Фон
<р> Снижение химиочувствительность твердых раковых клеток представляет собой стержневую препятствие в клинической онкологии. Следовательно, молекулярная характеристика путей, регулирующих химиочувствительность является центральным условием для улучшения терапии рака. Гипоксия-индуцируемый фактор HIF-1α был связан с химиочувствительность в то время как базовые молекулярные механизмы остаются в значительной степени недостижимой. Поэтому мы всесторонне проанализировали роль HIF-1 в определении химиочувствительность с акцентом на ответственных молекулярных путей.
Таким образом, мы определили HIF-1 в качестве мощного регулятора p53 и NF-kB активность в условиях генотоксического стресса. Мы пришли к выводу, что p53 Финансирование:. Это исследование была поддержана грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) в TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 и 133 /2-3), и NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung унд -umsetzung"). TC также был поддержан грантом Berliner Krebsgesellschaft Э.В. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи Введение HIF-1α определяет чувствительность клеток рака желудка в сторону химиотерапевтических агентов 5-ФУ и цисплатин для подтверждения HIF-1-зависимой регуляции 5-FU отзывчивости и далее характеризуют вклад р53, мы исследовали второй желудка человека линии клеток рака (MKN28), который несет мутацию миссенс в TP53 NF-kB является важным медиатором роли HIF-1 в химиочувствительность Обсуждение культура клеток и химических веществ пролиферации клеток анализ иммуноблот анализ Для получения в режиме реального времени ПЦР-анализа, общая клеточная РНК экстрагировали реагентом Trizol (Invitrogen, Карлсруэ, Германия). Первую цепь кДНК синтезировали с олиго (дТ) праймера и первой системы SuperScript ™ Strand Synthesis (Invitrogen). Количественный анализ в реальном времени ПЦР проводили с использованием TaqMan PCR Универсальный Mastermix (для бета-актина) или SYBR Green PCR Master Mix (для A20 и cIAP1; Applied Biosystems, Дармштадт, Германия). Последовательности праймеров поставляются в таблице S1. Для того, чтобы нормализовать количество входных РНК, ПЦР-реакции проводили с зондом и праймеры для бета-актина.
мутации в опухолях человека обладают потенциалом, чтобы посрамить эффективность HIF-1-ингибиторов при лечении рака
<р> Цитирование:. Rohwer N, C-Дам, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Шмитт CA и др. (2010) Гипоксия-Индуцибельная фактор 1α Определяет Рак желудка химиочувствительность с помощью модуляции р53 и NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. DOI: 10.1371 /journal.pone.0012038
<р> Редактор: Деб Фокс, Научно-исследовательский институт по делам детей в детской больнице Нью-Орлеан, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 28 апреля 2010 года; Принято: 19 июля 2010 года; Опубликовано: 10 августа, 2010 года
<р> Copyright: © 2010 Ровер и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
<р> искробезопасности и приобрели резистентность к лекарственным средствам являются основными причинами для ограниченной эффективности химиотерапии у большинства желудочно-кишечных злокачественных опухолей, включая рак желудка [1], [2]. Лекарственная устойчивость представляет собой сложный и многофакторный феномен, связанный с опухолью микросреды, например гипоксия, ацидоз и воспаление, а также сама неопластическая клетка [3]. Клеточный сопротивление может быть присуще конкретного генетического фона клетки опухоли или в результате мутаций и эпигенетических изменений после антипролиферативным терапии [4], [5].
<Р> транскрипционный фактор индуцированного гипоксией фактор 1 (HIF-1 ) представляет собой стержневую регулятор клеточной адаптации к гипоксии и участвует в лекарственной устойчивости [6] - [8]. HIF-1 белок представляет собой гетеродимер, состоящий из экспрессирован -субъединицы (ARNT (арилуглеводородному Рецептор ядерный транслокатор)) и гипоксия-индуцируемых α-субъединица [9]. В соответствии с гипоксическим условиям, HIF-1α активность может быть вызвана различными факторами роста, цитокины, активированные онкогены или с потерей функции мутировали генов-супрессоров опухолей [10]. HIF-1α является центральным участником в нескольких аспектах онкогенеза, включая пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенеза, метастаз, а также реакции на химио- и лучевой терапией [11]. HIF-1α избыточно экспрессируется в огромном количестве солидных опухолей, и экспрессия опухолевыми HIF-1α часто ассоциируется с плохим прогнозом [12] - [15]. Кроме того, ингибирование HIF-1 с помощью РНК-интерференции или фармакологических соединений доказало противоопухолевая эффективность в различных мышиных моделях рака [16]. Вклад HIF-1 в химиорезистентности опухолевых клеток наблюдается в широком спектре солидных опухолей, включая рак желудка [6] - [8], [17] - [20]. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы, а также роль HIF-1 для лекарственной устойчивости при нормоксических условиях остаются в значительной степени недостижимой [8], [18], [21]. Здесь мы идентифицируем подавление р53 и продвижение ядерного фактора активности кВ (NF-kB) в качестве центральных механизмов HIF-1α-х чувствительность-определяющую роль в отношении 5-фторурацил (5-ФУ) и цисплатин в раковых клетках желудка человека.
Результаты
<р> Функциональная инактивация HIF-1 была достигнута путем лентивирусов трансдукции и AGS MKN28 клетки с малых интерферирующих РНК (миРНК) специфически ориентации HIF-1. Этот экспериментальный подход привел к высокоэффективную нокдаун, продемонстрированные почти полного отказа трансдуцированных клеток индуцировать HIF-1α белка в ответ на гипоксию, опубликованной ранее [22]. Для того, чтобы оценить важность HIF-1 для чувствительности клеток рака желудка человека по отношению к установленным химиотерапевтических агентов, мы сравнили эффекты 5-ФУ и цисплатин в HIF-1α-компетентной (закодированная, "SCR") и HIF-1-дефицитных (нокдаун, "KD") AGS клетки. Функциональная инактивация HIF-1 сдвинуты зависимость от дозы ингибирования роста в сторону более низких концентраций препарата (рис 1А и фиг S1), предполагая, что HIF-1α способна уменьшить химиотерапией восприимчивость клеток рака желудка при нормоксических условиях. В соответствии с предыдущими отчетами [6] - [8], [17], [18], воздействие гипоксии повышенную устойчивость к 5-ФУ в AGS клетках, однако инактивация HIF-1 приводит в надежной высоте химиочувствительность в условиях гипоксии ( Рисунок S2). В дополнительный подход, мы изучали последствия гиперэкспрессией HIF-1 (pcDNA HIF-1) для химиочувствительность клеток AGS. AGS клетки избыточно экспрессирующие HIF-1, были значительно более устойчивы к лечению с 5-ФУ (рис 1б). Стабильная экспрессия HIF-1α была подтверждена HRE (гипоксия отзывчивым элемент) люциферазы репортер анализа (рис 1C). Эти результаты убедительно показывают, что HIF-1α ограничивает цитотоксическое действие 5-ФУ и цисплатин в раковых клетках желудка человека и что инактивация HIF-1 может оказывать благотворное влияние на химиочувствительность.
HIF-1α пределы вызванной химиотерапией арест клеточного цикла и апоптоз путем подавления р53
<р> Мы начали характеристику наблюдаемого ингибирования роста путем анализа закономерностей распределения клеточного цикла после химиотерапии. G <суб> 1-синхронизированный, с недостатком сыворотки AGS клетки были освобождены из G <суб> 0 /G <суб> 1 фаза путем добавления сыворотки и клеточного цикла профили были определены после добавления 5-ФУ. Освобожденные культуры необработанных AGS легко прогрессировали через G <югу> 1 в S и G <суб> 2 /M фазы [22], в то время как 5-FU-обработанные клетки оставались в G <югу> 1 фаза (не показан). Интересно отметить, что 5-FU-зависимой удерживание клеток в G <югу> 1 фаза была значительно увеличена в AGS КД по сравнению с клетками АГС SCR, в соответствии с G <суб> 1 клеточного цикла (рисунок 2А). Необратимые арест клеточного цикла возник в качестве важного способа действия антипролиферативным агентов и характеризуется особенностями клеточных старении [7], [23]. Соответственно, доля стареющих клеток определяли. Действительно, лечение с 5-ФУ привело к надежной индукции старении в AGS клетках. Этот ответ был значительно усиливается в клетках с одновременной потерей HIF-1 (Фигура 2В). Кроме того, индукция апоптоза была предложена увеличенной предварительной G <югу> 1 фракции в гистограмм ДНК 5-FU-обработанных клеток АГС КД (не показан). Таким образом, количественный анализ фракции клеток путем апоптоза была получена на основании обнаружения расщепленной каспазы-3 (фиг.2с). В соответствии с данными о распределении клеточного цикла, 5-FU-индуцированной апоптическая фракция была значительно увеличена в HIF-1α-дефицитных клеток AGS KD по сравнению с HIF-1-компетентных клеток.
<Р> Химиотерапия индуцированных Старение и апоптоз оба были тесно связаны с опухолью супрессора p53
. Таким образом, мы предположили, что p53 может способствовать дополненной цитотоксичность 5-ФУ при потере HIF-1. После обработки 5-ФУ, белок р53 постепенно накапливается в клетках AGS, эффект, который был поразительно усиливается в HIF-1-дефицитных AGS клеток (рис 2D). Эта стабилизация р53 была связана с повышенным уровнем циклин-зависимой киназы (CDK) ингибиторов p21, хорошо организованной транскрипционной мишени и нижестоящим эффектором p53 с функциями в остановке клеточного цикла, увядания и индукции апоптоза (рис 2D). Опять же, HIF-1-дефицитных AGS клетки показали заметно более сильное увеличение p21, чем HIF-1-опытным AGS клеток. Сильная индукция р21, как ожидается, ингибируют активность G <суб> 1 циклин /CDK комплексы, что приводит к гипофосфорилирование белка ретинобластомы (PRB) и неспособность индуцировать фазовые циклины S, например, циклин А. В самом деле, как PRB гипофосфорилирование и пониженные уровни циклин А, были подтверждены в 5-FU-обработанных клеток АГС KD и - в меньшей степени - также в AGS SCR-клетки (рис 2D). Эти изменения подтверждают сохранение G <югу> 1 фазы наблюдается в гистограмм ДНК и совместимы с необратимой G <югу> 1 ареста наблюдается в химиотерапии индуцированных старении. Таким образом, различные биологические результаты лечения 5-ФУ в HIF-1α-дефицитных и -proficient AGS клетки возникают из-дифференциального регулирования р53 и его вниз по течению мишени р21.
Инактивация р53 притупляет роль HIF-1 для химиочувствительность
<р> Чтобы получить экспериментальные доказательства предложенной роли р53 в HIF-1-опосредованной регуляции химиочувствительность в клетках AGS, мы функционально инактивируют р53 путем РНК-интерференции с использованием временной трансфекции анти-p53 миРНК (Si p53) или вскарабкался контроль миРНК (си ЮКЖД). Р53 был эффективно нокдауне, как показано неспособностью трансфицированных клеток, чтобы индуцировать р53 эффекторы р21 и MDM2 в ответ на 5-FU обработки (фиг.3А). Интересно отметить, что АГС KD клетки, трансфицированные си p53 были значительно менее чувствительны к ингибированию роста 5-ФУ, чем клетки АГС KD, трансфицированных контрольной миРНК (рис 3б). В соответствии с этими выводами, G цикл удержания <суб> 1 клеток и апоптоз 5-FU-обработанных клеток АГС KD были снижены на р53 нокдауна по сравнению с клетками, трансфицированных контрольной миРНК (на фиг.3D и 3Е). В резком контрасте, химиочувствительность HIF-1-опытным AGS клетки не находился под влиянием инактивации р53 (рис 3C).
HIF-1α не в состоянии повлиять на химиочувствительность в P53
мутантных клеток <бр>
в кодоне 251. Интересно, что удаление HIF-1 в клетках MKN28 не удалось улучшить торможение роста после воздействия 5-ФУ (рис 4а). Аналогичным образом, 5-FU-индуцированное G <югу> 1 накопление и апоптоз клеток MKN28 не были затронуты потерей HIF-1 (рис 4В и 4С). В соответствии с этими выводами, уровни белка р53 и PRB остались без изменений в 5-FU-обработанных клеток MKN28 в течение всего 24-часового периода, и p21 индукция отсутствовал (рис 4D). Однако, когда функция р53 была восстановлена путем предварительной обработки с химическим соединением ПРИМА-1 [24] HIF-1α нокдаун транслируется в значительно расширенной 5-FU цитотоксичности (рис S3). В соответствии с установленной ролью p53 в химиотерапии индуцированных цитотоксических /цитостатических эффекты, лечение с PRIMA-1 по себе
слегка уменьшил пролиферацию клеток MKN28 и позволило существенно повысить эффективность 5-ФУ в MKN28 клетках (рис S3).
<р> Активация NF-kB, связанного с защитой от химиотерапии-индуцированного апоптоза и, наоборот, ингибирование NF -κB может повысить эффективность противоопухолевых средств и в естественных условиях
и в пробирке
[25] - [27]. Таким образом, мы определили NF-kB ДНК-связывающей активностью в HIF-1α-дефицитных и -proficient AGS клеток после обработки 5-ФУ путем методом сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Лечение с 5-ФУ сильнодействующий активированный NF-kB ДНК-связывающая в клетках АГС SCR, с пиковые уровни происходит через 6 ч после воздействия 5-ФУ (рис 5А). Лечение с помощью TNF α в течение 4 ч служил в качестве положительного контроля для активации NF-kB. Кроме того, supershift индуцировали анти-p65 антителом, подтверждая, что 5-ФУ, индуцируемые NF-кВ комплексы содержали субъединицу 65-кДа (р65). Потеря HIF-1 значительно ингибирует активацию NF-kB в ответ на 5-ФУ и TNF α (рис 5А). В соответствии с этим наблюдением, 5-ФУ лечение также не индуцируют генов-мишеней NF-kB и A20 cIAP1 в клетках AGS КД, в то время как они были легко индуцируется в клетках AGS SCR (Рисунок 5б)
. <Р> Для решения этой функциональное значение NF-kB для 5-FU-индуцированного ингибирования роста, мы гиперэкспрессия p65 (pcDNA P65) в клетках AGS KD. Трансфекция pcDNA р65, но не вектор управления пустым, привело к значительному индукции р65 белка и транскрипционной активности NF-kB в клетках АГС KD (рис S4). Следует отметить, что HIF-1-дефицитных AGS KD клетки сверхэкспрессией p65 были значительными более устойчивы к лечению 5-FU по сравнению с клетками AGS KD, трансфицированных контрольным вектором (5С), в соответствии с существенной роли NF-kB в опосредовании химическую устойчивость по отношению к 5-ФУ в клеток рака желудка. Взятые вместе, параллельную активацию р53 и ингибирование NF-kB в 5-ФУ лечение, наблюдалась HIF-1-дефицитных AGS клетки. Для того, чтобы уточнить, является ли оба события являются взаимозависимыми, мы исследовали 5-FU-индуцированной активации NF-кВ в MKN28 клетках с мутантом p53.
И 5-ФУ и TNF-alpha активированный NF-kB ДНК-связывающий в Time- зависимым образом, указывая р53-независимые механизмы активации NF-kB с помощью 5-ФУ (рис 5D). Тем не менее, отличается от нахождения в AGS клетках, эта активация NF-kB в <ЕМ> P53
мутант клеточная линия не была притупляется HIF-1α инактивацией. Таким образом, HIF-1α может поддерживать вызванной химиотерапией активацию NF-кВ, противодействуя ингибирующие механизмы р53-зависимой.
Altered образование ROS отвечает за HIF-1α-индуцированной модификации активности р53
<р> Для прояснить механизм, лежащий p53 superinduction молекулярный в 5-FU обработанных HIF-1α-дефицитных клеток, мы охарактеризовали роль активных форм кислорода (АФК). РОС образуют связь кандидата как (I) РОС являются мощными активаторами функции P53 и считаются ключевыми факторами при индукции р53 различных химиотерапевтических агентов [28], и (II), HIF-1α может подавлять образование активных форм кислорода за счет уменьшения активности митохондрий и биогенеза [22], [29], [30]. Соответственно, клетки AGS КД подвергают предварительной обработке с хлоридом РОС-ингибиторы diphenyleneiodonium (DPI) или апоцинин. Оба ингибитора присвоил значительную защиту от 5-FU-индуцированного ингибирования роста в клетках AGS KD (рис 6A и 6B). Кроме того, DPI и апоцинин почти полностью предотвратить индукцию р53 и его вниз по течению мишени p21 в 5-FU-обработанных клеток (рис 6С и 6D). Эти результаты указывают на пересечение сигналов HIF-1 с p53-опосредованной реакции на 5-ФУ на уровне производства ROS. Для того, чтобы установить причинную роль HIF-1 для окислительно-восстановительного потенциала AGS клеток после обработки 5-ФУ, внутриклеточные уровни ROS были определены в AGS КД и SCR клеток с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что внутриклеточные уровни супероксид в 5-FU-обработанных клеток АГС кД в 2,5 раза выше, чем в 5-FU-обработанных клеток АГС SCR (Рисунок S5), указывая, что функциональная инактивация HIF-1 в клетках AGS привело значительное и функциональное повышение внутриклеточного окислительного стресса даже при химиотерапевтического лечения
<р> транскрипционный фактор HIF-1α был создан в качестве важного посредника гипоксией опосредованной химиорезистентности [6] - [8]. , [17], [18], [20]. Здесь мы определяем HIF-1 в качестве мощного определителя химиочувствительность в раковых клетках желудка при нормоксических условиях. Применяя лентивирус на основе системы миРНК мы показывают значительно улучшена 5-ФУ и цисплатин токсичность в HIF-1-дефицитных клеток рака желудка. Имеющиеся данные о роли HIF-1 для химиочувствительность раковых клеток при нормоксических условиях противоречивы. В то время как HIF-1-дефицитных клеток саркомы (НТ1080) отображаемую значительно повышена чувствительность к этопозид при атмосферном воздухе, рак толстой кишки (НСТ116) и гепатомы (Гепа-1) клетки не в состоянии сделать это [6]. Унрух <ЕМ> и др.
Сообщили повышенную восприимчивость HIF-1-дефицитных мышиных эмбриональных фибробластов карбоплатин или этопозид под нормоксических, а также гипоксических состояний [8]. Что касается рака желудка, повышенная эффективность 5-ФУ и винкристин было продемонстрировано при нормоксии в пробирке
[18]. Ну в соответствии с нашими результатами, оба исследования пришли к выводу, решающую роль для HIF-1 в опосредовании химическую устойчивость при нормоксических условиях. Интересно, что недавнее исследование, проведенное в Японии продемонстрировали низкую эффективность 5-ФУ на основе химиотерапии в HIF-1, экспрессирующих желудка аденокарциномы человека, усиливая восприятие HIF-1, как ключевой фактор при определении желудка химиорезистентности рака [31].
<р> Контроль прогрессирования рака химиотерапией зависит, по меньшей мере, частично на индукцию клеточного старения. В последнее время потеря HIF-1 было показано, чтобы вызвать преждевременное старение увековечены мышиных эмбриональных фибробластов под нормоксических условиях [32]. Наши текущие данные свидетельствуют о том, что HIF-1α аналогично оберегает желудочные раковые клетки против химиотерапии индуцированных старении при нормоксических условиях. Это представляет собой первый доклад повышенной вызванной химиотерапией старении с помощью функциональной инактивации HIF-1 в установленной линии раковых клеток человека. В HIF-1-дефицитных клеток, мы также наблюдали улучшилось индукции апоптоза в ответ на 5-ФУ. Предыдущие исследования сообщили о реактивации проапоптотической фактора торгов [6], либо изменение в балансе про- и антиапоптотических членов Bcl-2 семьи отчитаться о повышении уровня апоптоза после инактивации HIF-1 в клетках рака желудка наркотиков лечение [ ,,,0],. 18]
<р> Наше текущее исследование идентифицирует механизм нового, в результате чего HIF-1α противодействует как вызванной химиотерапией старение и апоптоз: Мы представляем убедительные доказательства способности HIF-1 для подавления индукции опухолевого супрессора р53 в ответ на 5-ФУ при нормоксических условиях. Р53 является ключевым фактором, определяющим судьбу клеток из-за его роли в регулировании ход клеточного цикла и апоптоза в ответ на клеточный стресс и представляет собой наиболее часто мутантный ген в злокачественных опухолях человека [33]. Широкое разнообразие химиотерапевтических агентов было показано, что стабилизировать P53 и, наоборот, утрата р53 является принцип механизм устойчивости рака по отношению к химиотерапии [33], [34]. Взаимодействие р53 и HIF-1 был предметом дискуссий многолетними, как и положительные и отрицательные отчеты были опубликованы [35]. Тем не менее, вся ранее опубликованная работа сосредоточена на p53-HIF-1-взаимодействиях при гипоксических (или даже бескислородных) условиях. Насколько нам известно, наши эксперименты впервые представить доказательства для подавления активности р53 по HIF-1 при нормоксических условиях. Как следствие р53 повышающую регуляцию в HIF-1-дефицитных клеток, мы наблюдали изменения в нижестоящих эффекторов, которые связаны с необратимой клеточного цикла характеристики старении, например, Стабилизация р21 и гипофосфорилирование PRB. В отличие от нашего наблюдения, недавняя работа на химиорезистентности направлении этопозид в HIF-1α-дефицитных увековечены мышиных эмбриональных фибробластов не наблюдали индукцию р21 [36]. Кроме того, HIF-1α стабилизировались p21 и p27, а также привело к гипофосфорилирование PRB при гипоксии, вызванной арестом роста иммортализованных мышиных эмбриональных фибробластов и первичных селезеночных В-лимфоцитов [37]. Эти контрастные результаты, скорее всего, объясняется исследованных типов клеток: В то время как Goda и др
. характеризуется физиологической реакции на гипоксию в нетрансформированных типах клеток, мы проанализировали ответ на серьезные повреждения ДНК в установленных линий раковых клеток.
<р> В то время как p53 неоднократно показано, что противодействовать функции NF-кВ [38], [39 ], наши текущие данные указывают на роль опухолевого супрессора в регуляции HIF-1-зависимой активации NF-kB. Помимо p53, NF-kB стала второй, центральной детерминанта устойчивости к химиотерапевтических агентов [40]. Несколько различных исследований установили функциональные связи между NF-kB и HIF-1, хотя они переменно место HIF-1 либо вверх по течению от NF-kB, или наоборот. Например, гипоксия-индуцированный стабилизация HIF-1 в клетках гладких мышц находится под транскрипционным контролем NF-kB [41]. Аналогичным образом, результаты, полученные из условных нокаутных мышей ИКК-бета подтвердили ключевую роль NF-kB в управлении базальную и экспрессии гипоксия-индуцированный из HIF-1 В естественных условиях
[42]. И наоборот, экспрессия гена субъединицы р65 NF-kB была продемонстрирована контролироваться HIF-1 в контексте гипоксией подавлено апоптоз нейтрофилов [43]. Таким образом, наша находка заметно пониженной активности NF-kB в HIF-1-дефицитных клеток после обработки 5-ФУ хорошо в соответствии с этим последним докладом. Интересно, что мы также наблюдали значительное снижение ДНК связывание NF-kB в субъединиц HIF-1α-дефицитных клеток после стимуляции TNF α, хорошо известного индуктора активности NF-kB [44]. В этой связи возникает уместный вопрос, при которых физиологические и патофизиологические условия HIF-1α способен регулировать активацию NF-кВ. HIF-1α и NF-kB разделяют решающее значение для различных процессов, таких как воспаление, микробной убийства и онкогенеза. Точная молекулярная природа, а также иерархия их взаимодействия, скорее всего, и контекстно-Cell-зависящих и не может быть обобщен.
<Р> В настоящем исследовании мы смогли точно определить ROS как точки пересечения HIF- 1 α с p53-опосредованного клеточного ответа на стресс к химиотерапии. Внутриклеточные РОС известны как мощные индукторы р53 и участвуют в активации р53 химиотерапевтических препаратов [45]. Митохондрии представляют собой основной источник внутриклеточной ROS [46], и HIF-1α скорее противодействует производство ROS на митохондриальной уровне через множество механизмов, включая ингибирование митохондриального биогенеза и пирувата челночного в митохондрии, снижение активности митохондрий за счет более широкого применения гликолиза и активация митохондриального аутофагии [29], [30], [47], [48]. Ранее мы установили функциональную связь между HIF-1α-контролируемого восстановления ROS и анкерного независимости клеток рака желудка [22], вовлекая HIF-1 в патогенезе рака желудка при отсутствии гипоксии. Теперь мы находим, что capacitiy из HIF-1, чтобы ограничить ROS производство клеток рака желудка также придает устойчивость к химиотерапевтическим агентам, которые действуют через активацию р53 (рис 6E). Интересно отметить, что все большее влияние на резистентность к терапии с помощью модуляции р53 и ROS также сообщалось для HIF-2Л [49]. В HIF-альфа изоформы 1 и 2 показывают широкое перекрытие в предполагаемых мишеней HIF и связывание с гипоксических элементов ответа и определенное распределение гипоксией индуцированных эффектов для любой изоформы не всегда осуществимы [50]. Bertout и др.
Показано, что ингибирования HIF-2Л увеличивает радиационно-индуцированный апоптоз посредством накопления ROS и последующего увеличения активности р53 [49]. Кроме того, Робертс и др.
Показали, что устойчивость к химиотерапии частично опосредовано HIF-2α-опосредованной подавление p53 в клетках карциномы почечных клеток [51]. Следовательно, установленном настоящим Федеральным законом данные наблюдений заслуживают расследования потенциальной роли HIF-2Л, задача, которая в настоящее время в нашей лаборатории.
<Р> С учетом клинической необходимости выявления предикторов ответа доступных вариантов лечения, наш результаты могут потенциально прямые решения в отношении лечения: с одной стороны, знание HIF-1 сверхэкспрессии может направить на выбор лекарственных средств, которые в значительной степени действуют в p53-независимым образом. С другой стороны, особое преимущество может быть результатом сочетания HIF-1-ингибиторы и ДНК повреждающих агентов (например, 5-ФУ) в раковых заболеваний с функционального р53. И наоборот, снижается эффективность HIF-1-ингибиторов можно было бы ожидать для лечения р53 дефектных опухолей, аспект, который может представлять собой сбивающий фактор в клинических испытаниях HIF-1-ингибирующие режимы.
Материалы и методы лечения
<р> AGS (CRL-1739, АТСС, Роквилл, Мэриленд, США) и MKN28 (JCRB Cell Bank, Токио, Япония) выращивают в виде монослойных культур в стандартной среде , Генерация AGS и MKN28 клеток, стабильно экспрессирующих либо миРНК специфически ориентации HIF-1 (нокдаун, "KD") или неспецифическая управления миРНК (закодированная "SCR") была опубликована ранее [22]. 5-фторурацил (5-ФУ), цис-диаминплатины (II) дихлорид (цисплатин) и хлорид супероксидного анион-ингибиторы diphenyleneiodonium (DPI) и апоцинин были приобретены у Sigma-Aldrich (Германия) и растворяли в ДМСО. ПРИМА-1 (для р53-реактивации и индукции апоптоза массивным) получали из Tocris Biosciences (Ellisville, штат Миссури, США), и растворяли в стерильной воде. Контроль автомобилей растворителей была включена во всех экспериментах.
<р> Для определения клеточного роста, 3 × 10 4 клеток высевали в трех повторах в 24-луночные планшеты, позволяли закрепляться в течение 16 ч, а затем обрабатывали, как указано в нормоксических или гипоксических условиях. После обработки клетки обрабатывали трипсином и жизнеспособные клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра.
Определение распределения клеточного цикла и апоптоза с помощью проточной цитометрии
<р> распределение клеточного цикла, включая пре-G <суб> 1 фракции определяют из гистограмм ДНК, как описано [52]. Апоптоз также количественному от обнаружения активных, расщепляется каспазы-3 с помощью проточной цитометрии с использованием Alexa Fluor® 488-конъюгированного антитела (Cell Signaling Technology, Danvers, штат Массачусетс, США).
Количественное старении
<р> β-галактозидазы Старение-ассоциированные оценивали в цитоспиновых препаратах, как описано [53].
<р> Цельные клеточные лизаты получали, как описано ранее [52], а затем разрешаться в 10% додецилсульфат натрия-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозу (Amersham Biosciences, Freiburg, Германия). Блоты зондировали антителами против р53 и CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, штат Калифорния, США), p21 (онкоген Research Products, Bad Soden, Германия), циклин A (Upstate, Temecula, Калифорния, США), PRB (BD Pharmingen , Heidelberg, Germany), MDM2 (Calbiochem, Сан-Диего, штат Калифорния, США), p65 (Cell Signaling Technology) и актина (Sigma-Aldrich). Вторичные антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Дианова, Гамбург, Германия) и пероксидазной активности визуализировали с использованием западной Lightning хемилюминесценции Реагент Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США).
Количественная ПЦР в реальном времени анализ
Переходная трансфекция и репортер люциферазы анализа
<р> Переходные трансфекции AGS клеток проводили с использованием Effectene Трансфекция Реагент (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Для исследований избыточной экспрессии, клетки были высеяны на 3 × 10 4 клеток /24-хорошо и трансфицировали 100 нг pcDNA HIF-1 (любезно предоставленный Wanja Бернхардта, Universitätsklinikum Эрлангене, Эрланген, Германия) или pcDNA p65 (любезно предоставлены по Хироясу Накано, Jutendo университет, Токио, Япония), соответственно. Для HRE или люциферазы NF-kB, 3 × 10 4 клеток /24-луночного котрансфицируют со 100 нг pHRE-Luc (подарок от Randall С. Джонсон, UCSD, Сан-Диего, штат Калифорния, США) или IgκB-Люк (подарок от Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Германия), и 30 нг phRL-нуль (Promega, Mannheim, Германия). Активность люциферазы измеряли с системой Dual люциферазы анализа (Promega), как описано [54]. Для достижения переходных процессов подавления р53, AGS клетки трансфицировали на 30% слияния с 75 или 150 нмоль /л си р53 ( Глушитель
Выбор миРНК, Applied Biosystems) и анализировали через 48 ч после трансфекции. Неспецифический миРНК (си ЮКЖД, Eurogentec, Серен, Бельгия) использовали в качестве контроля.
Электрофорезная сдвиг подвижности анализ (EMSA)
<р> Экстракты ядерный белок получали, как описано [54]. EMSA проводили, как описано ранее [55], используя 8 мкг ядерного белка и 100 фмоль /л конечного-метили 22 п.н. двухцепочечная NF-kB консенсус oligonucelotide (вперед нити: 5'-AGT ТГА GGG GAC ТТТ CCC AGG C- 3 '; E3292, Promega). Образцы были решены с помощью электрофореза на не денатурирующих 5% полиакриламидном геле.
Риск рака пищевода можно снизить с помощью эзомепразола и аспирина в низких дозах.
Женщины, рожденные с помощью кесарева сечения, имеют больший риск ожирения и диабета.
Основные моменты и ключевые выводы Бостонской конференции по бактериям 2019 г. (BBM)
Дети имеют иммунитет к SARS-CoV-2
Сильный микробиом в раннем возрасте связан с меньшим количеством респираторных инфекций
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Пандемия COVID-19 распространяется во все уголки мира. Но не все заболевают одинаково. Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv в апреле 2020 года предполагает, что состав микро
Кормить домашних животных сырой пищей безопасно,
находит новое исследование Крупное международное исследование показывает, что владельцы домашних животных не считают, что кормление сырой пищей увеличивает риск заражения членов семьи. Сырая пища вклю
Анти-коронавирусные молекулы микробов могут стать ключом к новым методам лечения
Микробы в кишечнике, которые производят полезные соединения, могут стать ключом к лечению симптомов коронавируса. Микробиом кишечника. Изображение предоставлено:Anatomy Image / Shuttersto