PLoS ONE: Predisposizione genetica sul CagA-Interacting molecole e gene-ambiente interazione con fitoestrogeni: un fattore di rischio per putativo gastrico Cancer

Estratto

Obiettivi

Per valutare se i geni che codificano CagA- interagiscono molecole ( SRC
, PTPN11
, CRK
, Crkl
, CSK
, c-MET
e GRB2
) sono associati al rischio di cancro gastrico e se una interazione tra questi geni e fitoestrogeni modificare il rischio di cancro gastrico.

Metodi

Nella fase di scoperta, 137 SNPs candidati in sette geni sono stati analizzati in 76 incidenti gastrica casi di cancro e 322 controlli appaiati dalla Corea Multi-center Cancer coorte. Cinque SNP significativi in ​​tre geni ( SRC
, c-MET
e CRK
) sono stati rivalutati in 386 casi e 348 controlli nella fase di estensione. Odds ratio (OR) per il rischio di cancro gastrico sono stati stimati aggiustati per età, fumo, H. pylori
sieropositività e CagA ceppo positività. OR riassunti nella popolazione totale dello studio (462 casi e 670 controlli) sono stati presentati utilizzando pooled- e meta-analisi. Le concentrazioni plasmatiche di fitoestrogeni (genisteina, daidzeina, equol e enterolattone) sono stati misurati utilizzando il fluoroimmunoassay risolta nel tempo.

Risultati

SRC
rs6122566, rs6124914, c -MET
rs41739, e CRK
rs7208768 ha mostrato effetti genetici significativi per cancro gastrico sia nel pool e meta-analisi senza eterogeneità (pooled OR = 3,96 [IC 95% 2,05-7,65], 1,24 [95 % CI = 1,01-1,53], 1.19 [95% CI = 1,01-1,41], e 1,37 [95% CI = 1,15-1,62], rispettivamente; meta OR = 4,59 [IC 95% 2,74-7,70], 1,36 [95% CI = 1,09-1,70], 1,20 [95% CI = 1,00-1,44], e 1,32 [95% CI = 1,10-1,57], rispettivamente). Rischio allele di CRK
rs7208768 ha avuto un aumento significativo del rischio di cancro gastrico a bassi livelli di fitoestrogeni ( interazione p
< 0,05).

Conclusioni

I nostri risultati suggeriscono che SRC
, c-MET
e CRK
svolgere un ruolo chiave nella carcinogenesi gastrica modulando trasduzione del segnale CagA e l'interazione tra CRK
gene e fitoestrogeni modificare il rischio di cancro gastrico

Visto:. Yang JJ, Cho LY, Ko KP, Shin A, Ma SH, Choi BY, et al. (2012) Predisposizione genetica su CagA-Interacting molecole e gene-ambiente interazione con fitoestrogeni: un fattore di rischio per il cancro gastrico putativo. PLoS ONE 7 (2): e31020. doi: 10.1371 /journal.pone.0031020

Editor: Deodutta Roy, Florida International University, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 30 novembre 2011; Accettato: 29 dicembre 2011; Pubblicato: 24 feb 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo studio è stata sostenuta da una sovvenzione della nazionali di R & il programma di Laboratorio di ricerca di base (BRL) attraverso il National Research Foundation della Corea D programma per il cancro di controllo, Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (0.520.140), e finanziato dal Ministero della Educazione, Scienza e Tecnologia (2011-0.001.564). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Helicobacter pylori
( H. pylori
), un gruppo che ho agente cancerogeno umano gastrica dall'Agenzia Internazionale per la ricerca sul Cancro (IARC) [1], è il più forte fattore di rischio per lo sviluppo del cancro gastrico, e persistente H. pylori
infezione è il primo passo verso la carcinogenesi gastrica [1] - [3]. Nonostante le numerose prove che H. pylori
gioca un ruolo cruciale nella carcinogenesi gastrica, solo una piccola parte di persone infette sviluppano il cancro gastrico. Ciò implica che altri fattori coinvolti nel meccanismo patogenetico di H. pylori
possibile modificare la suscettibilità individuale per il cancro gastrico. I nostri studi precedenti hanno dimostrato H. pylori
stessa infezione non è stato associato con il rischio di cancro gastrico, ma specificamente CagA positivo H. pylori
infezione rischio aumentava in modo significativo per il cancro gastrico da 3.57-piega [4], [5].

Cytotoxin associata gene A (CagA), una proteina secreta dalle immunodominante H. pylori
, sembra essere uno dei fattori di modificazione patogeni [6] - [8]. Dopo aver infettato H. pylori
nelle cellule epiteliali gastriche, CagA agisce come un importante componente cancerogeno e virulenti CagA attraverso sequenziale via di trasduzione del segnale. Il primo passo inizia con l'interazione tra CagA e diverse proteine ​​come SRC, SHP2, CRK, Crkl, e CSK dopo fosforilazione e c-MET e GRB2 senza fosforilazione [9] - [12]. Tirosina CagA fosforilata dalla famiglia delle SRC chinasi interagisce con SHP2 tirosina fosfatasi (codificata dal PTPN11
oncogene), CRK, Crkl e CSK e induce la dispersione delle cellule, la dissociazione e la mortalità collegata allo sviluppo del cancro [8], [12] - [15]. Inoltre, CagA non fosforilata interagisce con c-MET e GRB2 che promuove la risposta oncogenico tra cui la proliferazione cellulare e cambiamenti morfologici quali la formazione colibrì [8], [16] - [19]. Questa traslocazione CagA e la sua interazione cellulare con queste proteine ​​possono essere un passo cruciale l'avvio nella carcinogenesi gastrica [9] - [12].

alterazione cellulare nel CagA positivo H. pylori
meccanismo patogenetico sembra spiegare diversa suscettibilità di cancro gastrico tra H. Pylori
persone infette. Poiché le funzioni cellulari possono essere regolate da loro geni ospitanti, varianti genetiche legate alle molecole che interagiscono CagA possono essere la chiave per i singoli suscettibilità cancro gastrico. Sulla base delle differenze genetiche putativi, abbiamo ipotizzato che i geni che codificano proteine ​​CagA-interagenti possono modificare rischio di cancro gastrico. Inoltre, ci siamo concentrati sulla fitoestrogeni come un modificatore di effetto nel processo di trasduzione del segnale CagA. Studi hanno riportato che fitoestrogeni con proprietà anti-infiammatori, anti-batteriche e anti-ossidanti possono inibire H. pylori
attività e cancro gastrico crescita e proliferazione cellulare [20] - [22]. In particolare, la genisteina, uno dei fitoestrogeni e inibitori della chinasi fosfotirosina, è segnalato per essere un bloccante efficace per CagA fosforilazione [23].

Per valutare le ipotesi, a due stadi analisi genetica che si è concentrato sui geni che codificano direttamente molecole CagA-binding, SRC
, PTPN11
, CRK
, Crkl
, CSK
, c- MET
e GRB2
, è stata condotta che: 1) la fase di scoperta che proiettato e identificato polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), con una significativa associazione genetica sul cancro gastrico; 2) la fase di estensione che ri-analizzato le SNPs più significativi in ​​fase di discovery. Inoltre, in un sub-analisi, abbiamo valutato l'interazione gene-ambiente per determinare se i livelli di fitoestrogeni modificano l'associazione tra polimorfismi del gene che codifica direttamente molecole CagA-binding e il rischio di cancro gastrico.

Metodi

Etica Dichiarazione

I protocolli di studio sono stati approvati dal Consiglio di Seoul National University Hospital (H-0110-084-002 per lo studio KMCC e C-0910-049-297 Institutional Review per il caso nidificato corrente studio -Controllo) e dalla Institutional Review Board di Hanyang University Hospital (2003-4). Inoltre, tutti i partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato prima di entrare gli studi.

Studio popolazione

bifase studio di associazione genetica è stata condotta. La popolazione dello studio caso-controllo nested è stato reclutato dal coreano Multi-Center Cancer coorte (KMCC). Informazioni dettagliate sul KMCC è descritto altrove [24]. In breve, i partecipanti sono stati reclutati da quattro aree urbane e rurali (Haman, Chungju, Uljin, e Youngil) in Corea. Informazioni sulle caratteristiche individuali tra cui lo stile di vita generale e l'esposizione ambientale sono stati raccolti con questionari di intervista basata su standard. I campioni di sangue e urina sono stati posto anche raccolti. Tutti i partecipanti sono stati seguiti passivamente-up attraverso legami di record computerizzati per il registro nazionale tumori, il certificato di morte nazionale, e l'assicurazione sanitaria cartelle cliniche. I metodi di follow-up passivi della KMCC sono stati segnalati per essere altamente efficiente e completo [25].

Nel dicembre del 2002, un totale di 136 casi di cancro gastrico definito in base alla classificazione statistica internazionale delle malattie e dei Problemi di salute 10a revisione (ICD-10, C16) sono stati identificati in fase istruttoria. Tra di loro, 84 casi esclusi i casi diagnosticati prima assunzione (n = 36) e senza campioni di sangue (n = 16) sono stati inizialmente selezionati per la genotipizzazione. Quattro controlli privi di tumore (n = 336) sono stati abbinati ad ogni caso cancro gastrico mediante campionamento densità di incidenza in base all'età (± 5 anni), il sesso, quartiere residenziale, e anno di immatricolazione. Otto casi e 14 controlli sono stati esclusi a causa di scarso rendimento genotipizzazione, e, quindi, 76 casi e 322 controlli sono stati inclusi nella fase di scoperta.

Nella fase di estensione, sono stati selezionati 388 cancro gastrico set caso-controllo come segue : 1) 334 casi di cancro gastrico tra cui 136 casi individuati, il 31 dicembre 2002 sono state accertate dal KMCC nel 31 dicembre 2008. Escludendo i casi analizzati in fase istruttoria (N = 84) e senza campioni di sangue (N = 51), 199 casi di cancro gastrico sono stati abbinati 01:01 a controlli per età (± 5 anni), sesso e anno di immatricolazione. 2) 189 casi di cancro gastrico di nuova diagnosi presso Chungnam University Hospital e Università Hanyang GURI Hospital con il consenso informato sono stati reclutati da marzo 2002 a settembre 2006. I campioni di sangue sono stati raccolti al momento della diagnosi o prima della chirurgia del cancro gastrico. Inoltre, 189 controlli basati sulla comunità abbinati per età (± 5 anni), il sesso e anno di immatricolazione (dal 2001 al 2005) sono stati selezionati in modo casuale dalla KMCC. Dei 388 cancro gastrico partite caso-controllo, due casi e 40 controlli sono stati eliminati a causa della scarsa genotipizzazione e il campione insufficiente e, infine, 386 casi e 348 controlli sono stati analizzati nella fase di estensione.

geni candidati e la selezione SNP

In via di trasduzione del segnale CagA, CagA si lega direttamente a sette proteine ​​che portano a processi sequenziali. i geni che codificano per host i sette proteine ​​sono stati selezionati come segue: v-Crk virus del sarcoma CT10 oncogene omologo ( CRK
); v-Crk sarcoma virus CT10 oncogene omologo (aviaria) -come ( Crkl
); c-Src tirosin chinasi ( CSK
); fattore di crescita recettore-bound proteina 2 ( GRB2
); Met proto-oncogene ( c-MET
); fattore nucleare delle cellule T attivate, proteina tirosina fosfatasi, non recettore di tipo 11 ( PTPN11
) codifica SHP2 tirosina fosfatasi e v-Src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene omologo ( .
SRC)

SNPs candidati sono stati selezionati in base a tre criteri: SNP segnalato per avere 1) una possibile rilevanza funzionale per il cancro in studi precedenti; 2) la frequenza minore allele (MAF) > 0,05 nel popolazione asiatica in banche dati pubbliche come SNP500Cancer o il progetto HapMap internazionale, utilizzando gli ID dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp); e contemporaneamente 3) MAF > 0,05 in giapponese (JET) nel progetto HapMap internazionale. Infine, 137 SNP con un punteggio di progettazione = 1.1 e R ^{2 > 0,8 sono stati genotipizzati per schermare gli SNP significativi per il rischio di cancro gastrico. 108 SNP si trovano nella regione introne; 24 SNPs si trovano nella regione del promotore (fiancheggiante regione o UTR); cinque SNP si trovano nella regione codificante.}

La genotipizzazione

Nella fase di scoperta, 137 SNPs in sette geni candidati che codificano per proteine ​​che interagiscono CagA sono stati genotipizzati. Dopo la misurazione delle concentrazioni di DNA genomico per tutti i soggetti dello studio da uno spettrofotometro (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies), la genotipizzazione è stata effettuata utilizzando test GoldenGate ™ (Illumina®, San Diego, CA, USA). Per garantire il controllo della qualità e valutare il tasso di concordanza intra-soggetto, 52 campioni duplicati sono stati distribuiti a caso nella piastra genotipizzazione. tassi di concordanza per tutti i dosaggi erano superiore al 99%. Dei 137 SNP, 21 SNPs sono cadute a causa di fallimento di genotipizzazione (4 SNPs), tasso di chiamata SNP < il 90% (7 SNPs), HWE < 0,0001 (1 SNP) e MAF ≤0.05 (9 SNPs). Otto casi e 14 controlli sono stati esclusi anche a causa di tasso <chiamata genotipizzazione; il 90%. Infine, 116 SNPs in sette geni (tasso di genotipizzazione del 99,6%) in 76 casi e 322 controlli sono stati analizzati

Nella fase di estensione, cinque SNP con una cruda p-
valore <.; 0.02, SNPs tag o punteggi di progettazione superiori (rs6122566 e rs6124914 in SRC
; rs41739 e rs41737 in c-MET
; rs7208768 in CRK
) individuati nell'analisi scoperta sono stati genotipizzati utilizzando il Illumina GoldenGate VeraCode Assay con BeadXpress secondo il protocollo del produttore (Illumina®, USA) [26]. Per garantire l'affidabilità dei metodi di genotipizzazione nelle due fasi, 188 campioni sono stati genotipizzati due volte da ogni metodo. Il tasso di concordanza era > 98,4%. Sono stati esclusi 90% (n = 27), due casi e 40 controlli con il DNA insufficiente (n = 15) o il tasso di chiamata di genotipizzazione <. Infine, cinque SNPs in tre geni (tasso di genotipizzazione del 99,6%) sono stati analizzati in 386 casi e 348 controlli.

H. pylori
infezione e CagA sieropositività

H. pylori
infezione e CagA sieropositività sono stati valutati mediante saggio immunoblot, Helico Blot 2.1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Blot 2.1 ™ kit sono stati segnalati per avere alta sensibilità e specificità (per la sensibilità, il 99% in modo identico in entrambi; per la specificità, 98% e 90%, rispettivamente). [27]

Le misurazioni di biomarcatori fitoestrogeni

plasma concentrazioni di quattro biomarcatori fitoestrogeni che erano 1) isoflavoni: genisteina, daidzeina, e equol (daidzeina metabolita) e 2) Lignan: enterolactone sono stati misurati utilizzando kit fluoroimmunoassay risolte nel tempo (LabMaster, Finlandia). Dopo biomarcatori fitoestrogeni liberi sono stati estratti da 200 ml di campione di plasma, il victor3 ™ 1420 Multilabel contatore misurato fluorescenza risolta nel tempo (Perkin-Elmer). metodi di misurazione dettagliate per biomarcatori fitoestrogeni sono descritte altrove [28]. Della popolazione totale dello studio, le concentrazioni plasmatiche di quattro biomarcatori sono stati misurati in 406 casi e 417 controlli con sufficiente volume plasmatico (> 200 mL).

L'analisi statistica

Per confrontare le caratteristiche di base tra i casi di cancro gastrico e controlli, il test chi-quadrato e Student T-
test sono stati condotti. P
-Valori per la differenza in proporzione per sesso, età, H. pylori
infezione, CagA e VacA sieropositività, il fumo di sigaretta, consumo di alcool, e la storia gastrite tra casi e controlli sono stati determinati.

Hardy-Weinberg (HWE) nel gruppo di controllo è stata valutata utilizzando il chi- square test o il test esatto di Fisher con un livello di cut-off di HWE < 0,0001. Nella fase di scoperta, minimo globale p
-Valori ( p
< 0,05) nel test di rapporto di verosimiglianza (LRT) con 1 grado di libertà (df) nel modello di additivi e LRT con 2 df nel modello genotipica sono stati calcolati per selezionare SNP significativi. Utilizzando tre modelli genetici, additivi, modelli recessive e dominanti, l'associazione tra le SNP selezionati e rischio di cancro gastrico è stato analizzato. Permutati p
-Valori sono stati stimati da 100.000 test di permutazione della singola analisi SNP. Per evitare di associazioni spurie con risultati falsi positivi, la permutati corretto p
-Valori sulla condizione dei più SNP e il tasso di scoperta falso (FDR) utilizzando un metodo Benjamini-Hochberg sono stati calcolati [29]. il rischio di cancro gastrico è stato stimato come odds ratio (OR) e gli intervalli di confidenza al 95% (IC) utilizzando incondizionato modello di regressione logistica aggiustamento per i fattori di rischio che sono stati l'età, abitudine al fumo (sempre vs.
mai), H. pylori
infezione (positivo vs.
negativo) e CagA sieropositività (positivo vs.
negativo). Inoltre, l'analisi aplotipo è stata effettuata per i geni che contengono SNP significativamente associato da un individuo analisi SNP utilizzando il software Haploview 4.1 (www.broad.mit.edu/mpg/haploview/).

Nella fase di estensione, il più significativo SNPs identificati nella fase di scoperta sono stati rivalutati. Sulla base del additiva o modelli recessivi, il rischio di cancro gastrico è stato stimato come RUP e IC al 95% utilizzando incondizionato modello di regressione logistica aggiustamento per covariate gli stessi di cui sopra. Per riassumere i risultati della scoperta e le fasi di estensione, pooled- e meta-analisi sono state condotte. Utilizzando il modello effetti fissi, riassunti OR e IC al 95% sono stati calcolati. Inoltre, l'eterogeneità tra gli studi è stata valutata dalle statistiche Cochran Q [30].

Utilizzando l'analisi della varianza e covarianza (ANCOVA) con l'età, abitudine al fumo (sempre vs.
Mai), H. pylori
infezione (positivo vs.
negativo) e CagA sieropositività (positivo vs.
negativo) come potenziali fattori di rischio per il cancro gastrico, le medie dei livelli di fitoestrogeni biomarker tra casi e controlli sono stati confrontati. analisi stratificata per livelli alti e bassi di biomarcatori fitoestrogeni (genistein, daidzeina, equol e enterolattone), dove i livelli di cut-off sono stati determinati mediante l'analisi Spline è stata condotta utilizzando modelli di regressione logistica incondizionati. effetti di interazione tra gli SNP più significativi e biomarcatori fitoestrogeni sono stati calcolati come RUP e il 95% IC aggiustati per età, abitudine al fumo (sempre vs.
mai), H. pylori
infezione (positivo vs.
negativo) e CagA sieropositività (positivo vs.
negativo).

Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SAS versione 9.2 ( SAS Institute, Cary, North Carolina), e PLINK software versione 1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [31]. Le meta-analisi sono state condotte utilizzando STATA versione 10 (Stata, College Station, TX).

Risultati

Non c'era alcuna differenza significativa tra casi e controlli a seconda del sesso, H. pylori
infezione, CagA /VacA sieropositività, il fumo /stato di bere e la storia ulcera gastrica nelle fasi di scoperta e di estensione (p > 0,05). CagA /VacA sieropositività e la percentuale di fumatori correnti erano significativamente più alti tra i casi di cancro gastrico nei dati aggregati ( p
= 0,03, p
< 0,01, p
= 0.02, rispettivamente) (Tabella S1).

dei 116 SNPs in sette geni candidati che codificano per le proteine ​​che interagiscono CagA analizzate in fase di scoperta, 22 SNPs in tre geni, SRC
, c-MET
, e CRK
, erano significativamente associati a cancro gastrico ( p
-LRT < 0,05). SRC
rs6122566 significativo aumento del rischio di cancro gastrico nei modelli recessivi (OR = 4,90 [IC 95% 1,19-14,2]). Tredici SNPs che erano rs41739, rs16945, rs41738, rs6566, rs10435378, rs41737, rs2023748, rs41736, rs41735, rs6951311, rs183642, rs2237717 e rs38859 in c-MET
gene hanno mostrato un significativo effetto gene-dose alla lineari i test di tendenza ( p
< 0,05). CRK
rs7208768 hanno avuto un effetto marginale significativo gene-dose. 100.000 test di permutazione della singola analisi SNP hanno mostrato SRC
rs6122566, c-MET
rs41739 e CRK
rs7208768 con i più significativi permutati p
- valore in ogni gene ( p
_{permutazione = 0,00,284 mila, p
permutazione = 0,00,989 mila, p
permutazione = 0,01,392 mila, rispettivamente). L'importanza marginale della corretta permutati p
-value è stato osservato per SRC
rs6122566 ( p = 0,0918
) ma tutti FDR p
-Valori in tutti i modelli genetici non sono state significative ( p
> 0,2). (Tabella S2)}

blocchi Haplotype sono stati identificati dalla trama LD (Figura S1). Il blocco più grande è stato costruito con le SNPs più significativi tra cui rs41739, rs6566, e rs41738, ma l'omnibus p
-value non è risultata significativa ( p
> 0,05). Quattro blocchi definiti da SRC
e un blocco definito da CRK
non hanno mostrato significatività statistica nel test omnibus. I risultati delle analisi aplotipo non ha presentato informazioni al di là di singoli risultati SNP (dati non riportati).

Nella fase di estensione, due SNP, rs6122566 e rs6124914, in SRC
gene e rs7208768 in CRK
è rimasto significativamente associato ad un aumentato rischio di cancro gastrico (OR = 4.01, [95% CI: 1,62-9,96]; OR = 1.30, [95% CI: 1,00-1,70]; OR = 1.33, [95% CI: 1,08-1,64], rispettivamente). Le associazioni tra le SNPs in c-MET
gene (rs41739 e rs41737) e il rischio di cancro gastrico sono stati attenuati. Nell'analisi combinata che ha incluso le fasi di scoperta e di estensione, la stima del rischio di SRC
rs6122566 nel modello recessivo era significativamente associato con il cancro gastrico sia nel pool e meta-analisi (OR = 3.96, [95% CI: 2,05-7,65]; OR = 4.59, [95% CI: 2,74-7,70], rispettivamente). Inoltre, SRC
rs6124914, c-MET
rs41739 e CRK
rs7208768 hanno mostrato effetti significativi gene-dosi per cancro gastrico in entrambe le analisi. Non c'era eterogeneità tra le analisi (test di Cochran Q, p
> 0,05). (Tabella S3)

Tra un totale di 823 soggetti (406 casi e 417 controlli) che sono stati misurati i livelli plasmatici dei quattro biomarcatori fitoestrogeni, le concentrazioni globali di genisteina, daidzeina e enterolattone nei casi erano significativamente più bassi di quelli dei controlli (genisteina

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