PLoS ONE: sazrijevanje monoklonsko antitijelo 1E11 ciljanim randomizacije u CDR3 Optimizira terapijskih protutijela za ciljanje od HER2-pozitivnog raka želuca

Sažetak pregled

protiv HER2 mišje monoklonsko antitijelo 1E11 ima jak i sinergističko djelovanje protiv tumora u stanicama raka želuca HER2, kada se koristi u kombinaciji s trastuzumab. Mi trenutno optimizirana to antitijelo za ljudske terapeutika. Prva, koja određuju komplementarnost (CDR) iz mišjeg antitijela, i umetnutima gena varijabilnog ljudskim germinativnim imunoglobulinskim. Nema razlike u sklonosti i biološke aktivnosti zabilježen je između himernim 1E11 (ch1E11) i humanizirano 1E11 (hz1E11). Sljedeći, sazrijevanje hz1E11 je izveden od randomizacije CDR-L3 i H3 ostataka praćeno strogim izboru Biopaniranje. Blaži pritisak odabir omiljen izbor više različitih klonova, dok je veći izbor strogoće rezultiralo konvergencije ispiranja izlaz na manji broj klonova s ​​poboljšanom sklonosti. Klon 1A12 je četiri amino kiselinske supstitucije na CDR-L3, a pokazali su 10-struko povećanje afiniteta u odnosu na roditeljsku klona i povećanu potenciju u u pregled antiproliferativnu ispitivanje aktivnosti in vitro s HER2-overepxressing raka želuca Stanice. Klon 1A12 inhibira rast tumora NCI-N87 modelu ksenografta u sličnu učinkovitost samo trastuzumab, te kombiniranim tretmanom 1A12 i trastuzumab potpuno uklanjanje utvrđene tumora. Ovi rezultati sugeriraju da humanizirano i afiniteta sazreo monoklonsko antitijelo 1A12 je vrlo optimizirana molekula za daljnji razvoj terapijsku od HER2-pozitivnih tumora pregled

Izvor. Ko BK, Choi S Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) sazrijevanje monoklonsko antitijelo 1E11 ciljanim randomizacije u CDR3 Optimizira terapijskih protutijela za ciljanje od HER2-pozitivnog raka želuca. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600 pregled

Urednik: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, SAD pregled

Primljeno: 14. travnja 2015.; Prihvaćeno: 12. srpnja 2015; Objavljeno: 30. srpnja 2015 pregled

Copyright: © 2015 Ko et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ova studija je podržan od strane AbClon Inc., i National Research Foundation Koreje (NRF) dodijeljene HS za lijekove Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) , Komercijalna financijer (AbClon Inc.) pruža potporu u obliku plaće za autora (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK i JSL), ali nisu imali nikakvu dodatnu ulogu u studiju dizajna, prikupljanje i analizu podataka, odluka o objavi, ili priprema rukopisa. Specifični uloge tih autora su artikulirani u odjeljku "Autor doprinosa" pregled

suprotstavljenih interesa. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK i JSL su svi zaposleni od strane AbClon Inc., a može imati vlastitu zaliha. HS je na plaćenom konzultantske AbClon Inc., a također posjeduje svoje dionice. Abclon provodi patenata i razvoj proizvoda na spojeve koji se spominju u ovom radu. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK i JSL svi trenutno zaposleni u trgovačkom financijer ovog istraživanja AbClon Inc., a može posjedovati svoje dionice. HS trenutno na plaćeni konzultantske AbClon Inc., a također posjeduje svoje dionice. AbClon ima registriranu patent u Koreji (KR10-1453462, antitijela se mogu vezati specifično na HER2) i podnio PCT prijava (PCT /KR2014 /004317, antitijela se specifično vežu na HER2), u kojoj BKK, YHL, ISH, KTK i JSL navedeni su kao izumitelji. AbClon je također slijedila razvoj proizvoda na humana, afiniteta sazrele antitijela koji se spominju u ovom radu. Oni ne mijenjaju pridržavanje autorovih svim PLoS ONE politika na razmjenu podataka i materijala. Pregled

Uvod pregled

monoklonska protutijela su glavna tretmani u onkologiji i autoimune bolesti, a očekuje se da igraju važnu ulogu u budućnost liječenja bolesti [1, 2]. Više od 30 rekombinantnih protutijela trenutno odobren od strane Američke agencije za hranu i lijekove, od kojih je barem polovica su antitijela protiv raka. Rak želuca je jedan od najčešćih oblika raka i treći vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [3]. U karcinomu želuca prekomjerna ekspresija receptora faktora rasta epiderma (EGFR), ljudski epidermalni receptor činitelja rasta 2 (HER2) i HER3 korelira sa slabim prognozama [4, 5]. Nedavno je HER2 ciljanje monoklonskih antitijela trastuzumab je odobren za liječenje HER2-pozitivnim metastatskim karcinomom želuca i gastroezofagealnog spoja na temelju rezultata trastuzumab s kemoterapijom u naprednim rak želuca (toge) kliničko ispitivanje HER2-pozitivnim [6]. Pregled

Posebni kombinacije međusobno nekonkurentne antitijela koje ciljaju anti-tumorsku aktivnost isti rast receptora In vitro
i in vivo pregled. Kombinacija s HER2 ciljanje protutijela, trastuzumab i pertuzumab, pokazuje povećanu učinkovitost u karcinomima dojke HER2 [7]. Prednosti kombinacije pertuzumab i trastuzumab dodatno je pokazano u predkliničkim i kliničkim ispitivanjima [8, 9]. Ostali protutijela HER2-ciljanje pokazuju bolju učinkovitost u kombinaciji nego kao pojedinačna sredstva, a pokazali su dosljedni down-regulacije razine HER2 i korisnih kombiniranih učinaka u mišjim modelima [10]. Povećana djelotvornost kombinacije antitijela također je dokazana s EGFR ciljanje protutijela [11, 12] i vaskularnu receptor endotelnog čimbenika rasta (3 VEGFR3) -targeting antitijela [13]. Pregled

Terapeutska protutijela obično se intenzivno projektirana posjeduju željena biološka i fizikalno-kemijska svojstva, kao što su niske imunogeničnosti, visokim afinitetom i specifičnošću, optimalno efektorske funkcije, te dobru topivost i stabilnost [14]. Posebno, humanizacija protutijela i afiniteta sazrijevanje su dva od najčešće primjenjuju inženjerskih procesa tijekom razvoja kandidata terapijskih antitijela. Imunogenost terapijskog protutijela ograničava kliničku djelotvornost i proizvodnjom protutijela anti-drug [15] i humanizacija antitijela iz miša ili drugih vrsta je sada standardni postupak za izradu terapeutskih antitijela. Nekoliko metoda Humanizacija su razvijeni da zapošljavaju umske ili empirijske pristupe [16]. područje koje određuje komplementarnost (CDR) presađivanje i metodom prevladavanja ljudskih anti-kimerno antitijelo (HAGA) odgovor [17] je dobro uspostavljena metoda humanizacije. Međutim, izravan cijepljenje mišje CDR na ljudski poredak primaoc sekvence često rezultira gubitkom od afiniteta, pa back-mutacije ostataka okvirna regija (nonijus zona ostatke) popratne struktura CDR petlje često je potrebno [18]. Za In vitro pregled afiniteta sazrijevanja, tri pristupa diverzifikacija se obično koriste: slučajan mutageneze od npr pogrešaka PCR, slučajnim ciljanih ostataka pomoću degeneriranih oligonukleotida, i lancem shuffling. U ciljanoj randomizacije pristupa CDR-i su logički meta za randomizaciju u većini slučajeva jer su somatskih hipermutacija razvio pogodovati mutacija u CDR antitijela [19] i CDR-H3 i CDR-L3 imaju tendenciju da dominiraju interakcije antitijelo-antigen [ ,,,0],20]. Jedan od glavnih problema povezanih s ciljanim randomizacije odabire pozicija koje nisu bitne za vezanje antigena, ali koja može poboljšati afinitet kada se optimalno supstitucija aminokiseline. Alanin može pomoći u određivanju ostataka na slučajnom, pogotovo kada se CDR-i su dugo. Ponekad, alanin mutacija sama povećava afinitet antitijela [21]. Pregled

Mi smo ranije razvili mišje protutijelo ciljanje HER2 (klon 1E11) koji pokazuje sinergijski antitumorsko djelovanje u kombinaciji s trastuzumab u HER2 ekspresijom želučanog raka stanične linije [22 ]. U ovom izvješću, mi opisati kako smo optimizirali 1E11 za terapijskog protutijela strane CDR cijepljenjem na promjenjive gena humanog imunoglobulina klica i sazrijevanje kroz ciljane randomizacije CDR-H3 i CDR-L3. Optimizirani 1E11 antitijela (klon 1A12) pokazuje sinergističko antitumorsko djelovanje u HER2-pozitivnog raka želuca modelima sa u kombinaciji s trastuzumab. Opaženo je da je za klon 1E11, ljudske germinativne varijabilnih gena su pogodni Akceptori za humanizaciju bez afinitetnom redukcijom i supstitucijom CDR-L3 ostataka koji nisu neophodni za vezanje antigena bila je dovoljna za poboljšanje afiniteta za više od 10 puta.

materijali i metode

stanične linije i materijale

NCI-N87 stanice su kupljeni od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) i SG-19 stanica dobiveni su iz Europske Collection stanične kulture (ECACC, Porton Down, UK). Medij za kulturu stanica je bila RPMI 1640 nadopunjen s 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i antibiotici i stanice su kultivirane na 37 ° C uz 5% CO _{2. Trastuzumab i palivizumab je producirao Genentech (South San Francisco, CA, USA) i MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), respektivno. ChromPure humani IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) je korišten kao humanog kontrolnog protutijela IgG iz in vitro
ispitivanjima. IgG antitijela se proizvode pomoću slobodno 293 sustav (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), te pročisti pomoću proteina A-afinitetne kromatografije (GE Healthcare, Piscataway, NJ, SAD). Endotoksina je odstranjen endotoksina uklanjanje Kit (GenScript, Piscataway, New Jersey, SAD) i količine endotoksina su određene detekciju endotoksina Kit (GenScript). Rekombinantni proteini su proizvedeni kako se izlučuju proteine ​​koji koriste Freestyle 293 sustav i pročišćava pomoću proteina-A ili Ni-NTA kromatografije (Qiagen, Valencia, CA, USA) za Fc-tag ili His označena proteina, respektivno. Pregled}

alanin-mutagenezu pretraživanja i Fab pročišćavanje pregled

usmjerena mutageneza za alanina provedena je PCR mutacijom QuickChange ciljanom mutagenezom Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutirani Fab Proteini su i pročišćeni ocijeniti značaj svakog ostatka na aktivnost vezivanja antigena. Ukratko, Escherichia coli pregled DH5a stanice transformirane s vektorom koji nosi pComb3X mutirane gene Fab su uzgojene na 28 ° C u SB mediju. Ekspresija je inducirana s 1 mM izopropil p-D-1-tiogalaktopiranozid ako je optička gustoća (600 nm) kulture dosegla 0,8. Stanične pelete su resuspendirane u hladnom ekstrakcijskom puferu (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA i 300 mM saharoze) i inkubirani na ledu 30 minuta za periplazmatski ekstrakcije. Magnezijev klorid (2,5 mM) se dodaje u bistre ekstrakta nakon centrifugiranja radi uklanjanja slobodnog EDTA prije imobiliziranog metalnog iona afinitetnu kromatografiju (IMAC) pročišćavanja. Pročišćeni Fab proteini su korišteni za ELISA testu vezanja i k pregled _{off analiza pomoću površinske plazma rezonancije (SPR). Pregled}

sazrijevanje pregled

Humanizirano 1E11 klonirani u vektor pComb3X kao Fab format korišten je kao kalup za preklapanje proširenje lančanom reakcijom polimeraze (PCR) mutageneze kao što je ranije opisano [23]. Izopačenim nukleotida (Integrated DNA tehnologije, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(natrag) i 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Naprijed) korišteni su za L-NNK i H-XXS biblioteke, respektivno. N predstavlja A, C, G ili T; M je C ili A; a S je G ili C. Numerirani bazne pozicije pokazuju ručno miješani nukleotida koji se sastoje od 70% jedne baze i 10% od svakog od ostala tri baza: 70% frekvencija baza G, A, T i C za 1, 2, 3 i 4, redom. Za H-2aa biblioteke upotrijebljene su ekvimolarna smjesa sljedećih naprijed mutagenim oligonukleotidima: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', i 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K predstavlja G ili T. Nakon dvije runde overlap extension PCR, Fab knjižnica DNA randomiziranom CDR izrezan s SfiI, ligirani u SfiI probavljenog fagemid vektor pComb3X i elektroporacija u E
. coli pregled soj ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Pregled

visokim afinitetom veziva su izabrani korištenjem topljivog biotiniliranog HER2-ECD proteina. Kuglica veziva su prethodno iscrpljena inkubacijom antitijela faga biblioteka sa 100 ul prethodno blokira Dynabeads M-280 streptavidina (Invitrogen) tijekom 1 sata uz sporo okretanje na sobnoj temperaturi. Biotiniliranog HER2-ECD protein (100 nM- 12:01) se doda u pre-iscrpljena biblioteke antitijela i inkubirano tijekom 1 sata uz rotaciju na sobnoj temperaturi. Potom je dodano 50 uL blokirane streptavidinom magnetske kuglice i inkubira se na rotoru kroz 15 minuta. Zrnca se isperu 10 puta sa 1 mL Tris-puferiranom fiziološkom-Tween 20 (TBST) i dva puta sa 1 ml PBS-a. Vezani fagi eluirani inkubacijom kuglice sa 1 ml 100 mM trietilamin 8 minuta, a zatim neutralizira s 0,5 ml 1 M pregled

ELISA aktivnost vezivanja Ispitivanje pregled

dodano Antitijela Tris, pH 7.4. u Costar 96 jažica površine ploče pol (Corning, Corning, NY, SAD produkt br 3690) prevučene s 1 ug /ml antigena. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata, ploče se isperu tri puta s TBST i inkubirane s anti-humanim peroksidazom zečjeg antitijela hrena (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) za IgG antitijela i od štakora anti-HA-HRP (klon F10, Roche Life Science, Basel, Švicarska) Fab antitijela, respektivno. Ploče su tri puta isprane, tetrametilbenzidin (TMB) supstrata peroksidaze (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) je dodan i reakcija je zaustavljena dodatkom 1 N sumporne kiseline (DukSan, Ansan, Koreja). Apsorbancija na 450 nm je mjerena pomoću Victor X3 instrumenta (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Pregled

Surface plazma rezonanciju analiza pregled

K
_{off analize Fab proteina HER2-ECD-His protein je imobiliziran na površini senzorskog čipa CM5 (GE Healthcare) koristeći postupak kupliranja amina približno 2.000 odgovor jedinica (RU). Pročišćeni proteini Fab su injektirani u 2 ug /ml koncentracije, te brzini protoka od 50 ul /min. k pregled off analiza IgG protutijela, kozjim anti-ljudskim IgG (γ) (Invitrogen, Mačka Br. H10500) imobiliziran na čip CM5 senzor pomoću vezanja amina, i antitijela su zarobljeni u 1 ug /mL 4 minute i stabilizirane kroz 5 minuta pri brzini protoka od 50 ul /min. HER2-ECD-His protein je injektiran pri koncentracijama od 160 nM. Za afiniteta mjerenja antitijela su zarobljeni u približno 50 RU od kozjeg anti-humanog IgG (y) imobiliziran na CM5 čip. HER2-ECD-His protein je injektiran pri koncentracijama u rasponu od 0 do 640 nM. Sensorgrams dobivene su za svaku koncentraciju i vrednovati pomoću BIAevaluation programa. Za epitopom košare, IgG oblik hz1E11 je imobilizirana na odvojenim CM5 čip senzora površina na približno 1000 odgovora jedinica. HER2-ECD-His (320 nM) i antitijela (1 ug /ml) su sekvencijalno dodani 4 minute i stabilizirane kroz 5 minuta pri brzini protoka od 50 ul /min. Pregled}

Stanična održivost analiza pregled

Stanice su stavljene u pločice s 96 jamica (Corning) u 10% FBS-u koji sadrži medij i prethodno kultivirani tijekom 24 sata. Stanice su tretirane sa antitijelima u navedenim koncentracijama i kulture za 4 dana. WST-1 reagens (DoGen EZ-Cytox; Daeil Lab usluga, Seoul, Korea) koristi se za mjerenje stanica održivost. Održivost Relativna stanica je izračunat dijeljenjem apsorbancije svaku jažicu po srednjem apsorbancije tretiranih PBS-bunara u svakoj ploči. pregled

ksenografta studija pregled

atimičnih golih ženke (Daehan Biolink, Chungbuk, Koreja ) su injektirani supkutano u lijevu slabinu području s 5 × 10 ^{6 NCI-N87 stanica u Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tumori su pušteni da rastu do približno 200 mm 3 veličine, a miševi su nasumično podijeljeni u skupine. Životinje su primile intraperitonealnu primjenu protutijela na naznačenim dozama dva puta tjedno. Volumen tumora je izračunat korištenjem formule (L × W × W) /2, gdje L predstavlja najveći promjer tumora, a W predstavlja najmanji promjer tumora. Dvosmjerna ponovljena mjerenja ANOVA slijedi Bonferroni nakon testa provedena je za statističku analizu tumora growth.All životinjske studije su provedena u skladu sa smjernicama NIH-a "Vodič za njegu životinja i njihovo korištenje" i odobrenim protokolom primi Ustanova za njegu životinja i korištenje odbor tvrtke. pregled}

Rezultati

Humanizacija 1E11 koje je provela CDR-presađivanje ljudskih gena zametne linije pregled

kako se razvijaju, da antitijelo, VL sekvence glodavca 1E11 uspoređeni su s ljudskim klica V i J gena repertoari koristeći IMGT /V-Quest alati za analizu [24]. Za teški lanac, IGHV3-48 * 03 i IGHJ4 * 01 pokazao je najveću homologiju s 1E11 kolega, dijele 85% i 87% identičnosti, respektivno. Za laki lanac, ljudska IGKV1-39 * 01 i IGKJ1 * 01 genima prikazane identitet 80% i 81%, respektivno. Ove ljudske geni su odabrani kao akceptora sekvenci usađivanja mišjih CDR-a. Među Vernier zone, koji se sastoji od ostataka u okvirnoj regiji koji su uključeni u predstavljanje CDR struktura podržavajući CDR petlje [18, 25], samo jedan ostatak na poziciji 49 _{H teškog lanca razlikovala između miša i humane sekvence. Prema tome, humanizirano 1E11, hz1E11, ima samo jednu mišji ostatak u okvirnim područjima (Slika 1). Pregled}

aktivnost vezivanja hz1E11 na izvanstanične regije (ECD) od HER2 je ekvivalentan onom ch1E11 (Slika 2A), i afinitet trastuzumab ch1E11 i hz1E11 bila 3 nM, 23 nM i 23 nM, redom. Također, potvrdio je da hz1E11 vezan za pod-domene IV poput roditeljskog ch1E11. Trastuzumab također veže na pod-domene IV [26]. in vitro pregled antiproliferativne aktivnosti hz1E11 kao jedino sredstvo te u kombinaciji s trastuzumab također su ekvivalentni onima ch1E11 (Slika 2C). U prethodnom istraživanju [22] je izvijestio da ch1E11 imali in vivo antitumorsko djelovanje pregled sličan onom trastuzumaba kao jedino sredstvo, i kombinacije ch1E11 i trastuzumab rezultiralo u indeksu regresije tumora (TGI) za 95,1%. Slično tome, hz1E11 kao jedno sredstvo je imao slično in vivo pregled antitumorska aktivnost je trastuzumab (S1 Sl) i kombinacije hz1E11 s trastuzumab također pokazuju o dozi ovisan djelovanje protiv tumora u modelu NCI-N87 ksenograft miša ( Slika 2D). Antitijelo kombinirano liječenje na 1 mg /kg svakog od hz1E11 i trastuzumab rezultiralo sličnom aktivnošću protiv tumora s trastuzumab jednog tretmana na 10 mg /kg, a po 2,5 mg /kg kombinacije od i iznad da se utvrđena tumor stabiliziran ili počeo regresiju (br statistički značajna razlika [ P pregled < 0,05] uočena kod 2,5, 5 i 10 mg /kg kombinacije). Ovi rezultati pokazuju da hz1E11 ima afinitet i biološku aktivnost jednaku ch1E11, što hz1E11 pojačava antitumorsku aktivnost trastuzumaba kada se koriste u kombinaciji. Pregled

alanin CDR-H3 i CDR-L3

identificirati kritične ostataka za interakcije antigen-antitijelo, traženje mutageneze alanina provedena je u CDR3 iz teških i lakih lanaca (CDR-H3 i CDR-L3). Učinci mutacije su određen analizom vezanja aktivnost pročišćenih Fab proteina indirektnim ELISA testom. U CDR-H3, alanin supstitucije na položaju Gly98 _{H ukinula vezanje Fab na HER2 i G97 HA i T99 HA mutanti su pokazali smanjenu aktivnost vezanja (slika 3A). U CDR-L3, alanin zamjena imali mnogo manje učinke (Slika 3b). k pregled off vrijednosti alanina mutanti su analizirani pomoću SPR protiv immbolized HER2-ECD proteina. Potvrdili smo da je teški lanac G98A mutant potpuno izgubio obvezujućih aktivnosti, a susjedne T99 HA i G97 HA mutanti rezultiralo 32 puta, a 17 puta većim k pregled off vrijednosti odnosno (Slika 3C). Ovi rezultati pokazuju da teški lanac Gly98 H funkcionalno kritičan i obližnjih ostaci su funkcionalno važan za interakcije antigen-antitijelo. Pregled}

sazrijevanje hz1E11 pregled

sazrijevanje hz1E11 provedeno izgradnjom teškog ili lakog lanca CDR3 varijante biblioteka zatim izboru ravnotežne bibliotekama faga antitijela. Za laki lanac, glutamin rezidue na položajima 89 _{L i 90 L nisu raznoliki jer glutamin se obično nalaze na tim položajima devet amino kiselina-longCDR-L3 sljedovima na 59% i 73% frekvencijama, odnosno [ ,,,0],27]. Pozicije 91 L-94 L su nasumično pomoću NNK degenerirane kodon (L-NNK). Za teški lanac, pozicija 95 H -100a H randomizirano je korištenjem XXS kodon (H-XXS), dizajniran tako da je na prvom i drugom položajima nukleotida od raznolika kodona bazi divljeg tipa došlo 70 % šanse, svaki od druga tri baze dogodila na 10% -tnom učestalosti i treći pisma kodoni sintetizirani su upotrebom ekvimolarne smjese G i C (Slika 4A). Visok afinitet veziva su odabrani od visoke strogosti ili niske strogoće izdvajanje (Tablica 1). Pregled}

U odnosu na niske strogoće Ispiranje L-NNK knjižnica u kojem 100% sekundarnim, nisu u vlasništvu, i četvrti okrugli izlaz klonovi prikazivali su ELISA pozitivne, za visoke strogosti pomicanja četvrti okrugli izlaz ploda ne vezivo na sve, a samo jedna trećina od treće okruglih izlaznih klonova su ELISA pozitivne (Tablica 1). Odabrani klonovi iz CDR-L3 knjižnice uključene mnoge sekvence koje su imale sve četiri randomizirana CDR-L3 pozicije mutirani, za razliku CDR-H3 knjižnica od kojih je većina odabranih klonova zadržane na pozicijama na divlji tip slijed 97 _{H -100 H (vidi dolje). Različite strategije ispiranja dala različite obrasce slijed obogaćivanje. Na primjer, da laki lanac varijantu klona 1A12 (P 89LQNAYAPWT 97 l), je izoliran iz visoke strogosti ispiranja, ali ne i od niske strogosti pomicanja, a teški lanac varijantu klona 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) također je odabran samo s visokim strogosti pretraživanja. Zanimljivo, 59% pojedinačnih antitijela 4 ^{th izlaz s niskim rigoroznih izdvajanje L-NNK biblioteke imao je alanin na poziciji 92 L, u skladu s analizom alanina (Slika 4B). Pregled}}

Gotovo svi klonovi koji su izolirani iz H XXS biblioteke imala istu sekvencu na 97 _{H -100 H kao prvotnog klona, ​​i pokazao jasnu obogaćenje Asn-Tyr sekvence na 95-96. Kako bi se dalje procijeni doprinos CDR-H3 ostataka na antigen-antitijelo vezanje, dodatni CDR-H3 biblioteka je konstruirana s dva NNK slučajnim kodon unosom CDR-H3 (H-2aa, slika 4A). U low-strogosti pomicanja, mutanti na položaju 95 H, 96 H, 99 H, 100 H i 100a H izabrani su u prvom krugu pomicanja, ali samo mutanti na položaju 95 H i 96 H obogaćeni su u četvrtom kolu izlazni (Tablica 1). Nismo mogli otkriti mutanti na pozicijama Gly97 H i Gly98 H u bilo ispiranja strategijama i izlaza. Pregled}

Affinity i obvezujuća aktivnost odabranih klonova pregled

Da bi se procijenio učinak kombinacije varijanti teških i lakih lanaca afiniteta sazreli, IgG antitijela s kombinacijama afiniteta sazrele teških i lakih lanaca su proizvedeni i njihove k pregled _{off vrijednosti su utvrdili pomoću SPR analiza (tablica 2). Između dvije varijante lakog lanca i dvije varijante teških lanaca, 1A12 izvedene iz L-NNK pokazala najveće poboljšanje (16 puta). Kombinacija lakog lanca 1A12 s optimiziranim teškog lanca klona 1B12 rezultirao je 24 puta poboljšanja u K
off nad roditeljskom hz1E11, a za ostale kombinacije k pregled off vrijednosti bile slične ili veće od onog 1A12. Jer je 1.5-struko dodatno poboljšanje kombinacijom L-1A12 + H-1B12 nije značajno velik, klonovi 1A12 i 1F11 (varijante laki lanac) su odabrana za daljnju karakterizaciju minimiziranja razliku sekvence antitijela afinitetno zrelih od roditeljskog klon. Konstante disocijacije za afiniteta sazrio klonova, također utvrđene SPR analiza, bili su više od 10 puta niža od one roditeljske klon hz1E11 i usporediva je s trastuzumab (tablica 3). Pregled}

Kako bi se utvrdilo je li afiniteta -matured hz1E11 klonovi se vežu na isti epitop kao i roditeljska hz1E11, vezanje 1A12 i 1F11 za HER2-ECD koja je prethodno vezana na hz1E11 je analiziran SPR. Oba klona mogli vezati na monomernom HER2-ECD-His proteina snimljenom imobilizirane 1E11, dok trastuzumab mogli (Slika 4C). Osim toga, utvrđeno je da je 1A12 epitop ne preklapa s onom trastuzumab (slika 4D). Klonovi 1A12 i 1F11 također vežu za pod-domene IV poput roditeljskog klona hz1E11 (slika 4E). Ovi podaci ukazuju na to da epitopi 1A12 i 1F11 nisu promijenila proces sazrijevanje. Pregled

Učinkovitost afiniteta sazrio hz1E11 klonove

I 1A12 i 1F11 antitijela pokazala neznatno povećao antiproliferativne aktivnosti kao jedno sredstvo u odnosu na hz1E11 u NCI-N87 i SG-19 želučani rak stanične linije koje prekomjerno eksprimiraju HER2 (Slika 5A i 5B), dok je u kombinaciji s trastuzumab, njihovi antiproliferativne aktivnosti bio nadmoćan trastuzumab sami i ekvivalentan hz1E11 plus trastuzumab , Anti-proliferativna aktivnost 1A12 i 1F11 potvrđena in vivo pregled u NCI-N87 modelu ksenografta. Izuzetno dobro antitumorsko djelovanje bilo je očito u kombinaciji s trastuzumabom onom svakog pojedinačno sredstvo kod oba modela ksenografta (Slika 5C). Pregled

Rasprava pregled

Unatoč poticajnih kliničkih rezultata dobivenih s HER2 ciljanja trastuzumab antitijela u liječenje karcinoma želuca, još uvijek postoje potrebe za jače HER2 ciljane terapije [6]. Kombinacija nekonkurentski protutijela za ciljanje receptora, kao što su HER2, EGFR, te VEGFR3, može povećati djelovanje protiv tumora u životinjskim modelima [11-13, 28]. Pertuzumab drugim protutijelom HER2 ciljanje, odobren je za uporabu u kombinaciji sa trastuzumab u liječenju metastatskog karcinoma dojke [29]. U prethodnom istraživanju, razvili smo novi HER2 cilja antitijela, 1E11, koji je pokazao da ima značajan anti-tumorsku aktivnost kao jedino sredstvo i sinergijski učinak u kombinaciji s trastuzumab In vitro pregled i in vivo pregled, [22]. Aktivnost anti-tumor 1E11 plus trastuzumab kombinacija je bolja ne samo trastuzumab jednog tretmana, nego i na kombinaciju pertuzumab i trastuzumab. U ovom izvješću opisao je humanizacija i naknadno sazrijevanje miša izvedene iz hibrida 1E11 monoklonskih protutijela.

Initial pristupi za smanjenje potencijalne imunogenosti neljudskim varijabilnih regija pomoću CDR-cijepljenjem u ljudski okvir značajno smanjiti imunogeničnost terapijskih antitijela [15, 17]. Superhumanization pomoću ljudske germinativne okvire kao predložak je predložen kao vrhunskog humanizacije metodologije kako bi se izbjeglo navodni izvršne epitopa T-stanice izvedene od somatskih hypermuations ljudskog okvira [30-32]. Sugerirano je da se antitijela kodiranih pomoću gena zametne linije segmenata su strukturno fleksibilan, da smjestiti vezanje na različite antigene [33-35]. CDR mišjeg 1E11 protutijela, kao i jedan dio u Vernier zoni V _{H (Ala49 H) su cijepljene na ljudskom zametne linije varijable i spajanje gena s najvišim homologije prema roditeljskom antitijela (Slika 1). Prema tome dobiveno humanizirano protutijelo, hz1E11 pokazala gotovo identičnu afinitet i biološku aktivnost u roditeljsko protutijelo (Slika 2). Pregled}

Izbor ostataka za randomizaciju je kritičan korak u ciljanoj randomizacije pristupu sazrijevanje zbog praktičnih ograničenja protutijela veličine knjižnice i tehnologije selekcije. Alanin i in silico
analizi sekvence protutijela, osobito u CDRs, koristan je za izbor ciljnih rezidua randomizacije i olakšava proces sazrijevanja afiniteta. U alanin analiza skeniranja CDR-H3 od hz1E11 je G98A mutant potpuno izgubio aktivnost vezanja i G97A mutant pokazali smanjenu aktivnost vezanja (slika 3A). Izravna alteracije esencijalnog paratop ostatka obično rezultira ukupnim gubitkom sposobnosti vezanja protutijela [26, 33, 36]. Stoga, konzervativniji pristup CDR-H3 randomizacije se, uporabom bilo ručno miješani oligonukleotid koji je ukošena prema roditeljske sekvence ili dva NNS slučajni skeniranje kodona CDR-H3. Kao što se očekuje iz analize alanina, gotovo svi klonovi koji su izolirani od CDR-H3 knjižnice imao je slijed 97 _{H-100a H jednak prvotnog klona (G 97HGTAS 100aH) . pregled}

alanin rezultati skeniranja pokazuju da su svi CDR-L3 ostaci su nepotrebno, iako su neki od mutacija čini se smanjiti afinitet (Slika 3b). Dakle, četiri pozicije CDR-L3 (91 _{L-94 L) u potpunosti su nasumično pomoću NNK degenerirane kodon. Analiza slijed odabranih klonova potvrdila alanin analiza skeniranja; većina odabranih klonova iz CDR-L3 knjižnici su sve četiri randomizirana CDR-L3 pozicije promijenila od roditeljskog ostatka, za razliku od CDR-H3 optimizaciju rezultata u kojoj je većina odabranih klonova iz knjižnice imala isti slijed kao roditeljski hz1E11 u srednjem dijelu CDR (tablica 1). Klonovi s najvećim poboljšanjem afiniteta za došli iz CDR-L3 knjižnici. To je vjerojatno da se CDR-H3 od hz1E11 je već blizu optimalnog, a većina mutacija, posebno u područje 97 H-100 H, su štetni za afinitetom vezanja, a CDR-L3 slijed nije kao optimalno i mutacija u ovoj regiji može rezultirati značajnim poboljšanjem afiniteta. L-NNK knjižnice ispiranja izlazi su obogaćene klonova s ​​hidrofobnim aminokiseline na položaju 91 L, mala aminokiselinskog 92 L, te aromatske amino kiseline na 93 L. Ovaj obrazac je nešto različit od roditeljskog CDR-L3 slijed Q 89LQLYSTPWT 97 l i ponovno sugerira da CDR-L3 sekvenca roditeljski 1E11 protutijela bila podoptimalan i time mu prostora za afinitetnu poboljšanje.}