PLoS ONE: ipossia-inducibile fattore 1α Determina cancro gastrico chemiosensibilità attraverso la modulazione di p53 e NF-kB

chemiosensibilità

Estratto

Sfondo

Riduzione delle cellule tumorali solide rappresenta un ostacolo fondamentale in oncologia clinica. Quindi, la caratterizzazione molecolare dei percorsi che regolano chemiosensibilità è un prerequisito fondamentale per migliorare la terapia del cancro. Il fattore HIF-1α ipossia-inducibile è stata collegata a chemiosensibilità mentre i meccanismi molecolari alla base rimangono in gran parte sfuggente. Pertanto, abbiamo ampiamente analizzato il ruolo di HIF-1α nel determinare chemiosensibilità concentrandosi sulle vie molecolari responsabili.

Metodologia e risultati principali

RNA interferenza è stata applicata per inattivare HIF-1α o p53 nel cancro gastrico umano linee di cellule AGS e MKN28. Gli agenti chemioterapici 5-fluorouracile e cisplatino sono stati utilizzati e chemiosensibilità è stata valutata mediante saggi di proliferazione cellulare e la determinazione della distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi. L'espressione di proteine ​​p53 e p53 bersaglio è stata analizzata mediante Western Blot. l'attività di NF-kB è stato caratterizzato per mezzo della determinazione spostamento mobilità elettroforetica. L'inattivazione di HIF-1α in cellule di cancro gastrico ha provocato robusta elevazione della chemiosensibilità. Di conseguenza, le cellule HIF-1α-competenti mostrato una riduzione significativa della senescenza indotta da chemioterapia e apoptosi. Sorprendentemente, questo fenotipo era completamente assente in p53
cellule mutanti mentre l'inattivazione di p53 di per sé
non ha influenzato chemiosensibilità. HIF-1α notevolmente soppressa l'attivazione indotta da chemioterapia di p53 e p21 e la proteina retinoblastoma, eventualmente con conseguente arresto del ciclo cellulare. formazione ridotta di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule HIF-1α-competenti è stato identificato come il meccanismo molecolare di inibizione di HIF-1α-mediata di p53. Inoltre, la perdita di HIF-1α abrogata, in maniera p53-dipendente, indotta da chemioterapia DNA-binding di NF-kB e l'espressione di anti-apoptotici geni target di NF-kB. Di conseguenza, la ricostituzione della subunità p65 NF-kB ha invertito la maggiore chemiosensibilità delle cellule HIF-1α-carenti.

Conclusione e significato

In sintesi, abbiamo identificato HIF-1α come un potente regolatore di attività di p53 e NF-kB in condizioni di stress genotossico. Concludiamo che p53
mutazioni in tumori umani tenere il potenziale per confondere l'efficacia di HIF-1-inibitori nella terapia del cancro

Visto:. Rohwer N, C Dame, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) ipossia-inducibile fattore 1α Determina cancro gastrico chemiosensibilità attraverso la modulazione di p53 e NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038

Editor: Deb Fox, L'Istituto di ricerca per i bambini all'ospedale dei bambini di New Orleans, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 28 Aprile 2010; Accettato: 19 Luglio, 2010; Pubblicato: 10 Agosto 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) per TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 e 133 /2-3), e NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC è stata sostenuta anche da una sovvenzione da parte del Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

intrinseca e acquisito resistenza ai farmaci sono le cause primarie di limitata efficacia della chemioterapia nella maggior parte dei tumori maligni gastrointestinali, tra cui il cancro gastrico [1], [2]. La resistenza ai farmaci rappresenta un fenomeno complesso e multifattoriale relative al microambiente tumorale, ad esempio ipossia, acidosi e infiammazione così come la stessa cellula neoplastica [3]. resistenza cellulare può essere inerente allo specifico background genetico della cellula tumorale o il risultato di mutazioni e alterazioni epigenetiche dopo la terapia antiproliferativo [4], [5].

Il fattore di trascrizione fattore ipossia-inducibile 1 (HIF-1 ) costituisce un regolatore chiave di adattamento cellulare all'ipossia ed è stato coinvolto nella resistenza ai farmaci [6] - [8]. La proteina HIF-1 è un eterodimero composto di un β-subunità costitutivamente espresso (ARNT (arilico recettore translocator nucleare)) e una α-subunità ipossia-inducibile [9]. In condizioni normossiche, l'attività di HIF-1α può essere indotta da vari fattori di crescita, citochine, oncogeni attivati ​​o perdita-di-funzione mutazione geni oncosoppressori [10]. HIF-1α è centralmente coinvolto in molteplici aspetti della tumorigenesi, tra cui la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi, metastasi, così come la risposta alla chemioterapia e la radioterapia [11]. HIF-1α è sovraespresso in un vasto numero di tumori solidi, e l'espressione tumorale HIF-1α è spesso associata a prognosi infausta [12] - [15]. Inoltre, l'inibizione di HIF-1α mediante RNA interference o composti farmacologici ha dimostrato l'efficacia antitumorale in vari modelli murini di cancro [16]. Un contributo di HIF-1α per chemoresistance di cellule neoplastiche è stata osservata in un ampio spettro di tumori solidi, tra cui il cancro gastrico [6] - [8], [17] - [20]. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base, nonché il ruolo di HIF-1α per la resistenza ai farmaci in condizioni normossiche rimangono in gran parte sfuggente [8], [18], [21]. Qui, noi identifichiamo la soppressione di p53 e la promozione di attività di fattore nucleare kB (NF-kB) come meccanismi centrali per di HIF-1α sensibilità che ne determinano ruolo contro il 5-fluorouracile (5-FU) e cisplatino in cellule di cancro gastrico umano.

Risultati

HIF-1α determina sensibilità delle cellule di cancro gastrico verso gli agenti chemioterapici 5-fU e cisplatino

inattivazione funzionale di HIF-1α è stato raggiunto da trasduzione lentivirale di AGS e cellule MKN28 con piccoli RNA interferenti (siRNA) mira specificamente HIF-1α. Questo approccio sperimentale prodotto un atterramento altamente efficiente dimostrato da una quasi totale fallimento di cellule trasdotte per indurre proteina HIF-1α in risposta all'ipossia come pubblicato in precedenza [22]. Per valutare l'importanza di HIF-1α per la sensibilità delle cellule di cancro gastrico umano verso agenti chemioterapici stabiliti, abbiamo confrontato gli effetti di 5-FU e cisplatino in HIF-1α-competenti (strapazzate, "SCR") e HIF-1α-carenti (atterramento, "KD") le cellule AGS. inattivazione funzionale di HIF-1α spostato la dipendenza dose di inibizione della crescita verso concentrazioni di farmaco inferiori (Figura 1A e Figura S1), suggerendo che HIF-1α è in grado di ridurre la chemioterapia suscettibilità delle cellule di cancro gastrico in condizioni normossiche. In linea con le precedenti relazioni [6] - [8], [17], [18], l'esposizione all'ipossia maggiore resistenza al 5-FU in cellule AGS, tuttavia l'inattivazione di HIF-1α portato robusto aumento della chemiosensibilità in condizioni di ipossia ( Figura S2). In un approccio complementare, abbiamo studiato le conseguenze di iperespressione di HIF-1α (pcDNA HIF-1α) per la chemiosensibilità delle cellule AGS. cellule AGS overexpressing HIF-1α erano notevolmente più resistenti al trattamento con 5-FU (Figura 1B). Stabile l'espressione di HIF-1α è stata confermata da HRE (ipossia reattivo elemento) saggio luciferasi giornalista (Figura 1C). Questi risultati suggeriscono fortemente che HIF-1α limita l'azione citotossica 5-FU e cisplatino in cellule di cancro gastrico umano e che l'inattivazione di HIF-1α potrebbe avere effetti benefici sulla chemiosensibilità.

limiti di HIF-1α indotta da chemioterapia arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi attraverso la soppressione di p53

Abbiamo iniziato una caratterizzazione della inibizione della crescita osservata analizzando i modelli di distribuzione del ciclo cellulare dopo la chemioterapia. G _{1-sincronizzato, le cellule AGS siero-fame sono stati rilasciati da G 0 /G 1 fase con l'aggiunta di profili di siero e del ciclo cellulare sono stati determinati dopo l'aggiunta di 5-FU. culture rilasciata di AGS non trattate prontamente progredito attraverso G 1 in S e G 2 /M fasi [22], mentre le cellule 5-FU-trattati sono rimasti in G 1 fase (non mostrato). È interessante notare che il mantenimento di 5-FU-dipendente delle cellule in G 1 fase è stata notevolmente aumentata in AGS KD rispetto alle cellule AGS SCR, in coerenza con G 1 cellule ciclo arresto (Figura 2A). Irreversibile arresto del ciclo cellulare è emerso come un modo importante dell'azione degli agenti antiproliferativi ed è caratterizzato da caratteristiche cellulari di senescenza [7], [23]. Di conseguenza, la frazione di cellule senescenti è stata determinata. Infatti, il trattamento con 5-FU ha portato ad una induzione robusto di senescenza in cellule AGS. Questa risposta è stata significativamente migliorata nelle cellule con perdita concomitante di HIF-1α (Figura 2B). Inoltre, l'induzione di apoptosi è stato suggerito da un aumentato 1 frazione pre G in istogrammi di DNA di cellule AGS KD 5-FU-trattati (non mostrato). Pertanto, l'analisi quantitativa della frazione cellulare per apoptosi è stata ottenuta sulla base della rilevazione di spaccati caspasi-3 (Figura 2C). In accordo con i dati sulla distribuzione del ciclo cellulare, la frazione apoptotica 5-FU-indotta è risultato significativamente aumentato nelle cellule AGS KD HIF-1α-carenti rispetto alle cellule HIF-1α-competente.}

indotta dalla chemioterapia senescenza e apoptosi entrambi sono stati intimamente legata al soppressore del tumore p53
. Così, abbiamo ipotizzato che p53 potrebbe contribuire alla citotossicità aumentata del 5-FU in caso di perdita di HIF-1α. Dopo il trattamento con 5-FU, proteina p53 gradualmente accumulate nelle cellule AGS, un effetto che è stato sorprendentemente migliorato nelle cellule AGS HIF-1α-deficienti (Figura 2D). Questa stabilizzazione di p53 è stata associata ad un aumento dei livelli di p21 inibitore ciclina-dipendente chinasi (CDK), un target trascrizionale ben consolidata e effettori a valle di p53 con le funzioni di arresto del ciclo cellulare, l'induzione senescenza e l'apoptosi (Figura 2D). Anche in questo caso, le cellule AGS HIF-1α-deficienti hanno mostrato un marcato forte aumento della p21 di cellule AGS HIF-1α-abile. Forte l'induzione di p21 si prevede di inibire l'attività di G _{1 ciclina /CDK complessi, con conseguente ipofosforilazione di proteina del retinoblastoma (pRb) e il fallimento di indurre cyclins fase S, ad esempio ciclina A. Infatti, sia pRb ipofosforilazione e ridotti livelli di ciclina A sono stati confermati nelle cellule AGS KD 5-FU-trattati e - in misura minore - anche in AGS cellule SCR (Figura 2D). Questi cambiamenti confermano il mantenimento G 1 fase osservata in istogrammi di DNA e sono coerenti con l'irreversibile G 1 arresto osservato in senescenza indotta da chemioterapia. Così, i diversi risultati biologici di trattamento con 5-FU in cellule AGS HIF-1α-deficienti e -proficient nascono dalla regolazione differenziale di p53 e la sua valle p21 bersaglio.}

L'inattivazione di p53 blunts il ruolo di HIF-1α per chemiosensibilità

per ottenere evidenze sperimentali per il ruolo proposto di p53 nella regolazione di HIF-1α-mediata di chemiosensibilità nelle cellule AGS, abbiamo p53 funzionalmente inattivato da RNA interference usando trasfezione transiente di anti-p53 siRNA (p53 si) o un controllo scrambled siRNA (SI SCR). P53 è stato efficacemente abbattuto, come indicato dal fallimento delle cellule trasfettate per indurre p21 effettori p53 e MDM2 in risposta a 5-FU trattamento (Figura 3A). È interessante notare che le cellule AGS KD trasfettate con p53 si erano significativamente meno suscettibili di inibizione della crescita del 5-FU rispetto alle cellule AGS KD trasfettate con siRNA di controllo (Figura 3B). In linea con questi risultati, G ritenzione ciclo _{1 cellulare e l'apoptosi delle cellule AGS KD 5-FU-trattati sono stati ridotti di p53 atterramento in confronto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo (Figura 3D e 3E). In netto contrasto, chemiosensibilità delle cellule AGS HIF-1α-abile, non è stata influenzata dalla inattivazione di p53 (Figura 3C).}

HIF-1α non riesce ad influenzare chemiosensibilità in p53
cellule mutanti

per confermare la regolazione di HIF-1α-dipendente di 5-FU risposta e per caratterizzare ulteriormente il contributo di p53, abbiamo esaminato una seconda gastrica linea di cellule di cancro umano (MKN28), che porta una mutazione missense nel> TP53 al codone 251. È interessante notare che, la cancellazione di HIF-1α nelle cellule MKN28 non è riuscito a migliorare la inibizione della crescita dopo l'esposizione a 5-FU (Figura 4A). Allo stesso modo, 5-FU-indotta G _{1 accumulo e l'apoptosi delle cellule MKN28 non sono stati colpiti dalla perdita di HIF-1α (Figura 4B e 4C). In linea con questi risultati, i livelli di proteina di p53 e pRb sono rimasti invariati nelle cellule MKN28 5-FU-trattate per tutto il periodo di 24 ore, e l'induzione p21 era assente (Figura 4D). Tuttavia, quando la funzione di p53 è stata restaurata dal pretrattamento con il composto chimico PRIMA-1 [24] HIF-1α atterramento tradotto in un notevolmente migliorato 5-FU citotossicità (figura S3). Coerente con il ruolo stabilito di p53 in chemioterapia citotossica indotta /effetti citostatici, il trattamento con PRIMA-1 di per sé
leggermente ridotto la proliferazione delle cellule MKN28 e notevolmente migliorato l'efficacia di 5-FU in MKN28 cellule (Figura S3).}

NF-kB è un importante mediatore del ruolo di HIF-1α in chemiosensibilità

l'attivazione di NF-kB è associata con una protezione da apoptosi indotta da chemioterapia e, viceversa, l'inibizione della NF -κB può migliorare l'efficacia di agenti anti-neoplastici sia in vivo
e in vitro
[25] - [27]. Pertanto, abbiamo determinato l'attività di NF-kB legame al DNA nelle cellule AGS HIF-1α-deficienti e -proficient dopo il trattamento con 5-FU mediante test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA). Il trattamento con 5-FU potentemente attiva NF-kB legame al DNA nelle cellule AGS SCR, con livelli di picco che si verificano 6 ore dopo l'esposizione a 5-FU (Figura 5A). Il trattamento con TNFa per 4 h servito come controllo positivo per l'attivazione di NF-kB. Inoltre, un supershift è stata indotta mediante un anticorpo anti-p65, confermando che il 5-FU indotte complessi NF-kB contenevano la subunità 65-kDa (p65). Perdita di HIF-1α attivazione inibito significativamente di NF-kB in risposta a 5-FU e TNF (Figura 5A). Coerentemente con questa osservazione, 5-FU trattamento anche non è riuscito a indurre i geni target di NF-kB cIAP1 e A20 nelle cellule AGS KD, mentre erano stati prontamente indotte nelle cellule AGS SCR (Figura 5B)
.

Per affrontare la significato funzionale di NF-kB per l'inibizione della crescita di 5-FU-indotta, abbiamo sovraespresso p65 (p65 pcDNA) nelle cellule AGS KD. Transfection di pcDNA p65, ma non il vettore di controllo vuoto, portato ad una significativa induzione di proteine ​​p65 e l'attività trascrizionale NF-kB in cellule AGS KD (figura S4). Da segnalare, le cellule AGS KD HIF-1α-carenti sovraesprimono p65 erano considerevoli più resistenti al trattamento con 5-FU rispetto alle cellule AGS KD trasfettate con il vettore di controllo (Figura 5C), coerente con un ruolo essenziale di NF-kB nel mediare chemioresistenza nei confronti 5-FU in cellule di cancro gastrico. Nel loro insieme, l'attivazione simultanea di p53 e l'inibizione di NF-kB in 5-FU-trattati, è stata osservata cellule AGS HIF-1α-carenti. Per chiarire, se entrambi gli eventi sono interdipendenti, abbiamo studiato 5-FU-indotta attivazione di NF-kB in MKN28 cellule con mutante p53.
Entrambe 5-FU e TNF attivato NF-kB legame al DNA in un tempo- dipendente manner, indicando meccanismi p53-indipendenti di attivazione di NF-kB da 5-FU (Figura 5D). Tuttavia, diverso dal ritrovamento nelle cellule AGS, questa attivazione di NF-kB nel p53
linea cellulare mutante non è stato attenuato dalla inattivazione HIF-1α. Così, HIF-1α può sostenere l'attivazione di NF-kB indotta da chemioterapia contrastando meccanismi inibitori p53-dipendente.

formazione di ROS Altered è responsabile per la modifica HIF-1α-indotta di p53 attività

Per chiarire il meccanismo sottostante molecolare superinduzione p53 in 5-FU trattati cellule HIF-1α-deficienti, abbiamo caratterizzato il ruolo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). ROS costituiscono un collegamento candidato (i) ROS sono potenti attivatori della funzione di p53 e fattori chiave presi in considerazione nella induzione di p53 da diversi agenti chemioterapici [28], e (ii) HIF-1α può sopprimere la generazione di ROS, diminuendo l'attività mitocondriale e biogenesi [22], [29], [30]. Di conseguenza, le cellule AGS KD sono stati pretrattati con la Ros-inibitori diphenyleneiodonium cloruro (DPI) o apocinina. Entrambi gli inibitori conferito una protezione significativa contro inibizione della crescita di 5-FU-indotta nelle cellule AGS KD (Figura 6A e 6B). Inoltre, DPI e apocinina quasi completamente impedito l'induzione di p53 e la sua valle p21 bersaglio in 5-FU-trattati cellule (Figura 6C e 6D). Questi risultati suggeriscono un incrocio di segnalazione HIF-1α con la risposta p53-mediata di 5-FU a livello di produzione di ROS. Per stabilire un ruolo causale di HIF-1α per il potenziale redox delle cellule AGS dopo il trattamento con 5-FU, livelli di ROS intracellulari sono stati determinati in cellule AGS KD e SCR mediante citometria a flusso. Abbiamo scoperto che i livelli di superossido intracellulari nelle cellule AGS KD 5-FU-trattati sono stati 2,5 volte superiori a quelli nelle cellule AGS SCR 5-FU-trattati (Figura S5), indicando che l'inattivazione funzionale di HIF-1α nelle cellule AGS ha provocato elevazione significativa e funzionale di stress ossidativo intracellulare anche sotto trattamento chemioterapico

Discussione

Il fattore di trascrizione HIF-1α è stato stabilito come importante mediatore della chemioresistenza ipossia-mediata [6] - [8]. , [17], [18], [20]. Qui, identifichiamo HIF-1α come un potente determinante di chemiosensibilità nelle cellule di cancro gastrico in condizioni normossiche. Applicando un sistema di siRNA lentivirus-based che buzz visualizzati notevolmente migliorato 5-FU e cisplatino tossicità nelle cellule di cancro gastrico HIF-1α-carenti. I dati disponibili sul ruolo di HIF-1α per la chemiosensibilità delle cellule tumorali in condizioni di normossia sono in conflitto. Mentre le cellule di fibrosarcoma HIF-1α-deficienti (HT1080) visualizzati in modo significativo una maggiore sensibilità verso etoposide in aria ambiente, il cancro del colon (HCT116) e epatoma (Hepa-1), le cellule non sono riusciti a farlo [6]. Unruh et al.
Riferito maggiore suscettibilità di HIF-1α-carente topo fibroblasti embrionali a carboplatino o etoposide sotto normossia nonché condizioni di ipossia [8]. Per quanto riguarda il cancro gastrico, una maggiore efficacia di 5-FU e vincristina è stata dimostrata in normossia in vitro
[18]. Bene in linea con i nostri risultati, entrambi gli studi hanno concluso un ruolo fondamentale per HIF-1α nel mediare chemioresistenza in condizioni normossiche. È interessante notare che un recente studio giapponese ha dimostrato minore efficacia della chemioterapia 5-FU a base di HIF-1α-esprimendo adenocarcinoma gastrico umani, rafforzando la percezione di HIF-1 come un fattore cruciale nella determinazione della chemioresistenza cancro gastrico [31].

controllo di progressione del cancro da chemioterapia si basa almeno in parte sulla induzione della senescenza cellulare. Recentemente, la perdita di HIF-1α ha dimostrato di causare senescenza precoce della immortalato fibroblasti embrionali murini in condizioni normossiche [32]. I nostri dati attuali suggeriscono che HIF-1α custodisce simile cellule di cancro gastrico contro senescenza indotta da chemioterapia in condizioni normossiche. Ciò costituisce il primo rapporto di elevato senescenza indotta da chemioterapia attraverso l'inattivazione funzionale di HIF-1α in una linea di cellule di cancro umano stabilito. Nelle cellule HIF-1α-carenti, abbiamo anche osservato migliorato induzione di apoptosi in risposta a 5-FU. Precedenti studi hanno riportato una riattivazione del fattore proapoptotica [6] Bid, o un cambiamento nella bilancia dei membri della famiglia Bcl-2 pro e antiapoptotiche per tenere conto di un aumento dei tassi di apoptosi seguenti inattivazione di HIF-1α in cellule di cancro gastrico trattati con farmaci [ ,,,0],. 18]

il nostro studio identifica un nuovo meccanismo, per cui HIF-1α contrasta sia indotta da chemioterapia senescenza ed apoptosi: presentiamo la prova conclusiva per la capacità di HIF-1α per sopprimere l'induzione del tumore soppressore p53 in risposta a 5-FU in condizioni normossia. P53 è un cardine destino delle cellule determinante per il suo ruolo nella regolazione della progressione del ciclo cellulare e l'apoptosi in risposta allo stress cellulare e costituisce il gene più frequentemente mutato nei tumori umani [33]. Un'ampia varietà di agenti chemioterapici hanno mostrato per stabilizzare p53 e, viceversa, perdita di p53 costituisce un principio meccanismo di resistenza cancro verso chemioterapia [33], [34]. L'interazione di p53 e di HIF-1α è stato oggetto di dibattiti di lunga data come entrambe le relazioni positive e negative sono state pubblicate [35]. lavoro Tuttavia, l'intero precedentemente pubblicato concentrata sulla p53-HIF-1α-interazioni sotto ipossia (o anche anossico) condizioni. Per quanto a nostra conoscenza, i nostri esperimenti per la prima volta, forniscono la prova per la soppressione di p53 attività da HIF-1α in condizioni normossiche. Come conseguenza di p53 nelle cellule upregulation HIF-1α-deficienti, abbiamo osservato cambiamenti nel effettori a valle che sono collegati al irreversibile arresto del ciclo cellulare caratteristica della senescenza, per esempio stabilizzazione p21 e ipofosforilazione di pRb. Diverso da nostra osservazione, recente lavoro su chemioresistenza verso etoposide in HIF-1α-carente fibroblasti embrionali murine immortalati non ha rispettato una induzione di p21 [36]. Inoltre, HIF-1α stabilizzato p21 e p27, così come ha portato a ipofosforilazione di pRb durante la crescita arresto indotta dall'ipossia di immortalato fibroblasti embrionali murini e linfociti B della milza primaria [37]. Questi risultati contrastanti sono molto probabilmente spiegate dai tipi di cellule indagati: Mentre Goda et al
. caratterizzato una risposta fisiologica all'ipossia in tipi di cellule non trasformate, abbiamo analizzato la risposta a gravi danni al DNA in linee cellulari di cancro stabiliti.

Mentre p53 è stato più volte dimostrato di contrastare la funzione di NF-kB [38], [39 ], i nostri dati attuali indicano un ruolo per il soppressore del tumore nella regolazione dell'attivazione di NF-kB HIF-1α-dipendente. Oltre a p53, NF-kB è emerso come un secondo, determinante centrale della resistenza nei confronti degli agenti chemioterapici [40]. Diversi studi diversi hanno stabilito legami funzionali tra NF-kB e HIF-1α, anche se variabile posto HIF-1α a monte di NF-kB o viceversa. Per esempio, la stabilizzazione indotta dall'ipossia di HIF-1α nelle cellule muscolari lisce è sotto il controllo trascrizionale di NF-kB [41]. Allo stesso modo, i risultati ottenuti da topi knockout IKK-beta condizionali hanno confermato il ruolo centrale di NF-kB nel controllo della base e di espressione indotta dall'ipossia di HIF-1α in vivo
[42]. Al contrario, è stato dimostrato di essere controllato da HIF-1α nel contesto di apoptosi ipossia represso dei neutrofili [43] l'espressione del gene della subunità p65 NF-kB. La nostra scoperta di marcatamente ridotta attività di NF-kB in cellule HIF-1α-carente in seguito al trattamento con 5-FU è quindi perfettamente in linea con quest'ultimo rapporto. È interessante notare, abbiamo anche osservato significativamente ridotto legame della subunità NF-kB in cellule HIF-1α-carenti dopo stimolazione con TNF-alfa, un induttore consolidata di attività di NF-kB [44] DNA. Ciò solleva la questione pertinente in quali condizioni fisiologiche e fisiopatologiche HIF-1α è in grado di regolare l'attivazione di NF-kB. HIF-1α e NF-kB condividono importanza cruciale per vari processi come l'infiammazione, l'uccisione microbica e tumorigenesi. La natura molecolare esatta così come la gerarchia della loro interazione è più probabile cellulo e dipendente dal contesto e non può essere generalizzata.

In questo studio siamo stati in grado di individuare ROS come un punto di intersezione di HIF- 1α con la risposta allo stress cellulare, p53-mediata alla chemioterapia. Intracellulare ROS sono noti come potenti induttori di p53 e di partecipare alla attivazione di p53 da farmaci chemioterapici [45]. I mitocondri rappresentano la prima fonte di ROS intracellulari [46], e HIF-1α probabilmente contrasta la produzione di ROS a livello mitocondriale attraverso molteplici meccanismi tra cui l'inibizione della biogenesi mitocondriale e del piruvato spola nei mitocondri, riduzione dell'attività mitocondriale a causa di una maggiore utilizzazione della glicolisi e l'attivazione dell'autofagia mitocondriale [29], [30], [47], [48]. In precedenza, abbiamo stabilito un collegamento funzionale tra la riduzione HIF-1α-controllato di ROS e ancoraggio indipendenza di cellule di cancro gastrico [22], implicando HIF-1α nella patogenesi del cancro gastrico in assenza di ipossia. Ora scopriamo che il capacitiy di HIF-1α per limitare la produzione di ROS di cellule di cancro gastrico conferisce anche la resistenza agli agenti chemioterapici che funzionano attraverso l'attivazione di p53 (Figura 6E). È interessante notare che sono stati segnalati effetti crescenti sulla resistenza terapia attraverso la modulazione di p53 e ROS per HIF-2α [49]. Le isoforme HIF-alfa 1 e 2 mostrano un'ampia sovrapposizione di obiettivi HIF putativi e vincolante per gli elementi risposta ipossica e l'assegnazione definitiva degli effetti indotta da ipossia a uno isoforma non è sempre attuabile [50]. Bertout et al.
Dimostrato che inibendo HIF-2α aumenta l'apoptosi indotta da radiazioni attraverso l'accumulo di ROS e il successivo aumento di p53 attività [49]. Inoltre, Roberts et al.
Ha mostrato che la resistenza contro la chemioterapia è parzialmente mediata dalla soppressione HIF-2α-mediata di p53 nelle cellule di carcinoma a cellule renali [51]. Quindi, le osservazioni riportate con la presente garantisce indagini sul potenziale ruolo di HIF-2α, un compito che è attualmente in corso nel nostro laboratorio.

In considerazione della necessità clinica di individuare i predittori di risposta per le opzioni di trattamento disponibili, il nostro risultati potrebbero trattamento decisioni potenzialmente diretti: da un lato, la conoscenza di HIF-1α sovraespressione potrebbe dirigere una scelta di farmaci che agiscono sostanzialmente in modo p53-indipendente. D'altra parte, un particolare beneficio può derivare dalla combinazione HIF-1-inibitori e agenti che danneggiano il DNA (ad esempio, 5-FU) nei tumori con p53 funzionale. Al contrario, una ridotta efficacia di HIF-1-inibitori potrebbe essere anticipata per il trattamento di tumori p53 difettoso, un aspetto che può costituire un fattore di confusione in studi clinici di HIF-1α-inibendo regimi di trattamento.

Materiali e Metodi

coltura delle cellule e prodotti chimici

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) e MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokyo, Giappone), le cellule sono state coltivate come colture monostrato in mezzo standard . Generazione di cellule AGS e MKN28 esprimono stabilmente sia siRNA specificatamente destinate HIF-1α (atterramento, "KD") o di controllo aspecifici siRNA (strapazzate, "SCR") è stato pubblicato in precedenza [22]. 5-fluorouracile (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) dicloruro (cisplatino) ed il cloruro di superossido anione inibitori diphenyleneiodonium (DPI) e apocinina sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Germania) sciolti in DMSO. PRIMA-1 (per p53-riattivazione e l'induzione di una massiccia apoptosi) è stato ottenuto da Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) e disciolto in acqua sterile. controllo del veicolo dei solventi è stato incluso in tutti gli esperimenti.

La proliferazione cellulare saggio

Per la determinazione della crescita cellulare, 3 × 10 ^{4 cellule sono state seminate in triplicato in piastre da 24 pozzetti, ha permesso di collegare per 16 ore e poi trattati come indicato in normossia o condizioni di ipossia. Dopo il trattamento, le cellule sono state tripsinizzate, e le cellule vitali sono state contate con un emocitometro.}

Determinazione della distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi mediante citometria di flusso

Cell distribuzione del ciclo compreso il pre-G _{1 frazione è stata determinata da istogrammi di DNA, come descritto [52]. L'apoptosi è stata quantificata anche dal rilevamento di attivi, spaccati caspasi-3 mediante citometria a flusso utilizzando un Alexa Fluor® anticorpi 488-coniugato (Cell Signaling Technology Danvers, Massachusetts, USA).}

La quantificazione della senescenza

attività di β-galattosidasi senescenza associata è stata valutata in preparazioni cytospin come descritto [53].

Immunoblot analisi

lisati cellulari intere sono state preparate come descritto in precedenza [52], quindi deliberato un 10% sodio dodecil solfato gel di poliacrilamide e trasferito su nitrocellulosa (Amersham Biosciences, Freiburg, Germania). Macchie sono stati sondati con anticorpi contro p53 e CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, Stati Uniti d'America), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Germania), ciclina A (Upstate, Temecula, California, Stati Uniti d'America), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Germania), MDM2 (Calbiochem, San Diego, California, Stati Uniti d'America), p65 (Cell Signaling Technology) e actina (Sigma-Aldrich). anticorpi secondari sono stati coniugati con perossidasi di rafano (Dianova, Amburgo, Germania) e l'attività di perossidasi è stato visualizzato utilizzando il occidentale fulmine Chemiluminescenza reagente più (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA).

quantitativa real-time PCR analisi

Per real-time PCR, RNA cellulare totale è stato estratto con il reagente Trizol (Invitrogen, Karlsruhe, Germania). Prima filamento di cDNA è stato sintetizzato con un (dT) primer oligo e ™ First Strand Synthesis System SuperScript (Invitrogen). Quantitativa real-time PCR è stata eseguita utilizzando TaqMan PCR universale Mastermix (per β-actina) o SYBR Green PCR Master Mix (per A20 e cIAP1, Applied Biosystems, Darmstadt, Germania). sequenze primer sono forniti in Tabella S1. Per normalizzare la quantità di RNA di ingresso, reazioni di PCR sono state fatte con la sonda e primer per il β-actina.

trasfezione transiente e giornalista luciferasi test

trasfezioni transienti di cellule AGS sono stati effettuati utilizzando Effectene Trasfezione Reattivo (Qiagen, Hilden, Germania) secondo il protocollo del produttore. Per gli studi di iperespressione, le cellule sono state seminate a 3 × 10 ^{4 celle /24-bene e trasfettate con 100 ng di pcDNA HIF-1α (gentilmente fornito da Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Germania) o pcDNA p65 (gentilmente fornito da Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Giappone), rispettivamente. Per HRE o saggio luciferasi di NF-kB, 3 × 10 4 celle /24 pozzetti sono stati co-trasfettate con 100 ng di Phre-Luc (un dono di Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, California, Stati Uniti d'America) o IgκB-Luc (un dono di Florian R. Greten, Technische Universität München, Monaco di Baviera, Germania), e 30 ng di phRL-null (Promega, Mannheim, Germania). l'attività luciferasi è stata misurata con la luciferasi Reporter Assay sistema Dual (Promega), come descritto [54]. Per ottenere la soppressione p53 transitoria, le cellule sono state trasfettate AGS al 30% confluenza con 75 o 150 nmol /L si p53, ( Silenziatore
Selezionare siRNA, Applied Biosystems) e analizzati 48 ore dopo la trasfezione. Un non-specifici siRNA (SI SCR, Eurogentec, Seraing, Belgio) è stato utilizzato come controllo.}

elettroforetica saggio mobility shift (EMSA)

estratti proteici nucleari sono state preparate come descritto [54]. EMSA è stata eseguita come descritto in precedenza [55] con 8 mg di proteina nucleare e 100 fmol /L di fine-radiomarcato 22 bp a doppio filamento di NF-kB consenso oligonucelotide (sezione in avanti: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 '; E3292, Promega). I campioni sono stati risolti mediante elettroforesi su un non-denaturazione gel di poliacrilammide al 5%.

• PLoS ONE: let-7 microRNA famiglia è selettivamente secreta nel extracellulare ambiente tramite Esosomi in una cella metastatico cancro gastrico Line
• PLoS ONE: grande diversità di vacA e cagA Helicobacter pylori genotipi in pazienti con e senza gastrico Cancer