PLoS ONE: Gubitak iskazivanje Reprimo, p53 izazvanog staničnog ciklusa Gene, korelira s invazivnom stadiju napredovanja tumora i p73 izražavanja u želučani Cancer

Sažetak pregled

Reprimo (RPRM), daljnji efektor p53 induciranu staničnog ciklusa u G2 /M, predložen je kao sredstvo za suzbijanje gena potencijalnog tumora (TSG) i kao potencijalni biomarker neinvazivne otkrivanje raka želuca (GC). Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti epigenetičku odsutnost RPRM gena promotora metilacije i njegove tumor supresor funkcija u GC staničnim linijama. Osim toga, bio je istražiti Klinički značaj RPRM proteinskog proizvoda i njegove povezanosti s p53 /p73 tumor supresor obitelji proteina. Epigenetske utišavanje od RPRM gena promotora metilacije procijenjena je na četiri GC staničnim linijama. Protein izraz RPRM procijenjena je u 20. tumor i ne-tumorske uskladiti slučajeva. Klinički značaj RPRM asocijaciji sa p53 /p73 tumor supresorskog obitelji proteina je procijenjena u 114 GC slučajevima. Tumor supresor funkcija je ispitana putem funkcionalnih testova. Izraz RPRM gena je u negativnoj korelaciji s promotorom metilacije (Spearman rank r = -1; p = 0,042). RPRM prekomjerna ekspresija inhibirana nastanak kolonija i učvršćenja neovisan rast. U kliničkim uzorcima, genske ekspresije proteina RPRM otkrivena je u 75% (15/20) s ne-tumorske susjedni sluznice, ali samo na 25% (5/20), želučanih tumorskih tkiva (p = 0,001). Kliničkopatološkim korelacije gubitka RPRM izraza su značajno povezane s invazivnom stadiju GC (faza I. II-IV, p = 0,02) i pozitivna povezanost između RPRM i p73 gena ekspresije proteina proizvoda utvrđeno je (p 0,0001 i kapa-vrijednost = 0,363 ). U zaključku, epigenetičko odsutnost RPRM gena promotora metiliranjem je povezan s gubitkom RPRM izražavanja. Funkcionalni testovi pokazuju da RPRM ponaša kao TSG. Gubitak ekspresije gena RPRM proteinskog produkta je povezana s invazivnom fazi GC. Pozitivna povezanost između RPRM i p73 izražavanja ukazuju na to da ostali članovi obitelji p53 gena može sudjelovati u regulaciji RPRM izražavanja pregled

Izvor:. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) Gubitak iskazivanje Reprimo, p53 izazvanog staničnog ciklusa Gene, korelira s invazivnom stadiju napredovanja tumora i p73 izražavanja u rak želuca. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834 pregled

Akademska Urednik: Muhamed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 16 siječnja 2015; Prihvaćeno: 25 ožujka 2015; Objavljeno: 8. svibnja 2015 pregled

Copyright: © 2015 Saavedra i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteke pregled

Financiranje:.. ovo radi bio podržan od potpore CONICYT-FONDECYTo1014 (AHO) i CONICYT-FONDAP—30011 (AHO i JCR) od Vlade Čile

u konkurenciji interese. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je treći vodeći uzrok raka povezanih smrti, a peti je zajednička maligne bolesti u svijetu [1]. Unatoč padu incidencije GC, dijelom i zbog priznavanja određenih faktora rizika (npr Helicobacter pylori pregled i okolišni čimbenici), i dalje je jedna od najčešćih karcinoma u svijetu i dalje biti klinički izazov [2 , 3]. Želučani karcinogeneze uključuje postupno nakupljanje genetskih i epigenetičkim promjenama, što dovodi do poremećene u ekspresiji onkogena i gena za suzbijanje tumora (TSGs) [4]. Reprimo (RPRM) je novi potencijalni TSG [5,6] i povezan s želučanim karcinogeneze [7]. Osim toga smo predložili da metiliranog RPRM bez stanica DNA može biti potencijalno biomarkera za neinvazivno detekciju GC [8,9]. Pregled

RPRM je visoko glikolizirani protein lokaliziran pretežno u citoplazmi, te je identificiran kao nizvodni efektor staničnog ciklusa p53 induciran u G2 /M [10]. Izvještaji pokazuju da izraz RPRM reguliraju dva mehanizma, jedan kroz DNA metilacije na svom promotorske regije [8], a drugi od strane p53 puta [10]. Međutim, novije studije nisu bile u mogućnosti potvrditi ove rezultate [6]. S druge strane, klinički značaj RPRM je slabo proučavao [11]. U ovom istraživanju smo ocijenili ulogu DNA metilacije u regulaciji RPRM izražavanja, njegova kliničkog značaja i njegove povezanosti s članovima tumora p53 supresorski protein obitelji (tj p53 i p73). Pronašli smo guste metilacije na promotorske regije RPRM, koji je povezan s gubitkom ekspresiju u GC stanicama. U kliničkim slučajevima, gubitak ekspresije bio povezan s invazivnosti fazi GC. Nadalje, gledali smo pozitivnu povezanost između ekspresije RPRM i p73, što sugerira da ostali članovi obitelji gena p53 može biti novih kandidata za regulaciju RPRM izražavanja. Pregled

Metode

staničnim linijama i tkiva Uzorci

Četiri GC stanica (AGS, SNU-1 KATOIII i NCI-N87) kupljeni su od American Type Culture Collection (ATCC) u prosincu 2012 uzgajane su u RPMI-1640 mediju (Hyclone), te uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i održava se na 37 ° C, 5% CO _{2. Dvadeset podudaraju tumor i ne-tumorske susjedstvu sluznica (NTAM) uzorci su odabrani za procjenu RPRM izražavanja. Šest su odabrani za procjenu RPRM metilacije. Skupini od 114 GC bolesnika izabran je za kliničkopatološkim korelacija RPRM genskog proteinskog produkta. Uzorci tkiva iz pojedinačnih slučajeva klasificirano u skladu s japanskom Research Society for želučane preporuka raka [12]. Svi predmeti su regrutirani iz Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-bolnica kliničko San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Čile između 1993-2000 [13] i kliničkopatološkim značajke prikazane su u tablici 1. Istraživanje je odobreno od strane institucionalne Pregled odbori Pontificia Universidad Catolica de Chile (Comité de Ética Científico) i ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Čile). Pismeni informirani pristanak dobiven je od svakog sudionika uključenih u studiju. Pregled}

tkiva mikropostrojima i Imunohistokem pregled

tkiva nizovi (TMA) su učinili pomoću ručnog tkiva Array II instrument (Beecher Instruments) kao što je prethodno opisano u [14,15]. Jezgra sekcije (4 uM) su bili podvrgnuti imunobojanju pomoću Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), prema uputama proizvođača. Antitijela koja se koriste u ovom istraživanju bile su RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Denmark) i p73 protein α (klon 24, Novacastra). Rezultati imunobojanje na cijeli tumor i NTAM kao TMA sekcija smatrani su za pozitivne RPRM ako > 30% epitelnih stanica pokazala citoplazmatski bojenje, > 10% nuklearne bojanje p53 ili > 10% nuklearne /citoplazmatski bojenja za p73 , Procjena imunohistokemijski bojenja provedena je nezavisno dva patologa (JV & GC). Koji su bili zaslijepljeni kliničke podatke pregled

bisulfit sekvenciranje i kvantitativna RT-PCR Expression Analiza pregled

DNA iz staničnih linija GC bio ekstrahiran pomoću TRIzol reagensa (Life Technologies) prema protokolu proizvođača, a nakon toga bisulfita pretvorbe pomoću EZ DNA metilacije Gold kit (Zymo Research). RPRM promotora je amplifirano od bisulfita tretiranih DNA, koristeći primere RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'i 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', čime detekciju 52 CpG mjesta unutar 509-bp područje promotora. PCR produkti su pročišćeni s QIAXEN II gela za ekstrakciju (Qiagen) i povezan u pGEM-T vektor. Proizvod povezivanja je upotrijebljen za transformiranje kompetentnih E
. coli pregled najboljih10 stanice, u skladu s postupkom opisanim u Inoue et al. [16]. Transformanti su odabrani na LB agar pločama s dodatkom ampicilin (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /mL) i IPTG (100 mM). Rezultirajuće bijele kolonije su procijenjeni kolonija-PCR. Pozitivni klonovi su uzgajani u tekući medij (LB /ampicilin) ​​do kasne eksponencijalne faze (OD600 = 1) i DNA plazmida pročišćen pomoću Iskorištenje čistog Miniprep sustava kit (Promega). Regija koja promovira RPRM je sekvenciran koristeći univerzalne M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'i 5'-CAGGAAACAGCTATGAC RV-3') pomoću Macrogen (http://dna.macrogen.com). BiQ analizator softver je korišten za analizu sekvenciranih klonova. Svi pozitivni pGEM-T klonovi su uzgajani u LB /ampicilin mediju i pohranjeni na -80 ° C (u 14% glicerola). Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) i cDNA sintetiziran je korištenjem iScript cDNA Synthesis Kit prema uputama proizvođača (Biorad). Nakon toga, cDNA je upotrijebljena za svaku PCR reakcije sa svaki par početnica. U RPRM specifični primeri su: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'i 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. RT-PCR analiza je provedena pomoću LightCycler Fast Start DNK MasterPlus SYBR Green I (Roche) u LightCycler 1.5 sustav u realnom vremenu otkrivanje (Roche). Relativna kvantitativna analiza normaliziran RPL-30 je provedeno putem komparativne metode praga ciklus [17]. U RPL-30 specifične početnice su:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'i RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3' pregled

validacija RPRM antitijela imunoblot and imunofluorescencija pregled

3x10 ^{5 AGS stanice prolazno su transfecirane pCMV6 /RPRM ili pCMV6 (Origene) praznim vektorom pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen), u skladu s protokolom proizvođača. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su inkubirane 24 h u RPMI1640 s 10% FBS u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora N-glikozilacije Tunicamicyn (10 ng /ml). Stanice su sakupljene i cjelostaničnim lizati ekstrahirana korištenjem Triton puferu (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton X-100), s Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) i fosfataza Inhibitor Cocktail Kit ( SC-45045, Santa Cruz Biotechnology). Koncentracije proteina su određene korištenjem Bradfordovog brzi početak reagensa (Bio-Rad). Pedeset J..lg proteina su odvojeni na SDS-PAGE 4% do 12%. Proteini na gelu elektroblotiran na polivinilidenfluorid membrane pomoću mini transblotter sustav (Bio-Rad, Hercules, CA). Dffluorida Membrane poliviniliden su blokirane u 5% mlijeku u Tris-puferiranoj slanoj otopini /Tween 20 (TBST) tijekom 1 sata. Primarna antitijela anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) se razrijedi 1: 1000 u TBST /3% BSA /i membrane se inkubiraju u primarnim antitijelima na 4 ° C preko noći. Membrane su zatim isprane tri puta u TBST 10 minuta svaki. Anti-zečji peroksidazom-konjugirani sekundarno antitijelo (Santa Cruz) se razrijedi 1: 2000 u TBST i inkubiraju na membranama za 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su isprane kao gore i vizualizirati pomoću SuperSignal West Pico kemiluminiscentnom podlogom (Pierce) prema protokolu proizvođača. Procijeniti stanični položaj RPRM, imunofluorescencija testa. AGS stanicama privremeno transfeciranim pCMV6-RPRM ili pCMV6 su uzgojeni na pokrovnim. Se privremeno transfecirane AGS stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi i zatim se ispere tri puta u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (PBS). Stanice su natopljeni u 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) u 10 minuta, blokirane u 3% BSA u trajanju od 1 sat na sobnoj temperaturi, i zatim se označiti s anti-RPRM protutijelom (1: 1000, 38-50, sigma-Aldrich). Nakon ispiranja s PBS, stanice su inkubirane s Alexa Fluor 488-konjugiranih protutijela (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Slike su stečene fluorescentne laserskog skeniranja konfokalne mikroskopije (vidi Potpora Information S1 i S2 smokve). Pregled}

kultura stanica i transfekcija pregled

Za stabilne eksperimenata transfekcije, AGS stanice su stavljene na 3x10 ^{5 stanica /100 mm posude za uzgoj i transfecirane nakon 24 sati sa pCMV6-RPRM ili pCMV6 (Origene) prazan vektor pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su kultivirane pod istim uvjetima s G418 (500 g /ml). Mediji za kulturu se mijenja svakih 24 sati tijekom 14 dana. Pregled}

Kolonija analiza formacija pregled

Za testom formiranja kolonija, 200 stanice su stabilno transficirane pCMV6-RPRM ili pCMV6 prazan vektor. Stanice su kultivirane u RPMI-1640 mediju (Hyclone), uz dodatak 10% FBS. Medij kulture je mijenjan svaka 24 sata. Kolonije su obojeni pomoću 0,4% kristalno ljubičastog (Sigma) u 50% metanola, 21 dana nakon početnog sađenja, i broje na 20 slika snimljenih u obrnutoj mikroskopom (Evos XL Temeljni Cell Imaging System, Life Technologies). Svako transficiranje provodi se u triplikatu. Osim toga, repliciraju eksperimenti su provedeni kako bi se dobila dodatna klonova za ekspresiju analizu. Pregled

sidrište neovisno pokus rasta pregled

sidrište neovisno rast stanica je analizirana na ploču koja sadrži 1% agaroznom 2x10 ^{5 stanice stabilno transfektirane s pCMV6-RPRM ili pCMV6 praznim vektorom u ploče sa 6 jažica. Stanice su hranjeni svakog tjedna prekrivajući svježeg mekog agara rješenje, a kolonije su fotografirani nakon 4 tjedna inkubacije. Eksperiment se provodi u triplikatu. Pregled}

Statistička analiza pregled

Spearman koeficijent korelacije je izračunata za analizu povezanost RPRM metiliranje i razini ekspresije gena. Kategoričke varijable analizirane su Pearson Chi-kvadrat test (dvostrani), p-vrijednost korigirana pomoću logističke regresijske analize. Kontinuirane varijable analizirane su pomoću Student t
test i podatke izražava se kao srednja vrijednost ± SD. Kappa test korišten je za analizu korelacija između ekspresije RPRM i p73 izražavanja. Statistička analiza je provedena pomoću SPSS verzija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistički paket i GraphPad Prism5 softvera (La Jolla, CA, Sjedinjene Države). Sve vrijednosti su dvosmjerni, osim Spearmanov rang korelacije. Statistička značajnost je određena kao P < 0.05. Pregled

Rezultati

RPRM metilacije i izraz u staničnim linijama karcinoma želuca

Prije su mi i drugi su izvijestili da RPRM izraz može biti obnovljena od strane demethylating agenta 5-aza -2-deoksicitidin (vidi Potpora Information S3 i S4 smokve) [5,8,18]. Međutim RPRM metiliranje je slabo povezana s izrazom [18]. Kako bi se dalje procijeni povezanost RPRM promotora metiliranje i ekspresije gena, kompletno promotorsko područje od RPRM gena analizirano DNK bisulfita sekvenciranje u četiri GC staničnih linija (AGS, SNU-1 KATO III i NCI-N87) (Slika 1A). Dakle, analizirali su postupak metilacije status 52 CpG web stranice, koji se nalazi između -207 i +302 nukleotida u odnosu na mjesto početka transkripcije (TSS). Ova analiza pokazuje gustu metiliranje u staničnim linijama AGS i SNU-1 (89,6% i 86%, redom), u usporedbi za KATO III i NCI-N87 (79,7% i 51,8%, po istom redoslijedu) (p = 0,0002) (Slika 1B) , Dalje, razina ekspresije RPRM je određena kvantitativnom RT-PCR. Niska ekspresija RPRM gena opažena je u AGS i SNU-1 u usporedbi s Kato III i stanične linije NCI-N87 (p 0,0001) (Slika 1C). Do Spearmanov korelacijska analiza pokazala značajna negativna korelacija između gustoće metilacije i ekspresije gena RPRM (r = -1; p = 0,042) (Slika 1D). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da metiliranje RPRM promotorske regije igra ključnu ulogu u regulaciji RPRM izražavanja. Pregled

RPRM metilacije i izraz u želučanim tkiva raka pregled

Da se potvrdi prethodni podaci GC tkiva , RPRM razine metilacije utvrđene su u 6 uparenih tumora i NTAM uzoraka. Rezultati pokazuju više razine za metilaciju u tumorskim tkivima u odnosu na NTAM tkiva (vidi sliku 1 E). Da bi istražili ekspresiju RPRM gena proteinskog produkta u GC tkiva IHC Analiza je provedena. Pozitivan RPRM ekspresija uglavnom opažena u citoplazmi želučanog epitela. RPRM ekspresija gena proteina detektirana je u 75% (15/20) i NTAM tkiva uzoraka. Međutim, samo 25% (5/20) uzoraka tumora pokazale ekspresiju RPRM gena proteinskog produkta (Slika 2). Te su razlike bile statistički vrlo značajne (p = 0,001), a ukazuju na to da izraz RPRM je izgubljen u GC tkiva. Da bi se procijenila klinički značaj ovog gubitka RPRM izražavanja je procijenjena je skupina od 114 GC slučajeva. Gubitak RPRM izražavanja pronađena je u 62% (71/114) u GC slučajeva. Klinikopatološkim korelacije RPRM ekspresiju prikazani su u tablici 1. progresije iz faze I u fazi II GC na-IV (p = 0.006) i metastaza limfnog čvora (p = 0,037) značajno su povezani s gubitkom ekspresije gena RPRM proteinskog produkta. Međutim, logistička regresija pokazuje da je samo progresija iz faze I za II-IV značajno povezano sa gubitkom RPRM gena proteinskog produkta (p = 0,020). Pregled

Funkcionalni test za RPRM u raka želuca (formiranja kolonija i sidrištem neovisnim rasta) pregled

Kao što je gubitak RPRM izražavanja bila povezana u GC i uglavnom s progresijom iz faze i do II-IV, tumor supresorski uloga RPRM može biti uvjerljiv. Dakle, funkcionalni testovi, kao što su In vitro pregled formiranje kolonija i testovi rasta pričvršćivanje, neovisni su provedena u AGS stanici transficirana pCMV6 /RPRM (Slika 3A). Ne eksprimiraju AGS staničnim linijama koje su transfektirane sa ekspresijskim plazmidima RPRM pokazala je značajno smanjen broj kolonija u odnosu na pCMV6- prazan vektor transfektirane stanične linije su transfektirane s pCMV6 prazan vektor (p 0.05) (Slika 3B). Učinak RPRM prekomjernom ekspresijom na sidrište neovisno o rastu u mekom agaru testom formiranja kolonije također je procijenjena u stabilnim transficiranim AGS stanične linije klonova. Prebrojane su kolonije nakon početnog sađenja i inkubaciju u mekom agaru tijekom 4 tjedna. Stanice transfektirane s praznim vektorom pokazali snažan rast kolonija po broju i veličini kolonija. To uvelike smanjena kada RPRM je ponovno izražena u AGS stanicama (Slika 3c). Pregled

Udruga izražavanja RPRM i p53 /p73 tumor-supresorski protein obitelji u rak želuca Netlogu

RPRM je definirana kao gen p53 posredovano embrija fibroblastima [18]. Međutim, objavljeno je da je regulacija ekspresije RPRM može biti neovisna od stanja p53 gena kod živčanih stanica koje su tretirane s bakar [19]. S druge strane p73 može aktivirati transkripciju p53-reaktivnih gena [20]. S obzirom na tu postavku, procijenili smo ekspresiju p53 i drugog člana p53 proteina obitelji p73 TSG. Ekspresija p53 je bio smješten u jezgrama stanica želučane sluznice. Pozitivna ekspresija p53 otkrivena je u 23,5% (20/114) u GC slučajeva. Samo veličina tumora je povezan s izražajem p53 (p = 0,035, vidi tablicu 2). Ekspresija p73 bio smješten u staničnim jezgrama i citoplazmi epitelnih stanica. Pozitivna p73 izraz pronađen je u 30,6% (34/114) uzoraka GC. Zanimljivo, značajne korelacije klinikopatološkim p73 ekspresije povezane sa invazivnim fazi (faza I 55,6%; 10/18 do faze II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) i metastaza limfnog čvora (p = 0,038) (Tablica 2 ). Budući da gubitak ekspresije RPRM i p73 gena proteinskih proizvoda imaju slične kliničkopatološka korelacije, istražili smo povezanost između izraza razina oba proteina. U tu svrhu predmeti su podijeljeni u četiri skupine prema izrazu RPRM i p73 proteina proizvoda. Analiza je pokazala da 22 out 111 GC slučajevi su bili pozitivni na obje RPRM i p73 proteina, a 57 iz 111 su bili negativni. Ova povezanost je bila statistički značajna (p < 0,0001). S kapa vrijednosti 0,363 (tablica 3) pregled

Rasprava pregled

RPRM je visoko glikolizirani citoplazmatsku protein početno identificirana kao nizvodni efektor p53 uhićenje induciranu staničnog ciklusa u G2 /M. Ranije je bilo predloženo da se RPRM se prigušuje promotora metilacija, iako je slabo povezana s izrazom [5,8]. Osim toga, RPRM je predložen kao potencijalnog supresorskog gena tumora kod karcinoma bubrežnih stanica i tumora hipofize [5,6]. U ovom istraživanju, pokazali smo da je ekspresija gena RPRM je čvrsto povezan s promotorom regije statusu metilacije, sugerirajući epigenetičku utišavanje ekspresije RPRM gena. Osim toga, pokazali smo da RPRM gena proteina proizvod je smanjen u GC tkiva u usporedbi s noncancerous želučane sluznice. Ovi rezultati su slične da Luo i sur
. [11], koji je izvijestio gubitak RPRM u GC u odnosu na uzorke čira na želucu tkiva. Nadalje, naše otkriće u vezi gubitka izražavanja RPRM u prijelazu iz faze I do faze II-IV je klinički relevantni. Luo i sur pregled. [11] izvijestili sličan nalaz, ali u malom broju fazi sam GC slučajeva (n = 15). Ovi rezultati mogu imati klinički značaj kao prediktivni faktor za napredovanje GC. U skladu s tim s tim gubitkom RPRM izražavanja u progresiji GC, naših funkcionalnim testovima (formacije kolonija i pričvršćivanje, neovisno rasta) također predložio urođeni tumor supresorski ulogu RPRM u GC. Pregled

Iako P53 je u početku opisan kao RPRM induktor [10], klinička istraživanja provedena do sada nisu bili u mogućnosti da potvrdi takav nalaz [6,18]. Evo, utvrdili smo da je gubitak RPRM izražavanja korelira s gubitkom ekspresije drugog člana p53 porodice, p73. Iako p73 TSG izražava na vrlo niskoj razini u normalnim ljudskim tkivima [21], je prekomjerno eksprimiran u mnogim humanim karcinomima kao što dojke, neuroblastom, pluća, jednjaka, želuca, debelog crijeva, mjehura i jajnika [14,22]. Osim toga, objavljeno je da je p73 može aktivirati transkripciju p53-reaktivnih gena, uključujući p21Waf1 /CIP1, Bax, MDM2, ciklin-G, GADD45 i IGFBP3 [20]. Dakle, na temelju naših nalaza, predlažemo da RPRM izraz može se regulirati p73 na način p53-neovisni. Pregled

Ukratko, naši rezultati pokazuju da epigenetičko utišavanje od RPRM gena promotora metilacije je povezana s gubitkom RPRM izražavanja i prema tome, funkcionalni testovi predložio pretpostavljenu tumor supresorski ulogu RPRM u GC. U kliničkim uzorcima, RPRM gubi na invazivnih fazama GC i njegova ekspresija korelira s onom p73 upućuje na to da ostali članovi obitelji gena p53 može sudjelovati u regulaciji RPRM izražavanja. Daljnja istraživanja je zajamčen karakterizirati ulogu RPRM u napredovanju GC i potvrditi biološku regulaciju RPRM strane p73. Pregled

popratne podatke
S1 podataka. . Podaci temeljni studij pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001 pregled (ZIP) pregled S1 Sl. Učinci Tunicamicyn na RPRM proteina. Pregled RPRM je visoko glikolizirani citoplazmatski protein vizualizirati do 25 kD po Western blot, inhibitor glikozilacije tunikamicin (TK) istiskuje 25 kD RPRM bend do 15 kD u AGS stanicama s RPRM ekspresijom (pCMV6 /RPRM) (RPRM predvidio veličine 12 kD). Stanice su inkubirane tijekom 24 sata u RPMI1640 s 10% FBS u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora za N-glikozilaciju tunicamicyn (10 ng /mL). RPRM bila je određena pomoću Western blotting uporabom RPRM poliklonskog antitijela (gornju ploču za razrjeđivanje 1: 1000, Sigma-Aldrich). Izraz ß-aktin (donjoj ploči, razrjeđivanje 1: 2000, Santa Cruz) predstavlja opterećenje proteina
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 Sl. Lokalizacija RPRM ekspresiju u ekspresijom AGS stanična linija imunofluorescencija RPRM u želučanom raka AGS stanične linije koja je transficirana pCMV6 vektor koji kodira RPRM. Pregled 24 sata nakon transfekcije, stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu i inkubirane s anti-RPRM-zečjim (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) i sekundarnog antitijela Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Pozitivan izraz RPRM (zeleno) uglavnom vidi u citoplazmi. Slike su snimljene u korištenju Axio Vision4 višekanalni softver u fluorescentnim mikroskopom Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF)
S3 Sl. RPRM ekspresija se prigušuje promotora metilaciju. Pregled A) RT-PCR analiza ekspresije mRNA u RPRM AGS želučanom raka stanične linije, sa ili bez inhibitora DNA metilacije 5-azacitidin (1 uM 72 h). GAPDH je korišten kao kontrola. B) Pojačanje RPRM metiliranjem Specifična PCR u AGS želučanog raka stanične linije. Amplifikacija metiliranog MYOD1 je korišten kao kontrola. AGS stanična linija je metiliran na promotorsku regiju. NC: negativna kontrola pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004 pregled (TIF) pregled S4 Sl. RPRM ekspresija se prigušuje promotora metiliranjem (izvorni gel).
A): RT-PCR analizu ekspresije mRNA u RPRM AGS rak želuca stanične linije, sa ili bez inhibitora DNA metilacije 5-azacitidin (1 uM 72 h). GAPDH je korišten kao kontrola. B) Pojačanje RPRM metiliranjem Specifična PCR u AGS želučanog raka stanične linije. Amplifikacija metiliranog MYOD1 je korišten kao kontrola. AGS stanična linija je metiliran na promotorsku regiju. NC:. Negativna kontrola pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005 pregled (TIFF) pregled

Priznanja

Želimo se zahvaliti Sabina Magedson za doprinos u izgradnji tkiva Microarrays. Također bismo željeli zahvaliti Hiroshi kawachi za histološku pregled predmeta, Ignacio Wichmann na korisnim komentarima na našim rukopisa i Oslando Padilla za njegov važna podrška u statističkoj analizi. Pregled