PLOS ONE: perte d'expression de Reprimo, un arrêt du cycle cellulaire Gene induit p53, corrèle avec Invasive stade de progression de la tumeur et de p73 expression dans gastrique Cancer

Résumé

Reprimo (RPRM), un effecteur en aval de l'arrêt du cycle cellulaire induite par p53 à G2 /M, a été proposé comme un gène suppresseur de tumeur putatif (STG) et en tant que biomarqueur potentiel pour la détection non invasive du cancer gastrique (CG). L'objectif de cette étude était d'évaluer le silençage épigénétique du gène RPRM par méthylation du promoteur et de sa fonction de suppresseur de tumeur dans des lignées de cellules GC. En outre, la signification clinique du produit protéique de RPRM et son association avec p53 /p73 famille protéine suppresseur de tumeur a été explorée. silençage épigénétique du gène RPRM par méthylation du promoteur a été évaluée dans quatre lignées cellulaires GC. L'expression des protéines de RPRM a été évaluée chez 20 tumorale et non tumorale cas appariés. La signification clinique de l'association RPRM avec p53 /p73 suppresseur de tumeur famille de protéines a été évaluée dans 114 cas de GC. Fonction tumeur suppresseur a été examiné par des tests fonctionnels. l'expression du gène RPRM était corrélée négativement avec la méthylation du promoteur (Spearman r = -1; p = 0,042). RPRM surexpression inhibe la formation de colonies et la croissance indépendante de l'ancrage. Dans des échantillons cliniques, l'expression de la protéine du gène RPRM a été détecté dans 75% (15/20) de non-tumeur muqueuse adjacente, mais seulement dans 25% (5/20) des tissus tumoraux gastriques (p = 0,001). corrélations clinicopathologiques de la perte d'expression de RPRM étaient significativement associés à stade invasif du GC (stade I à II-IV, p = 0,02) et une association positive entre RPRM et le gène p73 expression du produit de protéine a été trouvée (p < 0,0001 et la valeur kappa = 0,363 ). En conclusion, le silençage épigénétique du gène RPRM par la méthylation du promoteur est associée à la perte d'expression de RPRM. tests fonctionnels suggèrent que RPRM se comporte comme un TSG. Perte d'expression du produit protéique du gène RPRM est associé au stade invasif de la CG. association positive entre RPRM et d'expression de p73 suggère que d'autres membres de la famille du gène p53 peuvent participer à la régulation de l'expression RPRM

Citation:. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- estay V, et al. (2015) Perte d'expression de Reprimo, un arrêt du cycle cellulaire induit par Gene p53, corrèle avec Invasive Stade de la progression tumorale et p73 Expression dans le cancer gastrique. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834

Academic Editor: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, ETATS-UNIS

Reçu le 16 Janvier 2015; Accepté le 25 Mars 2015; Publié: 8 mai 2015

Droit d'auteur: © 2015 Saavedra et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier et son soutien des fichiers d'information

financement:.. Ces travaux ont été soutenus par des subventions CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) et CONICYT-FONDAP—30011 (AHC et JCR) du gouvernement du Chili

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

le cancer gastrique introduction (GC) est la troisième principale cause de décès lié au cancer et le cinquième plus malignité commune dans le monde [1]. Malgré l'incidence décroissante de GC, en partie en raison de la reconnaissance de certains facteurs de risque (par exemple Helicobacter pylori
et des facteurs environnementaux), il reste l'un des cancers les plus fréquents dans le monde entier et continue d'être un défi clinique [2 , 3]. carcinogenèse gastrique implique une accumulation progressive d'altérations génétiques et épigénétiques, conduisant à une dysrégulation de l'expression des oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs (STG) [4]. Reprimo (RPRM) est un roman putative TSG [5,6] et associée à la carcinogenèse gastrique [7]. En outre, nous avons proposé que l'ADN acellulaire RPRM méthylée peut être un biomarqueur potentiel pour la détection non invasive de GC [8,9].

RPRM est une protéine fortement glycosylée localisée principalement dans le cytoplasme et il a été identifié comme un effecteur en aval de l'arrêt du cycle cellulaire induite par p53 à G2 /M [10]. Les rapports suggèrent que l'expression de RPRM est régulée par deux mécanismes, l'un par méthylation de l'ADN dans sa région promotrice [8] et l'autre par voie p53 [10]. Cependant, des études plus récentes ont pas été en mesure de confirmer ces résultats [6]. D'autre part, la signification clinique de RPRM a été peu étudiée [11]. Dans la présente étude, nous avons évalué le rôle de méthylation de l'ADN dans la régulation de l'expression des RPRM, sa signification clinique et son association avec les membres de la famille de tumeur p53 de protéine suppresseur (à savoir p53 et p73). Nous avons trouvé que la méthylation dense dans la région du promoteur de RPRM, qui a été associée à une perte d'expression dans des lignées de cellules GC. Dans les cas cliniques, la perte de l'expression est associée à l'étape de l'invasivité de la CG. De plus, nous avons observé une association positive entre l'expression de RPRM et p73, ce qui suggère que d'autres membres de la famille du gène p53 pourraient être de nouveaux candidats pour la régulation de l'expression RPRM.

lignées cellulaires de méthodes et des échantillons de tissus

Quatre lignées de cellules GC (AGS, SNU-1, KATOIII et NCI-N87) ont été achetés auprès de American type Culture Collection (ATCC) en Décembre 2012 cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Hyclone) et complétées par 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et on maintient à 37 ° C, 5% CO _{2. Vingt tumorales et non tumorales muqueuse adjacente (Ntam) échantillons ont été sélectionnés pour l'évaluation de l'expression RPRM. Six ont été retenus pour l'évaluation des RPRM méthylation. Une cohorte de 114 patients GC a été sélectionné pour les corrélations clinico du produit protéique du gène RPRM. Des échantillons de tissus provenant de cas individuels ont été classés conformément à la Société de recherche japonais pour les recommandations de cancer gastrique [12]. Tous les cas ont été recrutés dans l'Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chili entre 1993-2000 [13] et les caractéristiques clinico sont présentées dans le tableau 1. Cette étude a été approuvée par le Institutionnel Les commissions d'examen de Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Ética Científico) et ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chili). Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque participant impliqué dans l'étude.}

microréseau tissulaire et immunohistochimie

microarrays de tissu (TMA) ont été effectuées en utilisant un tableau II instrument Tissue Manuel (Instruments Beecher) comme précédemment décrit [14,15]. sections de base (de 4 um) ont été soumises à une immunocoloration par Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), selon les instructions du fabricant. Les anticorps utilisés dans cette étude étaient RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (clone 318-6-11, Dako Danemark) et la protéine p73 α (clone 24, Novacastra). Les résultats de l'immunocoloration dans la tumeur entière et Ntam ainsi que des sections TMA ont été considérés comme positifs pour RPRM si > 30% des cellules épithéliales a montré une coloration cytoplasmique, > 10% coloration nucléaire pour p53, ou > 10% nucléaire /cytoplasmique pour p73 . L'évaluation de la coloration immunohistochimique a été réalisée indépendamment par deux pathologistes (JV & GC)., Qui ont perdu des données cliniques

séquençage au bisulfite et RT-PCR quantitative l'analyse d'expression

ADN provenant de lignées de cellules GC était extrait en utilisant le réactif Trizol (Life Technologies) selon le protocole du fabricant, suivie par la conversion au bisulfite en utilisant la méthylation de l'ADN kit d'or EZ (Zymo Research). RPRM promoteur a été amplifié à partir d'ADN traité au bisulfite en utilisant des amorces 5 'RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3' et 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3 ', permettant la détection des 52 sites CpG au sein d'une région de promoteur de 509 pb. Les produits de PCR ont été purifiés avec le kit d'extraction de gel QIAXEN II (Qiagen) et ligaturés dans le vecteur pGEM-T. Le produit de ligature a été utilisé pour transformer des cellules compétentes E
. coli
cellules Top 10, selon le mode opératoire décrit par Inoue et al. [16]. Les transformants ont été sélectionnés sur des plaques de gélose LB supplémentées avec de l'ampicilline (100 pg /ml), X-Gal (50 mg /ml) et IPTG (100 mM). Les colonies blanches résultantes ont été évaluées par PCR de colonies. Les clones positifs ont été cultivés sur un milieu liquide (LB /ampicilline) jusqu'à la fin de la phase exponentielle (DO600 = 1) et des plasmides d'ADN ont été purifiés en utilisant le kit de système de mini-préparation de rendement en produit pur (Promega). La région promotrice de RPRM a été séquencée en utilisant M13 universelle (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'et 5'-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3') par Macrogen (http://dna.macrogen.com). BiQ logiciel de l'analyseur a été utilisé pour l'analyse des clones séquencés. Tous les clones pGEM-T positifs ont été cultivés sur milieu LB /ampicilline et stockés à -80 ° C (dans 14% de glycérol). L'ARN total a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) et l'ADNc a été synthétisé en utilisant le kit de synthèse d'ADNc iScript selon les instructions du fabricant (Biorad). Par la suite, l'ADNc a été utilisé pour chaque réaction de PCR avec chaque paire d'amorces. Les amorces spécifiques RPRM sont les suivantes: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'et 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. en temps réel une analyse par RT-PCR a été réalisée en utilisant LightCycler Fast Start DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) dans un système 1.5 LightCycler Détection en temps réel (Roche). analyse quantitative relative normalisée par rapport à RPL-30 a été réalisée par la méthode de seuil de cycle de comparaison [17]. Les RPL-30 amorces spécifiques sont les suivantes:. 30_Fw RPL-5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'et 5'-RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

de validation d'anticorps RPRM par immunoblot et 3x10 Immunofluorescence ^{5 cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec pCMV6 /RPRM ou pCMV6 (Origène) vecteur vide, en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen), selon le protocole du fabricant. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été incubées pendant 24 h dans du RPMI 1640 avec 10% de FBS en présence ou en l'absence d'un inhibiteur de N-glycosylation Tunicamicyn (10 ng /ml). Les cellules ont été récoltées et des lysats de cellules entières ont été extraites en utilisant un tampon Triton (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% de Triton X-100) avec le kit de cocktail d'inhibiteur de protéase (P8340, Sigma Aldrich) et le kit de cocktail Phosphatase Inhibitor ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Les concentrations en protéines ont été déterminées en utilisant le réactif de Bradford démarrage rapide (Bio-Rad). Cinquante ug de protéine ont été séparés sur SDS-PAGE, 4% à 12%. Les protéines sur les gels ont été électrotransférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène en utilisant le système de mini-transblotter (Bio-Rad, Hercules, CA). Les membranes de difluorure de polyvinylidène ont été bloquées dans du lait à 5% dans une solution saline tamponnée au Tris /Tween 20 (TBST) pendant 1 h. un anticorps primaire anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) a été dilué à 1: 1000 dans du TBST /3% de SAB /et les membranes ont été incubées dans des anticorps primaires à 4 ° C pendant une nuit. Les membranes ont été lavées trois fois dans du TBST pendant 10 min à chaque fois. Peroxydase anti-lapin conjugué à un anticorps secondaire (Santa Cruz) a été dilué 1: 2000 dans du TBST et on a incubé sur les membranes pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été lavées comme ci-dessus et visualisés à l'aide SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) selon le protocole du fabricant. Pour évaluer la localisation cellulaire du RPRM, immunofluorescence a été réalisée. les cellules AGS transitoirement transfectées avec pCMV6-RPRM ou pCMV6 ont été cultivées sur des lamelles. Les cellules AGS transitoirement transfectées ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4% pendant 20 min à température ambiante et ensuite lavées trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les cellules ont été perméabilisées dans 0,1% de Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) pendant 10 min, bloqué dans 3% de BSA pendant 1 h à température ambiante, et ensuite marquées avec un anticorps anti-RPRM (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Après un lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps Alexa Fluor 488 conjugué (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) pendant 1 h à température ambiante. Les images ont été acquises par laser de fluorescence microscopie confocale à balayage (voir Informations complémentaires S1 et S2 figures).}

Culture cellulaire et transfection

Pour les expériences de transfection stable, les cellules AGS ont été plaquées à 3x10 ^{5 cellules /100 mm boîte de culture et transfectées après 24 h avec pCMV6-RPRM ou pCMV6 (Origène) vecteur vide en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen), selon le protocole du fabricant. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été cultivées dans les mêmes conditions avec G418 (500 g /ml). Les milieux de culture a été changé toutes les 24 h pendant 14 jours.}

Colony essai de formation

Pour l'essai de formation de colonies, 200 cellules ont été transfectées de façon stable avec pCMV6-RPRM ou pCMV6 vecteur vide. Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Hyclone) et supplémenté avec 10% de FBS. Les milieux de culture a été changé toutes les 24 h. Les colonies ont été colorées en utilisant du cristal violet 0,4% (Sigma) dans 50% de méthanol, 21 jours après l'ensemencement initial, et comptées à 20 images prises au microscope inversé (système d'imagerie cellulaire Evos XL Core Life Technologies). Chaque transfection a été réalisée en triple. En outre, répliqués expériences ont été réalisées pour obtenir d'autres clones pour une analyse d'expression.

indépendante de l'ancrage essai de croissance

croissance cellulaire indépendante de l'ancrage a été analysé par étalement à 1% d'agarose contenant 2x10 ^{5 cellules stables transfectées avec pCMV6-RPRM ou pCMV6 vecteur vide dans des plaques 6 puits. Les cellules ont été alimentées par semaine recouvrant une solution fraîche-agar mou, et les colonies ont été photographiées après 4 semaines d'incubation. L'expérience a été réalisée en triplicate.}

Analyse statistique

Spearman coefficient de corrélation a été calculée pour analyser la corrélation entre RPRM méthylation et les niveaux d'expression génique. Les variables catégorielles ont été analysées par Pearson Test de Chi-Square (recto-verso), la p-valeur a été corrigée en utilisant une analyse de régression logistique. Les variables continues ont été analysées en utilisant t
test et les données de l'étudiant a été exprimé en tant que moyenne ± écart-type. test de Kappa a été utilisé pour analyser la corrélation entre l'expression de RPRM et d'expression de p73. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) progiciel statistique et logiciel GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, États-Unis). Toutes les valeurs étaient de deux à queue, à l'exception de Spearman corrélation. La signification statistique a été définie comme p < 0,05.

RPRM méthylation et d'expression de

Résultats dans des lignées cellulaires de cancer gastrique

Auparavant, nous et d'autres ont rapporté que l'expression de RPRM peut être restaurée par l'agent de déméthylation 5-aza -2-désoxycytidine (Voir Informations complémentaires S3 et S4 figures) [5,8,18]. Cependant RPRM méthylation a été faiblement corrélée avec son expression [18]. Pour mieux évaluer l'association entre le promoteur RPRM méthylation et l'expression génique, la région promotrice complète du gène de RPRM a été analysé par séquençage au bisulfite de l'ADN dans les quatre lignées cellulaires GC (AGS, SNU-1, KATO III et NCI-N87) (figure 1A). Ainsi, l'état de méthylation des sites CpG 52, située entre les nucléotides -207 et +302 par rapport au site de démarrage de transcription (TSS), ont été analysés. Cette analyse montre méthylation dense dans des lignées de cellules AGS et SNU-1 (89,6% et 86%, respectivement), par rapport à KATO III et NCI-N87 (79,7% et 51,8%, respectivement) (p = 0,0002) (figure 1B) . Ensuite, le niveau d'expression de RPRM a été déterminée par RT-PCR quantitative. expression faible du gène RPRM a été observée chez AGS et SNU-1 par rapport à KATO III et les lignes NCI-N87 cellulaires (p < 0,0001) (figure 1C). Par l'analyse de corrélation de Spearman a révélé une corrélation négative significative a été trouvée entre la densité de la méthylation et l'expression du gène RPRM (r = -1; p = 0,042) (figure 1D). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la méthylation de la région de promoteur RPRM joue un rôle essentiel dans la régulation de l'expression de RPRM.

RPRM méthylation et d'expression dans les tissus de cancer gastrique

Pour corroborer les données précédentes dans les tissus du GC , les niveaux de méthylation de l'RPRM ont été déterminées dans des échantillons de tumeurs 6 et Ntam appariés. Les résultats indiquent un niveau de méthylation supérieur dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus Ntam (voir la figure 1E). Afin d'étudier l'expression du produit protéique du gène RPRM dans les tissus de l'analyse GC IHC a été réalisée. l'expression RPRM positive a été observée principalement dans le cytoplasme des cellules épithéliales gastriques. RPRM protéine du gène d'expression a été détectée dans 75% (15/20) des Ntam tissus échantillons. Cependant, seuls 25% (5/20) des échantillons de tumeur a montré une expression du produit protéique du gène RPRM (figure 2). Ces différences sont très significatives (p = 0,001) et suggèrent que l'expression de RPRM est perdue dans les tissus GC. Pour évaluer l'importance clinique de cette perte d'expression de RPRM une cohorte de 114 cas de GC a été évaluée. Perte d'expression RPRM a été trouvé dans 62% (71/114) des cas de GC. corrélations clinicopathologiques d'expression de RPRM sont présentés dans le Tableau 1. Progression du stade I GC aux stades II-IV (p = 0,006) et métastase ganglionnaire (p = 0,037) étaient significativement associés à la perte d'expression du produit protéique du gène RPRM. Cependant, l'analyse de régression logistique montre que seule la progression de la phase I à II-IV est significativement associée à une perte du produit protéique du gène RPRM (p = 0,020).

dosage fonctionnel de RPRM dans le cancer gastrique (formation de colonies et d'ancrage croissance -indépendante)

Comme la perte d'expression de RPRM était associée au GC et surtout avec la progression de la phase I à II-IV, un rôle de suppresseur de tumeur de RPRM pourrait être plausible. Par conséquent, des essais fonctionnels tels que in vitro
formation de colonies et les essais de croissance indépendante de l'ancrage ont été réalisées en cellules AGS transfectée avec pCMV6 /RPRM (figure 3A). Non lignées cellulaires exprimant AGS transfectées avec des plasmides d'expression de RPRM a montré une réduction significative du nombre de colonies par rapport à pCMV6- lignes vides de vecteur transfectées cellules transfectées avec pCMV6-vecteur vide (p < 0,05) (figure 3B). L'effet de la surexpression RPRM sur la croissance indépendante de l'ancrage dans un essai de formation de colonies sur gélose molle a également été évaluée dans AGS clones de lignées cellulaires transfectées stables. Les colonies ont été comptées après l'ensemencement initial et l'incubation dans la gélose molle pendant 4 semaines. Les cellules transfectées avec un vecteur vide ont montré la croissance des colonies robuste, par le nombre et la taille des colonies. Cela a été grandement réduite lorsque RPRM a été ré-exprimé dans les cellules AGS (figure 3C).

Association de l'expression RPRM et p53 /p73 protéine suppresseur de tumeur famille dans le cancer gastrique

RPRM a été définie comme un gène p53 médiée par des cellules fibroblastiques embryonnaires [18]. Cependant, il a été rapporté que la régulation de l'expression RPRM peut être indépendant de l'état du gène p53 dans les cellules neuronales traitées avec du cuivre [19]. D'autre p73 main peut activer la transcription des gènes p53 sensibles [20]. Compte tenu de ce contexte, nous avons évalué l'expression de p53 et d'autres membres de la famille de la protéine p53, p73 STG. L'expression de p53 a été localisé dans le noyau des cellules de la muqueuse gastrique. l'expression de p53 positif a été détecté dans 23,5% (20/114) des cas de GC. taille de la tumeur n'a été associée à l'expression de p53 (p = 0,035, tableau 2). L'expression de p73 a été localisé dans les noyaux des cellules et le cytoplasme des cellules épithéliales. expression de p73 positive a été trouvée dans 30,6% (34/114) des échantillons de GC. Fait intéressant, les corrélations clinicopathologiques significatives de l'expression de p73 ont été associés à l'étape invasive (stade I 55,6%; 10/18 aux stades II-IV 25,8%; 24/93, p = 0,012) et métastase ganglionnaire (p = 0,038) (tableau 2 ). Comme les pertes d'expression de RPRM et de protéine du gène p73 produits ont des corrélations clinicopathologiques similaires, nous avons évalué l'association entre les expressions des niveaux des deux protéines. À cette fin, des cas ont été divisés en quatre groupes selon l'expression des protéines et RPRM p73 produits. L'analyse a montré que 22 sur 111 cas de GC ont été positifs pour les deux protéines RPRM et p73, alors que 57 sur 111 étaient négatifs. Cette association était statistiquement significative (p < 0,0001). Avec une valeur kappa de 0,363 (tableau 3)

Discussion

RPRM est une protéine cytoplasmique hautement glycosylée, initialement identifié comme un effecteur en aval de p53 induite par l'arrêt du cycle cellulaire en G2 /M. Auparavant, il a été proposé que RPRM est réduit au silence par méthylation du promoteur, même si elle a été faiblement corrélée avec son expression [5,8]. En outre, il a été proposé RPRM comme un gène suppresseur de tumeur putatif dans le carcinome des cellules rénales et les tumeurs hypophysaires [5,6]. Dans cette étude, nous avons démontré que l'expression du gène RPRM est fortement associée à son statut de méthylation de la région de promoteur, ce qui suggère le silençage épigénétique de l'expression du gène RPRM. En outre, nous montrons que le produit protéique du gène RPRM a été diminuée dans les tissus GC comparée à la muqueuse gastrique non cancéreuse. Ces résultats sont similaires à celle de Luo et al
. [11], qui a rapporté une perte de RPRM en GC par rapport à des échantillons de tissus de l'ulcère gastrique. En outre, notre constatation concernant la perte d'expression de RPRM dans la transition de la phase I aux stades II-IV est cliniquement pertinente. Luo et al
. [11] ont rapporté une conclusion similaire, mais dans un petit nombre de stade I GC cas (n = 15). Ces résultats peuvent avoir une signification clinique comme un facteur prédictif de la progression de la GC. En conséquence de cette perte d'expression de RPRM dans la progression de la CG, les essais fonctionnels (formation de colonies et indépendante de l'ancrage de croissance) ont également proposé un rôle de suppresseur de tumeur putatif pour RPRM en GC.

Bien que p53 a d'abord été décrit comme un RPRM inducteur [10], les études cliniques réalisées jusqu'à ce jour ont pas été en mesure de confirmer cette constatation [6,18]. Ici, nous avons constaté que la perte d'expression de RPRM est en corrélation avec la perte d'expression d'un autre membre de la famille de p53, p73. Bien que p73 STG est exprimé à un niveau très bas dans les tissus humains normaux [21], est surexprimé dans de nombreux cancers humains différents, tels que ceux du sein, du neuroblastome, du poumon, de l'oesophage, de l'estomac, du côlon, de la vessie et de l'ovaire [14,22]. En outre, il a été rapporté que p73 peut activer la transcription des gènes p53-sensibles, y compris p21WAF1 /Cip1, Bax, MDM2, cycline G, GADD45 et IGFBP3 [20]. Ainsi, sur la base de nos conclusions, nous proposons que l'expression RPRM pourrait être régulée par p73 d'une manière indépendante de p53.

En résumé, nos données suggèrent que le silençage épigénétique du gène RPRM par la méthylation du promoteur est associée à une perte de l'expression RPRM et, par conséquent, des essais fonctionnels ont proposé un rôle de suppresseur de tumeur putatif de RPRM en GC. Dans les échantillons cliniques, RPRM est perdu à des stades invasifs de GC et son expression est corrélée avec celle de p73 suggérant que d'autres membres de la famille du gène p53 peuvent participer à la régulation de l'expression RPRM. Des recherches supplémentaires sont justifiées pour caractériser le rôle de RPRM dans la progression de GC et de valider la régulation biologique de RPRM par p73.

Informations complémentaires
S1 données. . Les données sous-jacentes de l'étude
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Fig. Effets de Tunicamicyn sur protéine RPRM.
RPRM est une protéine cytoplasmique hautement glycosylée visualisés à 25 kD par Western blot, la tunicamycine inhibiteur de glycosylation (TK) déplace la RPRM bande de 25 kD à 15 kD dans les cellules AGS avec RPRM surexpression (pCMV6 /RPRM) (RPRM prédit la taille 12 kD). Les cellules ont été incubées pendant 24 h dans du RPMI 1640 avec 10% de FBS en présence ou en absence de l'inhibiteur de N-glycosylation tunicamicyn (10 ng /ml). l'expression RPRM a été déterminée par transfert Western en utilisant un anticorps polyclonal RPRM (panneau supérieur, une dilution 1: 1000, Sigma-Aldrich). L'expression de la β-actine (panneau inférieur, dilution 1: 2000, Santa Cruz) représente la protéine de chargement
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s002
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S2 Fig. les cellules post-transfection 24 h de localisation de l'expression RPRM dans surexprimant AGS lignée cellulaire immunofluorescence de RPRM dans le cancer lignée de cellules AGS gastrique transfectées avec pCMV6 vecteur codant RPRM. ont été fixés dans le paraformaldehyde 4% et incubées avec anti-RPRM-lapin (1 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) et de l'anticorps secondaire Alexa Fluor 488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Une expression positive de RPRM (VERT) est essentiellement visible dans le cytoplasme. Les images ont été capturées à l'aide du logiciel multicanal Axio Vision4 au microscope à fluorescence Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s003
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S3 Fig. RPRM expression est réduite au silence par méthylation du promoteur.
A) RT-PCR analyse de l'expression de l'ARNm dans RPRM lignée cellulaire de cancer gastrique AGS avec ou sans l'inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-azacytidine (1 pM pendant 72 h). GAPDH a été utilisé comme témoin. B) Amplification de RPRM par méthylation PCR spécifique dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS. L'amplification de MYOD1 méthylé a été utilisé comme témoin. lignée de cellules AGS a été méthylé dans la région du promoteur. NC: contrôle négatif
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s004
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S4 Fig. l'expression RPRM est réduite au silence par méthylation du promoteur (gel d'origine).
A) RT-PCR analyse de l'expression RPRM ARNm dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS avec ou sans l'inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-azacytidine (1 pM pendant 72 h). GAPDH a été utilisé comme témoin. B) Amplification de RPRM par méthylation PCR spécifique dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS. L'amplification de MYOD1 méthylé a été utilisé comme témoin. lignée de cellules AGS a été méthylé dans la région du promoteur. NC:. Contrôle négatif
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
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Remerciements

Nous tenons à remercier Sabina Magedson pour sa contribution dans la construction Microarrays de tissus. Nous tenons également à remercier Hiroshi Kawachi pour examen histologique des cas, Ignacio Wichmann pour leurs précieux commentaires sur notre manuscrit et Oslando Padilla pour son soutien important dans l'analyse statistique.

• PLOS ONE: Affinity Maturation de l'anticorps monoclonal 1E11 par randomisation ciblée dans les régions CDR3 Optimise anticorps thérapeutique ciblant HER2-positif cancer gastrique
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