2 через Wnt /-катенина сигнализации Идентификация новых сайтов КЭ в промотор гена Предыдущие исследования показали, что /β-катенин сайт отзывчивым КЭ Wnt ( консенсуса ядро: CTTTG) расположен в -1079 /-1,074 б.п. вверх по течению от сайта инициации транскрипции (TSS) человеческого гена COX2 [21] (сайт IV; Рисунок 3А, смотри также рисунок S1). Дальнейшее сканирование входной последовательности 1600 пар оснований из TSS [49] позволило нам определить 3 новых предполагаемых сайтов КЭ: -877 /-872 п.н. (Site III; чувство ориентации), -689 /-684 п.н. и -318 /-313 п.н. (Сайты II и I, соответственно, и в антисмысловой ориентации) (рис 3А), которые не сохраняются между человеческим и мышиным генов COX2 (рис S1). Поэтому мы клонировали сегментировать 1600 пар оснований из промотора человеческого СОХ2 (pCOX2), в том числе всех четырех участков КЭ, в pGL3-основной вектор, слитый с геном люциферазы, которые будут использоваться в дальнейшем в репортерных анализах (фиг.3А). Примечательно, что параллельно трансфекцию 10 нг этой конструкции в MKN-45 и НЕК293 показали, что pCOX2 отображается значительное выше (9 раз) базальную активность промотора в MKN45 клетках (фигура 3В и С). Мы предположили, что эта более высокая активность промотора pCOX2 базально может быть связано с повышенным содержанием ядерного бета-катенина в этой клеточной линии ГХ (Фиг.1В). Следовательно, MKN45 и HEK293-клетки совместно трансфицируют pCOX2 в присутствии более низких доз конститутивного активного белка β-катенина (S33Y) [31]. Как отмечено на рисунке 3, pCOX2 активность действительно усиливается в обоих типах клеток, предполагая, что бета-катенин может связываться, а затем активировать TCF /LEF транскрипционные факторы на функциональных сайтах КЭ в промоторе pCOX2. Положительная регуляция pCOX2-0.8 через Wnt /-катенина сигнализации Предыдущие исследования предложили роль Wnt сигнализации /β-катенина во время начала и /или развитие различных видов рака с помощью модуляции экспрессии гена COX2 [25]. В этой работе мы представили убедительные доказательства, поддерживающий непосредственную роль Wnt сигнализации /β-катенина в контроле экспрессии COX2 в GC клетки. Во-первых, мы показали, что существует тесная связь между выражением COX2 и ядерного содержания бета-катенина, который, кажется, не зависит от любой злокачественной опухоли или состояния трансформации клеток CG. Во-вторых, наблюдалась затрат времени и зависимое от дозы усиление экспрессии COX2 вскоре после индукции (2 ч) с фармакологические соединений, имитирующих Wnt сигнализации /β-катенина. В-третьих, ген-репортер анализы, оценивающие активность СОХ2 промотора в ответ на нелегальная вырубка и с потерей функции экспериментов, в том числе конститутивно активного белка β-катенина и доминантного негативного фактора транскрипции Tcf4, показывают, что компоненты /β-катенин Wnt участвуют в регуляция транскрипции гена COX2
<р> рак желудка (GC) представляет собой многофакторное заболевание, характеризуемое злокачественные новообразования в слизистой оболочке желудка, и представляет собой второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире с самым высоким уровнем распространенности в Азии и Южной Америке [1], [ ,,,0],2], [3]. Экологические связанные факторы риска включают диету, потребление нюхательного, ожирение и хеликобактерной
инфекции [4]. Некоторые мутации в генах опухолевых супрессоров, в том числе P53, аденоматозный полипоз coli (APC), E-кадгерина и RUNX3 [3], [5], а также в онкогенов, как K-Ras, HER2 и бета-катенина [3], [6], [7], были зарегистрированы в GC. Кроме того, более экспрессии различных генов было документально подтверждено, в том числе WNT2B [8], ТС1 (C8orf4) [9], а также циклооксигеназы 2 (COX2) фермент, который катализирует важный шаг в производстве простагландина Е2, который является ключевым медиатором воспаления суставов [10], [11]
. <р> было обнаружено, что экспрессия гена COX2 значительно увеличивается в желудочных тканях аденокарциномы человека, по сравнению с парными образцами слизистой оболочки желудка, лишенной раковых клеток [10 ]. Такое увеличение экспрессии было предложено, чтобы повлиять на интенсивность вторжения, размер, метастазов в лимфоузлах, развитие опухолей и плохим прогнозом [4], [12], [13]. В связи с этим, большое количество данных описывают химио-профилактических и противоопухолевой активности нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), включая селективные ингибиторы СОХ2 в качестве потенциальных методов лечения GC [10], [11], [14].
<р> транскрипционный контроль гена COX2 зависит от молекулярного механизма, взаимодействующего с активатором COX2, который, кажется, контролируется с помощью активности различных сигнальных путей [15], [16], [17]. В самом деле, оно было первоначально установлено, что CRE (-59 /-53), NF-IL-6 (-132 /-124) и NF-kB (-233 /-214) консенсусных последовательностей в промоторе COX2 были необходимы для экспрессией гена [16]. Последующие функциональные исследования в промоторной COX2 выявили ряд регуляторных элементов, участвующих в транскрипции гена, включая AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] и белков принадлежащих к фактору Т-клеток /Лимфоидная фактор энхансер (TCF /LEF) семейство транскрипционных факторов, которые имеют решающее значение для Wnt /β-катенина трансдукции сигнала [21].
<р> Wnt /β-катенин сигнальный путь широко признан как играет важную роль в болезни человека, в частности, в возникновении и развитии рака [22], [23], [24]. Интересно, что недавние эксперименты в GC клеток, полученных показали связь между экспрессией COX2 и ингибирование гликоген синтазы-киназы-3 &beta (GSK3β) фермента [25], который является ключевым компонентом Wnt, который фосфорилирует -катенин и способствует его последующей деградации с помощью протеасома [26]. Отношения между Wnt /бета-катенина и экспрессии COX2 в различных моделях раковых клеток дополнительно поддерживается из следующих исследований. Во-первых, было обнаружено в эпителии молочных желез, что Wnt /β-катенин играют косвенное воздействие на COX2 транскрипции, которые могут быть опосредованы повышающую регуляцию посредника фактора PEA3 [27]. Во-вторых, и в отличие от косвенного способа действия, Араки и перевалы. [21] сообщили, что в раковых клетках толстой кишки происходит индукция экспрессии COX2 через /TCF зависимого механизма β-катенина, и частично охарактеризовали /сайт связывания LEF консенсус TCF (КЭ: ядро CTTTG), расположенный 1079 пар оснований в обратном направлении от начала транскрипции сайт в промоторе COX2. В-третьих, было отмечено, что у больных раком толстой кишки и полученных клеточных линий, существует связь между избыточной экспрессии Wnt Тропинка-ассоциированных белков LEF-1 и Pontin52 /TIP49a и повышающей регуляции экспрессии COX2 [28]. И, наконец, с помощью хондроциты, было показано, что LEF-1, вместе с бета-катенина, регулируемую экспрессию COX2 путем прямого связывания LEF-1 /β-катенина комплекса к 3'UTR области геномного локуса COX2 [29] , Поэтому в настоящее время не существует ясная картина относительно того, идет ли речь сигнализации Wnt в экспрессии генов COX2, или как его роль в GC /началом прогрессии. Здесь мы стремились понять, есть ли прямое регулирование экспрессии гена COX2 через Wnt сигнализации /β-катенина и определить Wnt /β-катенин регуляторные элементы в промоторной области гена COX2, который может повышения активности COX2 транскрипции в GC клетках.
<р> человека клеточных линий MKN45 (японский язык сборник научных биоресурсам, Япония), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 и HEK293 (Американской коллекции типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд) были использованы в данном исследовании. MKN45, N87, SNU1 и KATOIII клетки выращивали в RMPI средах (Gibco); АГС в F12K среде (Hyclone); WI38 в EMEM (Гибко); и НЕК293 в DMEM (Gibco). Культуральную среду с добавлением 10% FBS (Gibco) (AGS с 20%) и 1% пенициллина /стрептомицина. Клеточные линии поддерживали при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2 и насыщенное влажности.
плазмид и сайт-направленный мутагенез
<р> SuperTOPFlash-люциферазы и PRL-ТК renilla- люциферазные плазмид [30], конститутивный активный β-катенин (S33Y) [31] и доминантно-негативные плазмид экспрессии ΔTCF4 [32] были описаны ранее. Химерные СОХ2 фрагментов промотора-люциферазы были получены с помощью ПЦР из геномной ДНК человека с использованием специфических праймеров, содержащих сайты рестрикции, а затем вставлена в pGL3-Basic вектором (Promega). Мутации в сайте КЭ-II (-689 /-684) промотора COX2 были получены с использованием праймеров pCOX-0,8-TBEMUT с сайт-направленный набор mutagesis QuickChange (Stratagene). Формирует были проверены путем прямого секвенирования (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Грунтовки последовательности описаны в таблице S1.
полуколичественный и в режиме реального времени RT-PCR
<р> Общую РНК экстрагировали в РНКазы условиях с использованием TRIzol (Invitrogen) и 2 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с 200 U из SuperScript II обратной транскриптазы (RT) (Invitrogen) с использованием 500 нг олиго (дТ) праймеров. Экспериментальное определение COX2, с-Мус и уровни мРНК CCND1 проводили в соответствии с [33]. Вкратце, кДНК подвергали ПЦР в реальном времени в системе прибора Icycler Iq (Bio-Rad Laboratories). Каждый объем реакционной смеси 25 мкл содержала 1 единицы Платиновый Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen), 1X реакционного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, и 50 мМ КСl), 1,5 мМ MgCl <суб> 2, 2,5 мкг БСА, 0,01% глицерином , 200 мкМ дНТФ, 0.3x SYBR зеленый раствор и 0,4 мкМ специфических праймеров (таблица S1). Условия ПЦР были установлены следующим образом: 90 секунд при 94 ° С, а затем 30 циклов: 30 сек при 94 ° С, 30 секунд при 62 ° C и 30 секунд при 72 ° C. Все реакции проводили в трех экземплярах и результаты, полученные для каждого гена нормализовали к результатам, полученным параллельно с бета-актина. контролировали Качество РНК и ПЦР-продуктов на протяжении экспериментов с помощью электрофореза на 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием.
<р> Wnt, сигнальное фармакологически индуцированных в клетках MKN45 высевают в 6-луночные культуральные планшеты при 80-90% слияния (то есть 1, 2, 4 и 8 часов инкубации) либо с 10-20 мМ LiCl (Sigma) или 5-10 мМ вальпроевой кислоты (VA, Sigma), как описано ранее [34], [35]. Затем клетки собирали для экстракции мРНК и реального определения времени ПЦР, как описано выше. Точно так же, MKN45 клетки стимулировали в течение 2-х часов с 200 и 400 нг /мл очищенного белка Wnt3a. Очистка Wnt3a проводили, как описано [36].
транскрипционной активности промотора COX2
иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализы
<р> исследования ChIP были проведены в клетки MKN45, как описано ранее [37]. Доля ядерной -катенина связана либо с TBE Sites I, II, III или IV в промоторе COX2 человека иммунопреципитировали с анти β-катенина антителами (Santa Cruz), и оценивали в реальном времени ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров (таблица S1) , Кроме того, фракция РНК-полимеразы II (Pol-II) и ацетилированных гистонов Н3 и Н4 (H3ac и H4ac) связаны либо с КЭ-II области (-793 /-594) или проксимальной области (-118 /+ 62 ) промотора COX2 аналогичным образом оценивали (анти-Поль-II, Santa Cruz; H3ac и H4ac, Upstate). В качестве положительного контроля использовали сайт TBE с-Мус [38]. Антитело специфичность анализировали с нормальной кроличьей-IgG (Santa Cruz).
методом сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)
<р> EMSA проводили с использованием олигонуклеотидов, содержащих либо дикого типа COX2 консенсусной последовательности КЭ-II (смотри таблицу S1) или ранее сообщалось мутантные последовательности КЭ [39]. Короче говоря, дикого типа и мутантными 32Р-меченых олигонуклеотидов инкубировали в буфере для связывания с ядерными экстрактами клеток MKN-45 в течение 30 мин при 30 ° С. Затем ДНК-белковые комплексы были отделены от свободных олигонуклеотидов на не денатурирующих полиакриламидном геле в 5%. После электрофореза гель сушили и экспонировали с пленкой в течение 1 дня. Визуализация радиоактивных полос анализировали с помощью авторадиографии. Специфичность связывания проверяли с помощью инкубирования ДНК-белковых комплексов в присутствии избытка немеченого дикого типа или мутированные олигонуклеотиды [21], [39].
Статистический анализ
<р> Каждый эксперимент повторяли по меньшей мере три раза с тремя повторами. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Множественные сравнения групп осуществляли с помощью одностороннего ANOVA с использованием программного обеспечения STATISTICA 9.0. P
&л;. 0,05 считали значимым
<р> Мы изначально определили выражение уровни мРНК COX2 в человеческих GC клеточных линий MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII и AGS [40], [41], [42], а также WI38 фибробластов, используемых здесь в качестве контрольной клеточной линии [43], исследуя были ли они коррелируют с Wnt сигнализации /β-катенина. Как показано на рисунке 1, сильные уровни экспрессии COX2 наблюдались уже через 26 циклов ПЦР-амплификации в метастатических клеточных линиях MKN45, SNU16 и KATOIII, а также в клеточной линии AGS, который является производным от первичной опухоли. Этот результат согласуется с уровнями экспрессии COX2 обнаруженных ранее в MKN45, KATOIII и AGS клеток [44], [45], [46]. В противоположность этому, уровни мРНК СОХ2 были либо очень низкой в WI38 фибробласты или невозможно обнаружить в N87 и SNU1 клеток (Фигура 1А), предполагая, что этот дифференциальный характер экспрессии не связана с метастатической стадии или уровня трансформации клеток. Примечательно, что уровни ядерной β-катенин были тесно связаны с выражением COX2, так как высокие уровни белка наблюдались в MKN45, AGS, SNU16 и KATOIII клеток, по сравнению с N87, SNU1 и WI38 клеток (Фигура 1В), что предполагает роль Wnt сигнализации в экспрессии мРНК COX2 в GC клетки.
<р> для того, чтобы исследовать, если каскад Wnt участвует в экспрессии COX2, MKN45 клетки были фармакологически стимулировали в течение различных периодов времени (то есть 1, 2, 4 и 8 ч) с любой из лития (LiCl) или вальпроевой кислотой (VA), так как оба препарата были ранее показано, модулировать передачу сигналов Wnt путем ингибирования активности GSK3β и, таким образом, увеличивая ядерный уровни бета-катенина [34], [35]. Интересно отметить, что мы наблюдали заметное усиление экспрессии COX2, индуцированную 10-20 мМ LiCl или 5-10 мМ В.А., которая началась вскоре после инкубации с соединениями и которая достигла своего пика через два часа после обработки (фиг.2А). определение в режиме реального времени уровней СОХ2 мРНК в клетках MKN45 аналогичным образом обработанных LiCl или VA (2 ч) показал, что СОХ2 была значительно повышающей регуляции (фиг.2В), и что этот эффект был параллельно с той, которая наблюдается на генов-мишеней /β-катенин Wnt с-Мус [47] и циклин D1 [48]. Далее, для того, чтобы исключить возможность того, что наблюдаемое явление отраженную неспецифические эффекты лекарственных средств, действующих на белки, влияющих на различные сигнальные каскады, мы применили непосредственно полностью функциональный очищенный белок WNT3a к MKN45 клеток (см методы). Эти эксперименты ясно показали, что 200-400 нг /мл очищенного значительно усиленную экспрессию мРНК COX2 Wnt3a после короткого периода инкубации (рисунок 2), частично объяснить быстрый эффект LiCl и VA и поддерживает прямую связь между канонической Wnt /-катенина активация и стимуляция ЦОГ-2 транскрипции в клетках GC.
COX2
Вклад TBE сайты к COX2 промоторной активности в клетках GC
<р> рассекать вклад Wnt /β-катенин реагирующих сайтов КЭ на транскрипционной активности промотора COX2 были сгенерированы четыре pCOX2 делеции конструкции: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 пар оснований); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 б.п.); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 б.п.); и pCOX-0,4 (-371 /+ 35 б.п.) (рис 4A). Эти конструкции были последовательно анализировали на их активность путем временной трансфекции в MKN45 и AGS клетки, используя WI38 фибробласты в качестве контрольной клеточной линии. В соответствии с уровнями экспрессии эндогенных СОХ2 в этих ГХ клеточных линий (Фигура 1А), pCOX2 делеции сохранили различные уровни активности в MKN45 и AGS клетки (фиг.4В и С). В противоположность этому, ни один активность промотора не был обнаружен в WI38 фибробластов (рис 4D), даже тогда, когда трансфекция дозы в этих клетках были увеличены в 8 раз (т.е. от 50 до 400 нг) (рис S2). Важно отметить, что и в соответствии с предыдущими сообщениями [50], WI38 клетки эффективно выразили люциферазы-репортерной конструкции, содержащей промотор гена р21 (рис S2), что указывает, что в этих контрольных клетках молекулярные механизмы ответственны за индукции COX2 транскрипции не активен , Дальнейшие эксперименты показали, что трансфекция в MKN45 и AGS клетки с pCOX2-0.8 конструкцией, которая имеет 859 п.о. удален из 1,6 Кб pCOX2 репортер (рисунок 4A), привело к значительному увеличению активности промотора по сравнению с pCOX2-1.2 репортер (Рисунок 4A-C). Как не было выявлено никаких существенных различий между 1.6 Kb pCOX2 и pCOX2-1.2 конструкций (рис S3), мы не проводили дальнейшего анализа с большей конструкции. Важно отметить, что pCOX2-0.8 представлял собой минимальный фрагмент размером промотора, проявляющего максимальную базальную активность, так как дальнейшее удаление либо 159 или 370 пар оснований от 5'-конца, как это имеет место с pCOX2-0.65 или pCOX2-0.4 конструктов, соответственно , снизилась более чем в 2 раза уровни pCOX2 базальной активности. Эти результаты указывают на то, что область в пределах от 0,8 до 0,65 т.п.н. выше по потоку от TSS гена COX2, и который включает в себя элемент ответа новым КЭ (КЭ сайта II; -689 /-684), может быть ключевым компонентом в процессе регулирования базальный уровень экспрессии гена COX2 в GC клетки.
<р> Далее мы исследовали влияние Wnt сигнализации /β-катенина в романе КЭ сайта II. Мы трансфицировали MKN45 клетки с pCOX2-0.8 репортерной конструкцией и совместной экспрессии конститутивной активный белок β-катенин S33Y наблюдения, что произошло значительное (в 2 раза) повышение транскрипционной активности pCOX2-0.8. Этот β-катенин-опосредованное увеличение конкретно, так как конструкция pCOX2-0.4 не стимулировалась в этом -катенина сверхэкспрессии состояние (рис 5A и B). Для контроля за Wnt сигнализации /β-катенина в MKN45 клетках мы использовали /β-катенина отзывчивым SuperTOPFLASH (STF) репортера Wnt, несущий 12 копий КЭ в тандеме [32], которая была трансфицируют отдельно или в присутствии плазмидой, кодирующей для мутант β-катенина S33Y белка. Интересно отметить, что в то время как совместная экспрессия с мутантным белком β-катенин S33Y в клетках MKN45 был способен усиливать (в 1,9 раза) активность СТП репортером, высокие уровни базального СТП активности были обнаружены в отсутствие мутантного -катенина (5С). Этот результат согласуется с нашими предыдущими выводами высоких уровней эндогенного ядерного бета-катенина в этой ячейке типа (рис 1В), и подтверждает, что этот ядерный фактор является функциональным. Для дальнейшего подтверждения этого факта, мы провели идентичные эксперименты в клетках НЕК293, и полученные по существу такие же результаты, хотя в данном случае явная кривая доза-ответ был получен, когда pCOX2-0.8 трансфицировали в присутствии возрастающих концентраций конститутивно -катенином S33Y белка (рис S4). Кроме того, мы обнаружили, что СТП активность в клетках НЕК293 был очень отзывчивым на уровни экзогенной мутантной бета-катенина (рис S4C).
<Р> Для дальнейшего изучения последствий /β-катенина пути Wnt на активность из pCOX2-0.8 мы провели с потерей функции экспериментов с доминирующей отрицательной Tcf4 (ΔTCF) построить, который кодирует фактор транскрипции 30 остатков хватает от его амино-конца и который не может связать -катенин [32] , Мы обнаружили, что в клетках MKN45 ΔTCF экспрессия снижается высокий уровень pCOX2-0.8 базальной транскрипции в зависимости от дозы образом (рис 5D). Этот результат подтверждает ключевую роль TCF /LEF факторов транскрипции среди регуляторов активности последовательности pCOX2-0.8 промотора, а также поддерживает идею о том, что КЭ Site II (-689 /-684) участвует в ответ на Wnt /β-катенин сигнализации.
<р> Наконец, напрямую обратиться к роли КЭ сайта II в Wnt /β-катенин-опосредованной регуляции промотора COX2, мы ввели с помощью сайт-направленного мутагенеза, изменение в 2 ключа нуклеотиды консенсусной последовательности ядра КЭ сайта II (т.е. pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Эти изменения, как было показано ранее, чтобы отменить Wnt /β-катенин-опосредованного транскрипции [39]. Переходные исследования показали, что трансфекция мутация TBE сайта II значительно снизилась (в 2-3 раза) базальной активности pCOX2-0.8 построить в MKN45 клетках (рис 5д) по сравнению с диким типом промотора pCOX2-0.8 конструкции. Кроме того, и в согласии с нашими предыдущими результатами, мутации этого сайта КЭ II почти полностью блокирована β-катенин-опосредованной усиление pCOX2-0.8 конструкции (рис S4). Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что КЭ сайта II (-689 /-684) представляет собой функциональный компонент в гене СОХ2 регуляции транскрипции.
β-катенин связывается с промотора гена области COX2, содержащий TBE сайта II
<р> Поскольку транскрипционно активной конформации хроматина структуры отражается повышенным уровнем ацетилирования гистонов [51], мы осаждали сшитых фрагментов хроматина (средний размер 300-500 пар оснований), выделенных из MKN45 клеток с использованием поликлональных антител, специфичных для ацетилированного гистонов H3 и H4. Аналогичным образом, мы обнаружили связывание РНК-полимеразы II (Pol II) в качестве параметра, как правило, связанный с транскрипционной активностью. Мы изучили обогащение в наших выделениями двух промоторных последовательностей: Проксимальный промотор (PP) область (-118 /+ 62 из TSS) и дистальной области (-793 /-594) от COX2 промотора, содержащего консенсус TBE Сайт II ( -689 /-684). В частности, КЭ сайта II была ориентирована так как предыдущие эксперименты показали предпочтительное связывание -катенина к этому области промотора (рис S5). В качестве положительного контроля, мы оценивали связывание на участке КЭ в промоторе с-Мус гена (-1447 /-1,144 из TSS), который ранее был описан в клетках рака толстой кишки [38].
<Р> ацетилированный были обнаружены гистоны H3 и H4 и фермент полимеразной II для связывания в проксимальной области промотора (рис 6, а), что указывает, что структура хроматина вокруг промотора COX2 в MKN45 клетках находится в открытом конформации, таким образом, в соответствии с нашими предыдущие результаты демонстрируют, что ген COX2 активно транскрибировать. Следует отметить, что белок β-катенин иммунопреципитировали из MKN45 образцов в основном в сочетании с областью промотора, перекрывающей последовательности TBE -684 /-689 в гене СОХ2 (Фиг.6В). Этот фактор был почти невозможно обнаружить в промоторной области проксимального, указывая, что эндогенный ядерный β-катенина в первую очередь на работу в TBE Site II в этих клетках GC. Как и ожидалось, эндогенные β-катенин аналогичным образом связан с промотором TBE сайт с-Мус, на уровнях, которые сопоставимы с таковыми в промотора гена СОХ2 (фиг.6С).
<Р> Итак, эти эксперименты показывают, что КЭ сайта II непосредственно участвует в β-катенина-опосредованной активации транскрипции промотора COX2. Для дальнейшего подтверждения этих результатов мы провели электрофоретических анализов сдвига подвижности (EMSA) в ядерных экстрактах клеток MKN45. Для этого мы подготовили 34 олигонуклеотиды, основанные парные; один из них содержит дикого типа -689 последовательность /-684 КЭ сайта II (т.е. CTACAAAGA; остатки подчеркнуты представляющие ядро), а также два олигонуклеотида, содержащие миссенс мутации либо в ядре TBE сайта II (т.е. CTACGAGGA: TBE-Mut1) или в фланкирующей последовательности (т.е. CGCCAAAGA: КЭ-Mut2), как сообщалось ранее [21], [39]. Как показано на рисунке 6D, радиоактивно меченный дикого типа КЭ зонд был способен образовывать запаздывающие ДНК-белковых комплексов при инкубации с ядерными экстрактами из MKN45 клеток. Эти белок-ДНК комплексы были специфичны, так как добавление избытка холодного олигонуклеотидами дикого типа (в 50 раз) резко ингибирует образование ДНК-белкового комплекса (рис 6D, полоса 3 и 4, соответственно). Мутант метили КЭ-Mut1 зонд был не способен образовывать ДНК-белковые комплексы, сам по себе, и не конкурировать с диким типом олигонуклеотида, при добавлении в избытке в качестве холодного зонда (рис 6D, полоса 5 и 6, соответственно). Аналогичные результаты были получены, когда второй холодный КЭ-Mut2 зонд был использован в качестве конкурента (рисунок 6D, дорожка 7). В целом, эти результаты показывают, что новый КЭ сайта II в промоторе COX2 участвует в активации транскрипции гена COX2 путем подбора механизма, ответственного за трансдукции Wnt /β-катенина сигнализации (рис 6е).
Обсуждение
<р> Мы также показали, что здесь в пределах 2 т.п.н. вверх по течению промотора COX2 человека есть четыре предполагаемых сайтов КЭ. (ядро: CTTTG), один из которых был ранее изученные Араки и смещ_по_столбцам [21], [28]. С помощью репортерных анализов генов с различными pCOX2 делеционных конструкций, мы показали, что pCOX2-0.8 отображается самый высокий базальный транскрипционной активности в клетках GC MKN45 и AGS. Интересно, что pCOX2-0.8 поддерживал КЭ Site-II (-689 /-684) целостности с указанием его ключевой вклад в регулирование транскрипционной активности гена COX2. Следует отметить, что полное pCOX2 КЭ сайта II подписи (т.е. 5'-WWCAAAGS-3 ', S = C /G, W = А /Т), напоминает оптимальный сайт TCF описан Ван-де-Wetering и перевалы. [52], который впоследствии был использован для идентификации подлинных Wnt-транскрипционные целей в Drosophila
генов NKD
и CG6234
[53].
<Р> Функциональность этого сайта КЭ II была также подтверждена нашими мутагенеза исследований. Таким образом, когда мы мутировали последовательность КЭ-подписи в pCOX2-0.8 конструкции (MpCOX2-0.8), было установлено, что активность промотора базальный СОХ2 значительно влияет на MKN45 клеток. Кроме того, наши фишку и EMSA анализы подтвердили, что β-катенин преимущественно рекрутируются в COX2 промоторной области -689 /-684 в дс клетках, на уровне, который напоминает, что нашел в с-Мус промотора [38]. Такое взаимодействие предпочтительно происходит на этом участке промотора гена COX2, как не обнаружено ни одного β-катенин связывается с проксимальной промоторной области гена COX2. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что КЭ сайта II представляет собой функциональный Wnt /β-катенин отзывчивым элемент внутри промотора COX2 человека. Наши данные, тем не менее, не исключает вклад других геномных областей в гене человека COX2 [21]. Вместо этого, мы полагаем, что в GC клетки сложная сеть взаимодействий присутствует где КЭ сайта II взаимодействует с другими элементами реагирования на вверх-регулируют экспрессию COX2.
<Р> Как наши результаты в GC клетки находятся в согласии с теми, сообщает для клеток рака толстой кишки, заманчиво предположить, что Wnt сигнализации /β-катенин может быть аналогичным образом участвуют в регуляции COX2 в других опухолей [21], [28]. Действительно, от умеренных до сильных уровней протеина бета-катенина можно наблюдать в ок 72% всех случаев заболевания раком, анализируемых в базе данных Protein ткани человека Атлас [54]. Точно так же, сильный и умеренной цитоплазматический COX2 окрашивания и время от времени мембранозной реактивность наблюдается в 50% всех случаев рака ободочной и прямой кишки, в том числе, предстательной железы, шейки матки, рак эндометрия, Уротелиальная, поджелудочной железы, печени и в железистых клетках из желудка опухолевой ткани.
Диабет 1 типа связан с микробиомом кишечника и генетическими факторами
Кислый pH усиливает инфекцию SARS-CoV-2 за счет активации рецептора ACE2
Исследователи идентифицируют бактерии с активностью против SARS-CoV-2 in vitro:Dolosigranulum pigrum.
Микробиом кишечника связан с поведенческими проблемами у детей
Ученые разрабатывают пептиды, которые восстанавливают баланс кишечных бактерий и предотвращают атеросклероз.
Половина используемых лекарств повреждает кишечные бактерии,
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Новое исследование, опубликованное в журнале Природа показывает, что существуют буквально сотни вирусов, достаточно больших, чтобы поглощать бактерии, и со свойствами, которые типичны для живого орг
Препарат для похудания Wegovy одобрен FDA
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило инъекцию Wegovy (семаглутид) (2,4 мг один раз в неделю) в качестве лечения хронического контроля веса
Исследование связывает потребление ферментированных овощей с низкой смертностью от COVID-19
Новое интригующее исследование, проведенное европейскими исследователями, предполагает, что показатели смертности от коронавируса 2019 года (COVID-19), вероятно, будут ниже в странах, где диеты богаты