PLoS ONE: Elettroagopuntura a ST36 migliora lo svuotamento gastrico e salvataggi Reti di cellule interstiziali di Cajal nello stomaco di ratti diabetici

Astratto

L'esaurimento delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) è certificata nello stomaco dei pazienti diabetici. Anche se elettroagopuntura (EA) a ST36 è una terapia efficace per regolare la motilità gastrica, i meccanismi di EA a ST36 sullo svuotamento e reti di ICC gastrica rimangono da chiarire. Gli obiettivi di questo studio sono stati per studiare gli effetti di EA sullo svuotamento gastrico e sulle alterazioni di reti ICC. I ratti sono stati randomizzati nel controllo, ratti diabetici (DM), ratti diabetici con sham EA (DM + SEA), ratti diabetici con EA a bassa frequenza (DM + LEA) e ratti diabetici con i gruppi EA ad alta frequenza (DM + HEA). L'espressione di c-kit in ogni strato della parete gastrica è stata valutata mediante western blotting. La proliferazione di CPI è stata identificata da immunomarcatura di c-kit e Ki67 come apoptosi delle CCI è stato esaminato dal TUNEL. I risultati sono stati i seguenti: (1) svuotamento gastrico è stata gravemente ritardata nel gruppo DM, ma accelerato nel gruppo LEA e HEA, soprattutto nel gruppo LEA. (2) L'espressione di c-kit in ogni strato è stato ridotto apparentemente nel gruppo DM, ma anche up-regolata nel gruppo LEA e HEA. (3) Abbondante proliferato ICC (c-kit + /Ki67 +) formando reti cespugliose con celle c-kit + sono stati osservati nel gruppo LEA e HEA, mentre le cellule apoptotiche (c-kit + /TUNEL +) erano appena catturato nel gruppo LEA e HEA . Collettivamente, EA a bassa ed alta frequenza ST36 salvare le reti danneggiate del CPI inibendo l'apoptosi e migliorando la proliferazione nello stomaco di ratti diabetici, con un conseguente miglioramento svuotamento gastrico

Visto:. Chen Y, Xu JJ , Liu S, Hou XH (2013) Elettroagopuntura a ST36 migliora lo svuotamento gastrico e salva reti di cellule interstiziali di Cajal nello stomaco di ratti diabetici. PLoS ONE 8 (12): e83904. doi: 10.1371 /journal.pone.0083904

Editor: Yvette Tache, Università della California, Los Angeles, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 9 agosto 2013; Accettato: 8 Novembre 2013; Pubblicato: 31 Dicembre 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Il lavoro è stata parzialmente sostenuta da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.670.775, n ° 81.270.458). Nessun finanziamento esterno supplementare ricevuto per questo studio. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

tipi di disturbi della motilità gastrointestinale che vanno da dispepsia funzionale a gastroparesi influenzare pesantemente la qualità della vita dei pazienti affetti da decenni di diabete mellito [1]. Gastroparesi, caratterizzata da ritardato svuotamento gastrico, si verifica fino al 30% dei soggetti con diabete di tipo 1 [2]. Anche se i vari interventi terapeutici, tra cui il trattamento farmaceutico e alcuni trattamenti non farmacologici sono stati provati, gli effetti curativi per gastroparesi restano insoddisfacenti.

L'agopuntura è stata empiricamente usato per il trattamento di disturbi gastrointestinali nei paesi orientali per migliaia di anni. Electroacupuncture (EA), che è una modifica di agopuntura tradizionale, è più adatto per le impostazioni di ricerca clinica e di base per la sua riproducibilità. Zusanli
(ST36) è un punto terapeutico comune frequentemente usato per trattare le malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, gli effetti di EA a ST36 sulla motilità gastrica sono stati valutati in numerosi studi. Per gli animali, EA a ST36 in modo significativo aumento della motilità gastrica nei ratti coscienti e migliorato ritardato svuotamento gastrico nei ratti diabetici STZ-indotta [3], [4]. Inoltre, nell'uomo, EA a ST36 accelerato svuotamento gastrico e sollevato sintomi dispeptici in pazienti dispepsia funzionali e soggetti diabetici con gastroparesi [5], [6]. Anche se in questi studi è stata adottata solo EA a bassa frequenza, EA ad alta frequenza è stato anche segnalato per promuovere esofagea e distale motilità del colon negli animali [7], [8]. Così, gli effetti di differenti EA frequenza sulla motilità gastrica ed i meccanismi alla base attirare l'attenzione della gente.
Significato

cellule interstiziali di Cajal (ICC), consolidate come pacemaker che generano e si propagano onde lente, hanno guadagnato nella regolazione gastrointestinale motilità diversi decenni [9]. Tre sottotipi di ICC, tra cui ICC intramuscolare (ICC-IM), ICC mioenterico (ICC-MY) e sottomucosa ICC (ICC-SM) sotto forma di reti intatti nella parete gastrica [10]. Le reti di ICC non sono statici, anche in condizioni fisiologiche; apoptosi e transdifferenziazione portano alla perdita ICC, mentre ICC può anche essere ripristinato dalla proliferazione, la ricarica da cellule staminali e di aumentare la sopravvivenza [11], [12]. Studi approfonditi hanno documentato che la perdita e il danno di ICC causati disordinata motilità gastrointestinale nei modelli animali e pazienti con diabete [13] - [15]. Di recente, ulteriori studi hanno riportato che EA ha facilitato la crescita del CPI del colon in topi e ratti di transito costipazione lenti dopo enteroenterostomy [16], [17]. Il nostro recente studio ha anche dimostrato che EA a ST36 potrebbe ripristinare ICC alterata nel colon dei ratti diabetici [18]. Nel frattempo, si è preoccupato che EA ha promosso la proliferazione e ha inibito l'apoptosi delle cellule cerebrali nell'ippocampo [19], [20]. Tuttavia, vi è un vuoto sugli effetti della EA in ST36 su ICC in gastroparesi diabetica e il meccanismo se la proliferazione e l'apoptosi delle ICC sono coinvolti

Pertanto, gli obiettivi di questo studio erano:. 1) valutare gli effetti di differenti EA frequenza svuotamento gastrico; 2) studiare gli effetti di EA a ST36 sulle reti di ICC in ratti diabetici; 3) certificare se il apoptosi e la proliferazione di ICC sono stati coinvolti.

Materiali e Metodi

Etica dichiarazione

I ratti hanno ricevuto la cura umana e questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, con tutte le operazioni approvate dalle linee guida etiche del Comitato Animal cura e l'uso di collegio medico Tongji, Huazhong Università della Scienza e della Tecnologia.

Animali

ratti maschi Sprague-Dawley pesavano 250-300 g sono stati selezionati in questo studio. I ratti sono stati ottenuti dall'esperimento Animal Center di Tongji Medical College (Huazhong Università della Scienza e della Tecnologia, Wuhan, Cina) e tenuti in condizioni di laboratorio normali (22 ° C, 12/12 h ciclo luce-buio), con libero accesso al cibo e acqua sterile. Dopo una settimana di alimentazione adattativo, gli animali sono stati ufficialmente adottati nei nostri esperimenti.

Diabetic modello

Dopo il digiuno durante la notte, ma il libero accesso all'acqua, i modelli sono stati stabiliti con una singola iniezione intraperitoneale di streptozotocina in ratti (STZ, 60 mg /kg, vale a dire 1 ml /100 g di peso corporeo, Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA), appena disciolti in 20 mM soluzione tampone citrato (pH 4.5, Sigma, St Louis, MO, USA) . Il gruppo di controllo è stato iniettato con un volume uguale di tampone citrato. Tutti i ratti sono stati alloggiati nelle stesse condizioni, con la privazione di acqua per 4 ore, ma ad libitum
alimentazione. Una settimana dopo l'iniezione, il diabete è stata confermata nel tempo differente misurando il glucosio in una goccia di sangue intero ottenuto pungere la punta della nave coda. Una glicemia di ≥16.7 mmol /L è stato preso come standard per il modello di successo. La glicemia è stato proiettato puntualmente prima dell'iniezione e 1, 4 e 8 settimane dopo l'iniezione. Inoltre, la perdita di peso, polidipsia e poliuria sono stati ulteriori indicatori di evidenziare l'incentivo di successo del topo diabetico.

protocolli sperimentali

I ratti sono stati randomizzati in cinque gruppi (10 ratti di ogni gruppo), compreso il controllo , gruppo diabetica (DM), ratti diabetici con sham gruppo AE (SEA, solo agopuntura senza corrente elettrica, 30 min /d), ratti diabetici con il gruppo a bassa frequenza EA (LEA, 10 Hz, 1-3 mA, 30 min /d ) e ratti diabetici con alta frequenza gruppo AE (HEA, 100 Hz, 1-3 mA, 30 min /d). EA è stata implementata a punto terapeutico ST36 con uno stimolatore elettrico (G6805-2A; Shanghai Huayi strumento medico di fabbrica, Shanghai, Cina) tutti i giorni per 8 settimane. La corrente elettrica è stato stabilito secondo un po 'tremante degli arti inferiori. Per raggiungere lo scopo di eliminare l'influenza di stress, animali potevano muoversi liberamente nel proprio involucro durante la procedura EA.

Dopo successivo intervento per 8 settimane, i ratti di ciascun gruppo sono stati testati per lo svuotamento gastrico. Poi sono stati sacrificati, e esemplari di antro sono stati attentamente ottenuti. Ogni campione è stato diviso in più pezzi, relativamente piccolo è stato conservato a -80 ° C per l'analisi western blotting dopo strati appena staccati e un pezzo è stato messo in glutaraldeide al 2,5% per la microscopia elettronica, e il resto è stato risolto nel fissativo di Zamboni (2 % paraformaldeide e 1,5% soluzione di acido picrico satura in 0,1 M tampone fosfato (PBS, pH 7,4) per immunofluorescenza.

Misurazione dello svuotamento gastrico

Lo svuotamento gastrico è stata eseguita una modifica come descritto precedenza [21]. Il pasto di prova contenente rosso fenolo (0,5 mg /ml) come indicatore e carbossimetilcellulosa (15 mg /ml) era costantemente agitata e poi tenuto a 37 ° C. Dopo il cibo deprivati ​​notte, i ratti sono stati ricevuti 2 ml di fenolo pasto rosso somministrato attraverso un ago sonda gastrica. Trenta minuti dopo, gli animali sono stati rapidamente sacrificati mediante dislocazione cervicale. l'intero stomaco è stato rimosso attentamente dopo la legatura al cardias e pilorica, e quindi lo stomaco era aperto ed il suo contenuto sono stati versato in una provetta e lavato con 40 ml di acqua distillata. Alla fine dell'esperimento, soluzione di NaOH (20 ml, 1 M) è stato aggiunto a ciascuna provetta per sviluppare la massima intensità del colore. L'assorbanza del campione letta a 560 nm con uno spettrofotometro (HITACHI, U-2900) è stato quello di riflettere la quantità di rosso fenolo rimanente nello stomaco. Il tasso di svuotamento gastrico è stato calcolato secondo la seguente formula: svuotamento gastrico (%) = 100 x (1 - X /Y), X rappresenta assorbanza di fenolo rosso raccolti dallo stomaco di animali sacrificati 30 min dopo il pasto test. Y rappresenta assorbanza di rosso fenolo recuperato dallo stomaco di controllo degli animali uccisi subito dopo la somministrazione del pasto di prova.

Western Blotting

campioni freschi di gastrico erano state riposte per un piatto Sylgard e ogni strato è stato staccato con cura da dissezione tagliente dopo la rimozione della mucosa. Con l'aiuto di una pinza sottile punte e forbici microchirurgiche sotto un microscopio da dissezione, sono stati ottenuti strati di ICC-SM, ICC-IM e ICC-MY. Tutte le manipolazioni sono state fatte sul ghiaccio per evitare la perdita di proteine. E poi i campioni di ICC-SM, ICC-IM e ICC-MY sono stati conservati a -80 ° C.

campioni freschi-congelati sono stati schiacciati nella sospensione cellulare e omogeneizzato in RIPA buffer (Upstate, Temecula, CA , Stati Uniti d'America) con inibitore delle proteasi (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). La miscela è stata centrifugata a 12000 g per 10 minuti a 4 ° C, ei surnatanti sono stati raccolti come proteine ​​totali. La concentrazione proteica è stata determinata con il metodo di Bradford. Successivamente, equivalenti di 50 mg di proteine ​​estratte sono state via via separate da 10% di sodio dodecilsolfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferite in PVDF membrana (Millipore, Bedford, MA, USA). Seguito bloccando punti di legame non specifici con latte secco 5% senza grassi in soluzione salina Tris tamponata contenente a temperatura ambiente 0,1% Tween 20 (TBST) per 1 ora, queste membrane sono state incubate con anticorpo primario anti-c-kit (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc) notte a 4 ° C con coniglio anti-topo actina (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) è servito come il controllo interno. Dopo tre lavaggi con TBST, le membrane incubate con HRP-linked anticorpo secondario (coniglio HRP-linked anti-capra e capra HRP-linked anti-topo, 1:5000) per 1 ora a temperatura ambiente. Seguito con tre lavaggi di TBST, le bande sono state visualizzate mediante reazione chimica con maggiore agente chemioluminescenza (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ed il blot è stato sottoposto ad autoradiografia. analisi densitometria è stata eseguita da Quantity One software (Bio-Rad Technical Service Department, versione 4.6.2).

studi di immunofluorescenza

Per i preparati di colorazione-mount intere, lo stomaco è stato aperto e risciacquato diversi volte con PBS. gastrico è stato bloccato per un piatto Sylgard e si estendeva al 150% delle loro dimensioni originali, e poi fissato con fissativo di Zamboni per 24 ore a temperatura ambiente. I tessuti fissati sono state lavate con PBS e poi la mucosa è stato rimosso dalla dissezione tagliente. ICC-SM localizzare sulla superficie sottomucosa dello strato muscolare circolare, ICC-IM mescolanza tra le cellule muscolari lisce e ICC-MY assieme plesso nervoso mioenterico sono stati preparati con cura utilizzando a punta fine pinze e forbici microchirurgiche sotto un microscopio da dissezione.

Le procedure di immunoistochimica per la rilevazione di reti ICC e proliferazione sono stati precedentemente descritti [22]. Ki67, una proteina nucleare espressa durante tutte le fasi attive del cellulare e scomparso nella cella di riposo, è stata applicata per rilevare la proliferativa ICC [23]. Dopo aver lavato sei volte con PBS per 1 ora, i tessuti sono stati incubati con 5% di siero normale bovina in PBS contenente 0,3% Triton X-100 (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente e poi incubate con l'anticorpo primario c-kit (1:100 , Santa Cruz, CA, USA) e Ki67 (1:100; Abcam, Cambridge, UK) notte a 4 ° C. Dopo il risciacquo in PBST per 30 minuti, l'immunoreattività è stata rilevata con Alexa Fluor 594 coniugato anticorpo secondario (IgG asino anti-capra, 1:100) e Alexa Fluor 488 coniugato anticorpo secondario (asino anti-IgG Rabit, 1:100) a 37 ° C per 1 ora, seguito da risciacquo in PBS per tre volte per 30 minuti, e incubate con DAPI (0,1 mg /ml, Sigma, St Louis, MO, USA) per 30 minuti come una macchia contatore nucleare. Sciacquati in PBS due volte, i tessuti erano spiegato in una diapositiva. Un confocale a scansione laser microscopio (Nikon, Giappone) è stato utilizzato per esaminare i tessuti immunolabeled. Al fine di includere tutti i livelli di cellule e dei processi colorate positivamente, l'impilamento Z ottimale delle immagini confocale è stato fissato a 5 micron intervalli.

L'apoptosi delle ICC sono stati rilevati con l'etichettatura TUNEL, un kit di rilevazione di apoptosi (Roche, Germania). Preparati tutto il montaggio sono state incubate con l'anticorpo primario c-kit (1:100, Santa Cruz, CA, USA) notte a 4 ° C e anticorpo secondario (Alexa Fluor 594 asino anti-IgG di capra, 1:100) a 37 ° C per 30 min. In una circostanza umidificata e buio, i tessuti sono state incubate con tampone TUNEL reazione (soluzione di etichettatura: soluzione enzimatica = 09:01) a 37 ° C per 1 h. Dopo lavate tre volte per 30 minuti per rimuovere scollegato fluoresceina-dUTP e incubate con DAPI come una macchia contatore nucleare, i campioni sono stati osservati al microscopio confocale a scansione laser.

microscopia elettronica

Dopo la mucosa rimosso, esemplari di dell'antro erano immersi in una soluzione fissante di glutaraldeide al 2,5% a 4 ° C per 2 h. Poi, sono state lavate con 0,1 M PBS due volte per 20 min, post-fissate in 1% OsO _{4 (pH 7,4) per 1 h, disidratati con alcool graduata, chiarito in ossido di propilene ed inclusi in Epon con stampi piatte. Le sezioni ultrasottili sono stati ottenuti con un ultramicrotomo (Leica ULTRACUTU, Germania), e colorate con citrato di piombo per 10 minuti prima di vedere con un microscopio elettronico a trasmissione ( ^{212, FEI, Paesi Bassi Tecnai G).}}

Analisi statistica

Per l'analisi immunofluorescenza, antro gastrico da ciascun animale sperimentale è stata campionata nella stessa posizione dello stomaco. ICC fu riconosciuto da c-kit immunoreattività e la presenza di processi cellulari abbondanti. Proliferazione e apoptosi ICC sono stati identificati da c-kit immunoreattività e Ki67 /TUNEL nucleo colorato che racchiude con strutture a membrana positivo c-kit. Dieci campi aleatori (× 200 ingrandimenti, 0,2607 millimetri ^{2) per la preparazione tutto il montaggio sono state prese per le fotografie di cellule positive c-kit, c-kit + /Ki67 + e cellule marcate c-kit + /+ TUNEL. Queste fotografie sono state utilizzate anche per valutare lo spessore degli strati in ogni pila con l'aiuto di nuclei DAPI etichettati come marcatore dei limiti superiore e inferiore degli strati. Il numero di cellule positive c-kit, le cellule doppio etichettati c-kit /Ki67 e c-kit /TUNEL sono stati contati con Immagine-ProPlus 5.0 (Media Cybernetics). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM. Almeno dieci visioni sono state prese in ogni animale. L'analisi della varianza (ANOVA) e t-test di Student sono stati usati per confrontare le differenze tra i diversi gruppi. valore di P inferiore a 0,05 è stato preso come differenza statisticamente significativa.}

Risultati

Il peso corporeo e della glicemia livello

Dopo 8 settimane, morte accidentale avvenuta nel gruppo DM (due ratti) e nel gruppo SEA (un topo). I ratti sono stati sottoposti a screening per lo stesso peso corporeo iniziale tra i gruppi (Tabella 1). Alla fine del 1, 4 e 8 settimane, il peso corporeo del gruppo DM era significativamente diminuito rispetto al controllo ( P
= 0.009, 0.000 e 0.000). Non vi era alcuna differenza significativa tra il gruppo SEA e DM ( P
> 0,05). Tuttavia, in contrasto con il gruppo DM, il peso corporeo è stata elevata nel gruppo LEA a 8 settimane ( P
< 0,001) e gruppo HEA a 4 e 8 settimane ( P
= 0.003, P
. < 0,001 separatamente)

Come mostrato nella tabella 2, non sono emerse differenze nel sangue di base di glucosio tra i gruppi di livello. I modelli diabetici sono stati stabiliti con successo con l'alto livello di glucosio nel gruppo DM rispetto al controllo alla fine del 1, 4 e 8 settimane (tutto P
< 0,001). Nel frattempo, i livelli di glucosio nel sangue nel mare, LEA e HEA gruppi non sono stati modificati in modo significativo rispetto al gruppo DM (tutti P
> 0,05).

Effetti di EA su svuotamento gastrico

Fig.1 mostrava gli effetti di EA a ST36 sullo svuotamento gastrico in diversi gruppi. La svuotamento gastrico del gruppo DM è stata notevolmente ritardata nel contrasto al controllo ( P
= 0,012). Rispetto al gruppo di DM, SEA ha avuto alcun effetto significativo sulla svuotamento gastrico ( P
= 0,338), ma LEA e HEA notevolmente accelerato il ritardato svuotamento gastrico da 43.96 ± 5.02% a 69.72 ± 3,02% e al 59.06 ± 3,70% ( P
< 0,001 e P
= 0,013, rispettivamente). Il confronto tra il gruppo LEA e HEA, la significatività statistica è stata ottenuta ( P
= 0,04), che rappresenta che l'effetto di LEA, ovviamente, ha superato quello di HEA.

Effetti della EA sull'espressione di c -KIT

Da Fig.2, l'espressione del c-kit in ogni strato della parete gastrica è stata valutata. In ICC-IM, c-kit nel gruppo DM era ovviamente diminuito rispetto al controllo (0,47 ± 0,04 vs 0,69 ± 0,05, P
= 0,001). Viceversa, LEA e HEA migliorata drasticamente l'espressione di c-kit rispetto al gruppo DM (0,65 ± 0,04 vs 0,47 ± 0,04, P
= 0,004; 0,66 ± 0,03 vs 0,47 ± 0,04, P
= 0,002, rispettivamente). In ICC-MY, l'espressione di c-kit è stato significativamente ridotto nel gruppo DM contrariamente al controllo (0,57 ± 0,04 vs 0,83 ± 0,05, P
< 0,001). Ma differenza significativa è stata raggiunta sia nel gruppo LEA e HEA rispetto al gruppo di DM (0,78 ± 0,05 vs 0,57 ± 0,04, P
= 0,002; 0,76 ± 0,04 & 0.57 ± 0.04, P
= 0,004, rispettivamente). In ICC-SM, il c-kit del gruppo DM evidentemente diminuita in base livello normale (0,56 ± 0,03 vs 0,77 ± 0,04, P
= 0,001). Coerentemente, LEA e HEA ovviamente aumentato l'espressione del c-kit rispetto al gruppo DM ( P
= 0,003 e P
= 0.007). Tuttavia, è stata trovata alcuna differenza significativa tra il gruppo SEA e DM in ICC-IM, ICC-MY e ICC-SM ( P
= 0,597, P
= 0,853 e P
= 0,172).

Effetti di EA sulle reti ICC

alternanze di reti ICC soprattutto ICC morfologia e densità sono state esposte in Fig.3. Non vi era alcuna differenza significativa dello spessore strati tra i gruppi. Associata con cellule muscolari lisce, c-kit immunoreattività per ICC-IM è stato osservato negli strati muscolari, dimostrando che ICC-IM aveva due processi polari che formano una rete cellulare nel gruppo di controllo. Nel gruppo DM, i lunghi processi di ICC-IM è stata compromessa in apparenza e la densità di c-kit cellulare positiva è stata ridotta a circa il 50% del controllo normale ( P
< 0,001). Rispetto al gruppo DM, nessun cambiamento significativo è stato osservato nel gruppo SEA. Tuttavia, una rete cellulare quasi intatto è stata visualizzata nel gruppo LEA e HEA e la densità di c-kit positive ICC-IM quasi ripristinato al livello normale (sia P
< 0,001, rispetto al gruppo DM ).

ICC-MY avvolgimento intorno alle plesso mioenterico si trovavano tra gli strati muscolari lisce longitudinali e circolari. ICC-MY multipolare con numerosi rami che formano una rete cellulare intatta erano chiaramente mostrato nel gruppo di controllo. Nel gruppo DM, le cellule c-kit + apparso con corpi cellulari sottili e processi fratturati, e la densità di ICC-MY è stato ovviamente diminuito ( P
< 0,001). Nel gruppo SEA, la densità di ICC-MY non sono stati significativamente modificati rispetto al gruppo DM ( P
= 0,762). Tuttavia, una rete cellulare quasi intatto esisteva attorno al plesso mioenterico e l'ICC-MY densità parzialmente recuperato nel gruppo LEA e HEA (sia P
< 0,001, rispetto al gruppo di DM)
<. h3> Effetti di EA su apoptosi delle ICC

L'apoptosi delle ICC è stata rilevata mediante l'etichettatura TUNEL per determinare se l'apoptosi è stata coinvolta in carenza di ICC nel diabete (Fig.4). Da preparati tutto il montaggio del controllo, alcuni nuclei di CPI sono stati colorati con il metodo TUNEL in strato muscolare, strato mioenterico e lo strato sottomucosa. Un sacco di c-kit + /TUNEL + ICC-IM, ICC-MY e ICC-SM sono stati osservati nel gruppo DM (18,48 ± 1,88 millimetri ^{-2, 26.51 ± 1,87 millimetri -2 e 12.03 ± 1,27 millimetri -2 rispettivamente). Il reti cellulari c-kit + erano incomplete e la Corte penale internazionale apoptotico presentati come processi abbreviati con un minor numero di rami. Un gran numero di c-kit cellule + /TUNEL + sono stati inondano anche in tutta strato di Gruppo SEA. Sotto l'attuazione di LEA e HEA, cellule apoptotiche + kit sono stati trovati in quasi ICC-IM (1,79 ± 0,33 millimetri -2 e 2,05 ± 0,30 millimetri -2), ICC-MY (2,24 ± 0,40 millimetri -2 e 2,48 ± 0,40 millimetri -2) e ICC-SM (1,09 ± 0,25 mm -2 e 1,39 ± 0,20 mm -2). Reti cellulari rivelati da c-kit immunoistochimica hanno dimostrato alta densità e spessore di processi cellulari nel gruppo LEA e HEA.}

Effetti di EA sulla proliferazione delle ICC

Considerando il maggior numero di ICC in LEA e il gruppo HEA, ICC Ki67-positivo è stato rilevato per rivelare la proliferazione di CCI nei tre strati (Fig.5). Nel gruppo di controllo, un certo numero di c-kit /Ki67 cellule doppio etichettati sono stati osservati in ICC-IM (8,82 ± 1,02 millimetri ^{-2), ICC-MY (10.64 ± 0,92 millimetri -2) e ICC -SM (4,67 ± 0,96 millimetri -2). Il numero di ICC con rami fratturate era notevolmente ridotta e le reti erano molto scarse, con poche cellule proliferanti sia nel gruppo DM e SEA. Tuttavia, nel gruppo LEA e HEA, c-kit /Ki67 cellule doppio etichettati in ICC-IM sono stati caratterizzati da enti strettamente adiacenti cellulari e processi relativamente bipolari e la densità media raggiunti a 18.37 ± 1,60 millimetri -2 e 15,27 ± 1.81 mm -2 (sia P
< 0,001). Allo stesso modo, abbondante c-kit + /Ki67 + ICC-MY nel gruppo LEA e HEA (sia P
< 0,001) formazione di reti intatti con c-kit + cellule eseguito un corpo cellulare rotondo e processi lunghi e sottili. In ICC-SM, accompagnato da una rete intatta ICC, la densità delle cellule proliferanti nel gruppo LEA e HEA erano relativamente più elevato in contrasto con il gruppo DM ( P
= 0,016 e P
= 0,003).}

Effetti di EA sulle alterazioni ultrastrutturali della ICC

caratteristiche ultrastrutturali tipiche dei CPI sono state rivelate dal microscopio elettronico a trasmissione (Fig.6). Nel gruppo di controllo, ICC-IM e ICC-MY ricchi organuli cellulari di ben sviluppati estesi processi lunghi contenenti mitocondri, e ruvido e liscio reticolo endoplasmatico. Polimorfico ICC-SM situata sulla superficie sottomucosa di strato muscolare circolare mostrato citoplasma elettrone-denso alto, numerosi mitocondri e reticolo endoplasmatico. Nel gruppo DM, una riduzione drammatica del numero di ICC con caratteristiche ultrastrutturali danneggiati è stata esaminata mediante microscopia elettronica. Queste cellule con mitocondri gonfio, cristaed perturbato e cromatina condensata mostrato membrana incompleta e accorciare i processi. Questi cambiamenti sono stati osservati anche nel gruppo SEA. Nel gruppo LEA e HEA, il numero di ICC era significativamente aumentato e collegato strettamente con fibre nervose e cellule muscolari lisce formano sinaptiche struttura e gap giunzioni. Cancella cresta mitocondri, ordinata distribuita reticolo endoplasmatico rugoso e particelle ribosomiale sono stati considerati come caratteristiche classiche di ICC-IM, IM-MY e ICC-SM.

Discussione

In questo studio, abbiamo ha scoperto che sia EA bassa ed alta frequenza al ST36 soppressa l'apoptosi delle CCI e attivato la proliferazione di CPI nello stomaco di ratti diabetici STZ-indotta. Come risultato, il salvataggio delle reti ICC è stato associato ad un effetto prevenire il ritardato svuotamento gastrico.

Come una procedura efficace con minori effetti collaterali, EA in combinazione con l'agopuntura e la corrente elettrica stimolazione invece di manipolazioni manuali viene gradualmente accettato dal Paesi occidentali. ST36 è uno dei punti più frequentemente utilizzato per trattare disturbi gastrointestinali, con le indicazioni tra cui: dolore epigastrico, nausea, vomito, scarso appetito e distensione addominale. Allo stesso tempo, il nostro studio precedente ha indicato EA a ST36 potrebbe aumentare il movimento propulsivo del colon, ma non osservata nel gruppo con EA a non agopunti. Ritardata svuotamento gastrico è un carattere comune dei pazienti diabetici con gastroparesi e anche uno dei principali fattori che contribuiscono a sintomi di gastroparesi. Nel corso degli ultimi decenni, gli esperimenti sui ratti coscienti hanno mostrato che EA a bassa frequenza (10 Hz) significativamente accelerato svuotamento gastrico [3], [24], [25]. Inoltre, 100 Hz EA era efficace per provocare il rilascio di dinorphin e serotonina per indurre analgesia [26]. Anche se è stato segnalato anche ad alta EA frequenza (100 Hz) per promuovere esofagea e distale motilità del colon negli animali [7], [8], gli effetti di 100 Hz EA sulla motilità gastrica sono scarsamente indagato. Così, i parametri (10 e 100 Hz) di EA sono stati selezionati secondo esperimenti preliminari che indicavano effetto stimolante della motilità gastrointestinale. I nostri risultati hanno dimostrato che sia EA bassa frequenza (10 Hz) e EA alta frequenza (100 Hz) a ST36 significativamente migliorati ritardato svuotamento gastrico nei ratti diabetici, e il risultato anche rivelato che l'effetto della bassa EA frequenza era più drammatico di quello di alta frequenza di EA.

Numerosi studi hanno dimostrato che CPI svolge un ruolo importante nella regolazione della peristalsi gastriche, un fattore determinante di svuotamento gastrico [27], [28]. Come ICC esiste in diversi strati di gastrico sotto forma di reti in vivo
, sono pregevolmente da considerarsi alterazioni di reti ICC. Riduzione del numero e morfologiche cambiamenti di ICC-MY e ICC-IM nello stomaco di topi diabetici sono state dimostrate in uno studio precedente [14]. Allo stesso modo, è stata osservata una marcata perdita di ICC-IM e ICC-SM in antro di ratti diabetici STZ-indotta, ma ICC-MY non è stata significativamente influenzata ad eccezione di una perdita di connessioni con le strutture nervose [15]. Queste differenze di risultati di questi due studi erano probabilmente associati con specie animali. Da uno studio di 28 pazienti con gastroparesi, un numero ridotto di ICC è stato trovato nel plesso mioenterico da biopsie antrali tutto spessore [29]. I nostri risultati hanno dimostrato che ICC-IM, ICC-MY e ICC-SM nel antro di ratti diabetici STZ indotto sono stati drasticamente ridotti basata sulla tecnica di western blotting e immunofluorescenza, e ulteriormente la struttura danneggiata della CPI è stato dimostrato mediante microscopia elettronica a trasmissione . Per fortuna, si segnala che a bassa frequenza EA migliora l'espressione della CCI in colon dei ratti transito costipazione lenti [17]. Inoltre, il nostro precedente studio ha suggerito che sia a bassa che ad alta frequenza EA ripristina l'espressione di ICC in due punti di ratti diabetici [18]. Tuttavia, in questi studi, investigano l'alterazione di ICC nel suo complesso e gli effetti di diversi EA frequenza su ICC nello stomaco non sono stati chiariti. Così, gli effetti di differenti EA frequenza su tre sottotipi di ICC nello stomaco tra cui ICC-IM, ICC-MY e ICC-SM sono stati al centro del presente studio. I nostri risultati hanno dimostrato che l'espressione di CCI nei tre strati sono stati vistosamente salvata da bassa ed alta frequenza EA, suggerendo che EA bassa ed alta frequenza rinnovato reti di ICC-IM, ICC-MY e ICC-SM e in seguito potrebbe contribuire a un recupero lo svuotamento gastrico.

è interessante notare che il saldo delle reti ICC è determinato principalmente per apoptosi e la proliferazione di ICC [11], [12]. Pertanto, il possibile meccanismo sulla motilità gastrica e gli effetti sulle reti ICC di EA a ST36 sono stati esplorati attraverso rilevare le alterazioni della proliferazione e l'apoptosi delle ICC. Di recente, la morte cellulare per apoptosi è segnalato per essere un processo continuo di reti ICC e il livello di apoptosi nelle colon sano indica che queste cellule devono essere continuamente rigenerate per mantenere intatte le reti [12]. Inoltre, i risultati di cavie adulte hanno indicato che intestinale ischemia e riperfusione ha portato alla riduzione del numero di CPI attraverso apoptosi che possono contribuire a disturbi della motilità gastrointestinale [30]. Inoltre, un recente rapporto ha mostrato che la terapia EA ha ridotto la percentuale di apoptosi delle cellule della sostanza nera nei ratti parkinsoniani [31]. Il presente studio ha chiaramente articolato che ICC apoptotico rilevato con metodi TUNEL erano inondazioni nelle reti ICC di stomaco ratti diabetici e ipotizzato che l'esaurimento delle reti ICC potrebbe anche portare a disturbi della motilità gastrica. Ma attraverso l'intervento di stimolazione EA bassa ed alta frequenza, TUNEL + nucleo erano difficilmente da trovare, suggerendo l'apoptosi delle ICC sono stati ridotti a un livello basso come normale.

La proliferazione è anche un altro regolatore principale per mantenere le reti di ICC. risultati precedenti hanno dimostrato che la proliferazione è stato coinvolto nel recupero di CPI, una volta che è stato perso in animali adulti [32], [33].

• PLoS ONE: auto-riferito disturbi di stomaco a viaggiatori in crociera-Based e terrestri pacchetto Holidays
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