PLoS ONE: nicotina attenua l'attivazione del tessuto residente macrofagi nello stomaco attraverso il mouse β2 nicotinico acetilcolina Receptor

Estratto

Sfondo

La via anti-infiammatoria colinergica è un meccanismo mediante il quale il endogena sistema nervoso autonomo attenua l'attivazione dei macrofagi attraverso i recettori nicotinici (nAChR). Questo concetto non è stato tuttavia dimostrato a livello cellulare nel tessuto intatto. A tal fine, abbiamo studiato l'effetto della nicotina sulla attivazione dei macrofagi residenti in un preparato stomaco del mouse per mezzo di immagini del calcio.

Metodi

transienti di calcio ([Ca ^{2 +] _{i) in macrofagi residenti sono state registrate in un preparato del mouse stomaco contenente plesso mioenterico e strati muscolari da Fluo-4. L'attivazione dei macrofagi è stata ottenuta mediante somministrazione di soffio focale di ATP. Gli effetti della nicotina sulla attivazione dei macrofagi sono stati valutati e il nAChR coinvolti è stato caratterizzato farmacologicamente. La vicinanza di nervi colinergici a macrofagi è stata quantificata mediante microscopia confocale. L'espressione di β2 e α7 nAChR è stata valutata mediante β2 immunoistochimica e fluoroforo-tagged α-bungarotoxin}}

Risultati

Nel 83% dei macrofagi fibre nervose colinergica varicose sono stati rilevati a distanze. ≪ 900nm. L'ATP indotta [Ca ^{2 +] _{i aumentare in modo significativo è stato inibito nel 65% o il 55% dei macrofagi rispettivamente 100μM o 10 micron nicotina,. Questo effetto inibitorio è stato invertito il nAChR β2 preferendo antagonista diidro-β-eryhtroidine ma non da esametonio (non selettivo nAChR-antagonista), mecamylamine (α3β4 nAChR-preferendo antagonista), α-bungarotoxin o methyllycaconitine (entrambi α7 antagonista nAChR-preferendo ). I macrofagi nello stomaco esprimono β2 ma non α7 nAChR a livello di proteine, mentre quelli a livello intestinale esprimono entrambe le subunità del recettore.}}

Conclusione

Questo studio è il primo in
situ
dimostrazione di una inibizione di attivazione dei macrofagi da nicotina suggerendo segnalazione funzionale tra i neuroni colinergici e macrofagi nello stomaco. I dati suggeriscono che la subunità β2 del nAChR è criticamente coinvolta nell'inibizione nicotina indotta di questi macrofagi residenti

Visto:. Némethová A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) nicotina attenua l'attivazione del tessuto residenti macrofagi nello stomaco del mouse attraverso la β2 nicotinico acetilcolina recettore. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

Editor: Yvette Tache, Università della California, Los Angeles, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 10 giugno 2013; Accettato: 26 settembre 2013; Pubblicato: November 1, 2013

Copyright: © 2013 Némethová et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta da una sovvenzione del 7 ° Programma quadro dell'Unione europea (il termine ipodd), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 a MS; da una sovvenzione della ricerca Fiandre Foundation (FWO, Odysseus e il programma di Ercole) a GEB, e da un post-dottorato FWO borsa di ricerca per PJG. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Nel 2000, Tracey e colleghi hanno dimostrato che la stimolazione elettrica del nervo vago fornisce un potente d'ingresso anti-infiammatori alla milza. In un modello murino di sepsi, stimolazione del nervo vago (VNS) ha comportato la riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie, un effetto che dipende sui recettori nicotinici dell'acetilcolina α7 (nAChR) [1,2]. Questa cosiddetta "via anti-infiammatoria colinergica" (CAIP) opera attraverso i nervi splenici adrenergici rendendo contatti sinaptici-like con b2 adrenergici milza cellule T del recettore che esprimono. rilascio successivo di acetilcolina (ACH) da queste cellule T è responsabile per l'effetto anti-infiammatorio presumibilmente interagendo con macrofagi α7nAChR esprimono [1,2].

Nel 2005, abbiamo dimostrato che il CAIP anche modula il sistema immunitario intestinale. In un modello murino di ileo post-operatorio, abbiamo dimostrato che VNS ridotto intestinale infiammazione indotta manipolazione del piccolo intestino, un effetto benefico dipendente α7 nAChR ma indipendente della milza [3,4]. Questi dati suggeriscono che il sistema immunitario intestinale è piuttosto direttamente modulata da terminazioni nervose vagali e /o neuroni enterici. Come macrofagi intestinali residenti sono gli attori principali scatenanti questa risposta infiammatoria [5], queste cellule rappresentano l'obiettivo più probabile del CAIP. Studi in vitro con isolati macrofagi peritoneali, macrofagi derivati ​​dalle cellule mononucleate del sangue periferico o linee cellulari di macrofagi hanno infatti abbondantemente dimostrato che l'acetilcolina e la nicotina riducono la produzione di citochine [1-3,6,7] e aumentare la fagocitosi [6]. Tuttavia, resta discutibile quale misura il loro fenotipo assomiglia molto quella dei macrofagi residenti colpiti dai neuroni enterici, soprattutto come espressione del recettore nei macrofagi può essere sovra o sotto-regolato come sono stati isolati dal loro ambiente naturale. Pertanto, abbiamo deciso di sviluppare una tecnica che avrebbe permesso di studiare l'effetto della nicotina sulla attivazione dei macrofagi residenti nel loro ambiente naturale. Come macrofagi attivati ​​da ATP, un segnale di pericolo ben noto per le cellule immunitarie [8,9], rivelano un aumento intracellulare Ca ^{2 +, vivere Ca 2 + di imaging è stato scelto per studiare i macrofagi residenti in intatto piatta foglio preparativi del mouse stomaco. Questo ci ha permesso di confrontare ATP evocato Ca 2 + transitori ([Ca 2 +] _{i) in macrofagi situati negli strati muscolari lisce, prima e dopo l'applicazione di nicotina. Abbiamo ulteriormente utilizzati diversi antagonisti con preferenze noti per specifici subunità nAChR al fine di fornire ulteriori approfondimenti meccanicistici in ruoli di recettore della nicotina che esprimono i macrofagi per il CAIP nell'intestino. Questi risultati sono stati confermati da farmacologiche immunoistochimica. Infine, abbiamo analizzato la percentuale di macrofagi residenti che sono in prossimità delle fibre nervose colinergiche.}}

Metodi

Etica Dichiarazione

Tutto il lavoro del mouse è stato condotto secondo le linee guida tedesche per la cura e benessere degli animali (Deutsches Tierschutzgesetz) e approvato dal comitato etico dello stato bavarese (Regierung Oberbayern, che serve come il Comitato istituzionale cura e l'uso per la Technische Universität München) in base al § 4 e §11 Deutsches Tierschutzgesetz con il numero di riferimento 32 -568-2.

I campioni di tessuto

Male 12-16 settimane di età topi C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Germania) sono stati uccisi da dislocazione cervicale. Lo stomaco è stato raccolto in un tampone Krebs ghiacciata contenente (in mm) 117 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O e 11 glucosio e portato a pH 7.4. Lo stomaco è stato aperto lungo la grande curvatura e lavato con ghiacciata Krebs. Sotto controllo microscopico, lo stomaco è stato immobilizzato su un piatto sylgard e mucosa e sottomucosa stati accuratamente rimosso. Durante la dissezione, il tessuto è stato continuamente perfuso con soluzione di Krebs ghiacciata per assicurare la vitalità del tessuto. Solo l'anteriore o posteriore della metà dello stomaco è stato bloccato su un piccolo anello Sylgard con un'apertura centrale di 100 x 200 mm ^2.}

Calcio Imaging

preparati ventre piatto foglio di topo erano incubate in soluzione di Krebs modificato (117 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 h 2O e 11 glucosio) contenente 30 mM dell'indicatore di calcio fluorescenti Fluo 4-acetossimetil (AM) (Invitrogen) e 1,25 mM probenecid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania) per 2 ore a temperatura ambiente al buio e gasati con CarboGen (95% O 2 - 5% di CO 2). L'anello sylgard stato montato nella camera di registrazione con il lato sierosa dello stomaco verso il fondo della camera. La camera è stata collegata al sistema di perfusione per consentire perfusione continua con soluzione di Krebs-CarboGen gasati a temperatura ambiente. Un periodo di wash-out di 1,5 h è stato permesso prima dell'inizio dell'esperimento. La camera di tessuto è stato montato su un microscopio invertito epifluorescenza (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Germania) dotato di una fotocamera ad alta velocità in bianco e nero (Zeiss AxioCam HSM) e software (Zeiss Axio Vision 4.8) per l'acquisizione e l'analisi. Fluo-4 è stato eccitato con una luce blu diodo ad emissione luminosa (LED) Luxeon III (3W, 470nm lunghezza d'onda dominante, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Germania) e Fluo-4 segnali sono stati rilevati con un cubo di filtro F26-514 brillante Linea FITC BP (eccitazione: HC475 /35, dicroiche: 499, di emissione: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tubinga, Germania) con obiettivo X20 (A-Plan, NA = 0.25, Zeiss). Il sistema di misurazione variazioni relative a fluorescenza (Δ F /F) di Fluo-4 monitoraggio dei cambiamenti del calcio intracellulare ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + sono stati registrati i transitori di partenza 3 s prima della somministrazione locale di ATP per un totale di 14,5 s, con un frame rate di 2 Hz e tempo di esposizione di 200 ms.}}

Abbiamo usato ATP come strumento per l'attivazione dei macrofagi poiché è un segnale di pericolo rilasciato localmente al sito di infiammazione [8,9] e poiché ATP è nota per indurre la secrezione di citochine dai macrofagi tramite aumento della [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) e la nicotina (Sigma-Aldrich) sono stati localmente applicate da espulsione pressione da due micropipette con durate di 200 ms e 10 sec, rispettivamente. La posizione delle micropipette garantito che i volumi espulsi coperti regioni di tessuto identici. Le micropipette sono stati riempiti con 1 mM ATP e 100 pM o 10 pM nicotina disciolto in soluzione Krebs contenente 1,25 mM probenecid. Secondo curve di calibrazione precedentemente pubblicati, si stima che qualsiasi sostanza applicata dagli impulsi espulsione pressione sarà diluito di circa 01:10 una volta raggiunta il tessuto [13].

somministrazione locale di misura ATP e nicotina permesso di risposte in più regioni (tipicamente 4-5) nello stesso tessuto. La posizione delle regioni del tessuto è stato documentato utilizzando il sistema di coordinate visualizzato sul palco microscopio mobile. L'effetto della nicotina sulla ATP indotta transienti di calcio sono stati studiato di nuovo nelle stesse regioni dopo aggiunta di vari antagonisti nAChR. Dopo la registrazione delle risposte, macrofagi sono stati visualizzati mediante incubazione vitale del tessuto con allophycocyanin (APC) -marcato di ratto anti-topo anti-F4 /80 anticorpo (1: 250, eBioscience, Francoforte, Germania) per 1 ora, a temperatura ambiente in al buio e gasati con CarboGen. Il tessuto è stato lavato per 15 minuti. Il palco microscopio è stato riposizionato per trovare le regioni in cui abbiamo registrato da. Immagini di macrofagi etichettati sono stati acquisiti utilizzando rosso Z-LED P4 (3,5 W) sorgente di eccitazione (625 nm di lunghezza d'onda dominante, Seoul Semiconductor) e filtro cubo F46-006 set di filtri ET (eccitazione: ET 620/60, dicroiche: 660, di emissione: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tubinga, Germania). La sovrapposizione di Fluo-4 segnali e immagini della F4 /80 macrofagi positivo ci ha permesso di analizzare le risposte nei singoli macrofagi.

L'immunoistochimica

Per tessuto etichetta macrofagi residenti, in primo luogo abbiamo usato l'etichettatura vitale protocollo descritto sopra. Il tessuto è stato poi fissato notte a temperatura ambiente in una soluzione contenente 4% formaldeide e acido picrico 0,2% in tampone fosfato 0,1 M, lavato 3 X 10 minuti in tampone fosfato ed infine incubate per 1 h in una soluzione contenente 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, siero di cavallo 4% sciolto in PBS (tutti da Sigma-Aldrich). Per etichettare varicosità colinergici, il tessuto è stato incubato durante la notte nella soluzione bloccante contenente capra anti-trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Germania). I tessuti sono stati lavati 3 X 10 min in PBS e incubate per 1,5 - 2 h in soluzione bloccante contenente Cy3-marcato anticorpo anti-capra (1: 500; Dianova, Amburgo, Germania). I tessuti sono stati lavati 3 x 10 minuti in PBS e montati in sostanza anti-sbiadimento (20% PBS /NaN 3, 80% glicerolo) su poli-L-lisina rivestite con vetrini coprioggetto e per la visualizzazione.}

per etichettare β2 nAChR nei macrofagi del tessuto residenti, gastrici preparati montaggio interi senza mucosa da wild-type e beta2 nAChR knock-out [14] topi sono stati fissati per 10 min in ghiaccio freddo soluzione PBS contenente 4% paraformaldeide (PFA) . I tessuti sono stati poi lavati 2 x 10 minuti in PBS e incubate per 2 h in PBS contenente 1% senza proteasi albumina bovina frazione V di albumina (BSA, Serva, Heidelberg, Germania) e il 10% di siero normale asino (NDS, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). I tessuti sono state incubate per 36 h con PBS contenente 1% di BSA, 5% NDS, ratto anti-topo F4 /80 (1: 500; clone BM8, BioLegend, San Diego, USA) e il coniglio anti-topo β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germania). I tessuti sono stati lavati 3 x 10 minuti in PBS e incubate per 1 h in PBS contenente 1% di BSA, 5% NDS, capra Alexa Fluor® 647 marcato anticorpo anti-topo (1: 1.000, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, Stati Uniti d'America) e Cy3 marcato asino anticorpi anti-coniglio (1: 1.000; Chemicon, Millipore, Billerica, Stati Uniti d'America). I tessuti sono stati lavati 3 x 10 minuti in PBS e montati in slow-dissolvenza reagente (Invitrogen, tecnologie della vita, Gent, Belgio) su guide poli-L-lisina rivestite coprioggetto e per viewing.To etichetta α7nAChR nei macrofagi del tessuto residenti, un piece dello stomaco mouse e ileo sono stati sottoposti a etichettatura vitale con Cy5 marcato α-bungarotossina (Invitrogen) a 0.1 mg /ml in RPMI 1640 medium (Lonza, Basilea, Svizzera) a 4 ° C per 15 min [4]. I tessuti sono stati poi fissati in PBS contenente 4% PFA. La mucosa e sottomucosa sono stati rimossi ed i tessuti sono stati incubati per 2 ore in una soluzione bloccante contenente 1% BSA. I tessuti sono stati poi incubate per 60 h in una soluzione bloccante contenente ratto anti-topo F4 /80 (clone BM8, BioLegend), seguito da 3 X 10 min lavaggi in PBS e incubate per 1 h in PBS contenente 1% BSA e Cy3 marcato anticorpo anti-topo (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Infine, i tessuti sono stati lavati 3 x 10 minuti in PBS e montati in sostanza lenta dissolvenza su vetrini poli-L-lisina rivestite coprioggetto e per la visualizzazione.

microscopia confocale e analisi di immagine

Le immagini sono state acquisite utilizzando un LSM 510 (Carl Zeiss) microscopio confocale con Plan-Neofluar x40 /1,3 olio DIC e Piano Apochromat X63 /1.4 obiettivi Oil DIC. lunghezze d'onda del laser di 543 nm e 633 nm sono stati utilizzati per l'eccitazione delle fluorofori Cy3 e rispettivamente APC o Cy5. segnali Cy3 e Cy5 APC o sono stati rilevati utilizzando il filtro imposta BP 565-615 IR e BP 650-710 IR, rispettivamente.

pile di immagini per l'analisi quantitativa con l'obiettivo x63 sono stati sottoposti a scansione con una risoluzione di 1024 XY × 1024 che copriva una superficie di 95,5 × 95,5 micron ^{2. Le prime e ultime fette ottici sono stati prelevati nella parte superiore e inferiore della superficie esterna di un macrofago. La profondità ottica di ogni fetta era a 900 nm. Due fette consecutivi sovrapposti per 500 nm. Di solito, tra il 9 e 16 fette sono stati generati con conseguente una profondità di scansione di 3.2-6.0 micron contenenti tra 1-3 macrofagi e VAChT fibre positive macrofagi di attraversamento. Stacks Image sono stati analizzati utilizzando Immagine J Pro.}

Immagini di b2 e α7 macrofagi nAChR marcato sono state scattate con l'obiettivo x63 e scansionati con una risoluzione di 1024 XY × 1024 che copriva una superficie di 95,5 × 95,5 micron ^{2. La profondità ottica delle immagini era a 900 nm.}

Farmacologia

Per bloccare l'azione potenziale propagazione nei neuroni, tetrodotossina (Biotrend, Köln, Germania) è stato aggiunto alla soluzione Krebs perfusione a 1 micron. Per caratterizzazione farmacologica, le seguenti bloccanti nicotinico sono stati aggiunti alla soluzione di Krebs perfusione del tessuto: 200 mM esametonio (Sigma-Aldrich), 100 mM mecamylamine (Sigma-Aldrich), 10 pM diidro-β-erythroidine (DHBE; Sigma-Aldrich) , e 100 nm, 3 micron e 10 micron α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) e 10 nm e 100 nM methyllycaconitine (MLA, Tocris). Esametonio, mecamylamine e DHBE sono stati testati in concentrazioni che sono stati in grado di abolire nicotinici veloci potenziale postsinaptico eccitatorio nella cavia neuroni mienterici [15] .Il uso di 10 Nm e 100 nM MLA si basa sulla concentrazione, rispettivamente, utilizzato per bloccare subunità α7 contenente nAChR [16] e utilizzato per inibire la secrezione di IL-6 da isolate macrofagi peritoneali [3].

L'analisi dei dati e le statistiche

I cambiamenti relativi massimi a fluorescenza (Δ F /F) in risposta a la somministrazione di ATP è stata espressa come% di aumento sopra fluorescenza basale prima della somministrazione di ATP. Le analisi statistiche sono state effettuate con Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Germania). I dati sono presentati come whisker con la mediana e il 25 ^{th e 75 th percentili nonché il 10 th e 90 th percentili. Non dati appaiati normalmente distribuiti sono stati analizzati con il Wilcoxon rank test. Le differenze sono state considerate statisticamente significative a P
< 0.05. N
numeri indicati tra parentesi indicano il numero di macrofagi /tessuti studiati, cioè un risultato sulla base di registrazioni di 20 macrofagi in 5 tessuti (pari a 5 animali) è presentato come (20/5).}

Risultati

relazione spaziale tra macrofagi tessuto residenti e varicosità colinergici nel topo stomaco

Abbiamo usato microscopia confocale per valutare la vicinanza tra macrofagi /80-positivi F4 e fibre nervose colinergiche varicose VAChT-positivi nello stomaco mouse (Figura 1A). L'analisi dettagliata ha rivelato che l'83% dei 41 macrofagi studiati si trovano all'interno di 900 nm ad almeno un varicose fibra nervosa colinergica (Figura 1B-C).

riproducibilità di ATP evocato [Ca ^{2 +] _{i segnali nel tessuto residenti macrofagi}}

Microejection di ATP ha indotto una forte, rapida insorgenza [Ca ^{2 +] _{i transitori nei macrofagi che ha raggiunto il suo picco 8-10 secondi dopo l'applicazione seguiti da un lento ritorno alla linea di base [Ca 2 +] i livelli (Figura 2A e Movie S1). Poiché non vi era sempre pieno recupero ai livelli basali durante il periodo di registrazione, la massima [Ca 2 +] i segnale era utilizzata per l'analisi di tutti gli esperimenti. N tachifilassi stata osservata poiché l'ampiezza massima di [Ca 2 +] i segnale in risposta ad una seconda somministrazione ATP, 10 minuti dopo la prima, non differisce dalla risposta massima iniziale (Figura 2B).}}

effetto della nicotina sulla [Ca ^{2 +] _{i segnali nel tessuto residenti macrofagi}}

Per studiare l'effetto della nicotina sulla ATP evocato [Ca ^{2 +] _{i segnali che microejected nicotina per 10 sec e immediatamente riapplicate ATP sulla stessa regione. Un razionale per usare nicotina come selettivo, non degradata nAChR agonisti è stato quello di imitare l'attivazione del recettore nicotinico per rilascio di acetilcolina dai neuroni colinergici. Analizzando le variazioni di [Ca 2 +] i in tutti i macrofagi ha rivelato che la nicotina ha ridotto significativamente l'ATP evocata [Ca 2 +] i segnali (Figura 2D e F). Un'analisi più dettagliata degli effetti della nicotina sul ATP indotta [Ca 2 +] i transitori rivelato tre popolazioni di macrofagi (Figura 2D-G). La nicotina a 10 e 100 micron attenuato l'ATP-evocato [Ca 2 +] i segnali nel 55% e il 65% dei macrofagi, rispettivamente. Il [Ca 2 +] i segnale è rimasto invariato a 36% e il 28% dei macrofagi dopo l'applicazione di 10 micron e 100 micron nicotina, rispettivamente. In un piccolo sottoinsieme, 10 micron e 100 micron nicotina potenzia l'ATP-evocato [Ca 2 +] i RISPOSTA (9% e il 7% dei macrofagi, rispettivamente).}}

Per evitare qualsiasi pregiudizi ulteriori analisi si basa sugli effetti della nicotina su tutti i macrofagi indipendenti dal fatto che l'ATP indotta [Ca ^{2 +] _{i segnale è stato diminuito, aumentata o invariata.}}

il ruolo dei neuroni nel nicotinico evocata attenuazione di attivazione dei macrofagi

la nicotina attiva direttamente i neuroni enterici e abbiamo affrontato la possibilità che l'attivazione del primo da parte dei neuroni mienterici contribuito alla attenuato [Ca ^{2 +] _{i risposte in macrofagi. Non abbiamo trovato alcuna prova di un percorso inibitorio tale indiretto perché l'attenuazione del ATP-evocato [Ca 2 +] segnalo dalla nicotina rimasto in presenza di tetrodotossina (Figura 2C). È interessante notare, tuttavia, che la percentuale di quei macrofagi in cui la nicotina non ha alterato ATP evocata [Ca 2 +] i segnali sono stati drasticamente ridotti (28% contro 6%). Allo stesso tempo, macrofagi in cui la nicotina inibita o potenziato ATP evocati [Ca 2 +] i segnali aumentati dal 65% al ​​71% e dal 7% al 23%, rispettivamente.}}

caratterizzazione farmacologica dell'effetto inibitorio della nicotina sulla tissutali residenti macrofagi

l'attivazione dei macrofagi di ATP e l'inibizione della risposta ATP 100 mM nicotina è stata affidabile registrati in ciascuno dei 21 preparazioni illustrate in Figura 2F. Questo ci ha permesso di effettuare studi antagonisti senza la necessità di ristudiare la risposta inibitoria nei macrofagi trattati con gli antagonisti. Inoltre, abbiamo quindi ridotto il numero di periodi di registrazione ad un livello che non ha compromesso la potenza del segnale e le risposte ATP riproducibili garantiti. Per studiare i nAChR subunità coinvolti nella effetto inibitorio della nicotina, abbiamo testato cinque diversi bloccanti con preferenze subunità noti [17] (Figura 3). L'effetto inibitorio della nicotina sul ATP-evocati [Ca ^{2 +] _{i risposte è rimasto invariato in presenza del gangliare non selettivo nAChR antagonisti esametonio, i α3β4 nAChR-preferendo antagonista mecamilamina o α7 nAChR-preferendo antagonisti α-bungarotossina e methyllycaconitine (Figura 3A). Tuttavia, la β2-nAChR preferendo antagonista di-idro-β-eryhtroidine invertito l'effetto inibitorio della nicotina sul ATP-evocato [Ca 2 +] i risposte in macrofagi (Figura 3B).}}

Anche se abbiamo usato ABGT a concentrazioni che sono stati descritti per bloccare in modo affidabile α7 nAChR nei neuroni e isolate macrofagi alveolari [18], eravamo preoccupati che possa essere in grado di antagonizzare l'effetto inibitorio della nicotina a causa della concorrenza sfavorevole nel sito di legame. Tuttavia, questo sembra improbabile perché anche a concentrazioni di 3 mM e 10 mM ABGT non era in grado di invertire l'effetto inibitorio della nicotina sulla ATP evocata [Ca ^{2 +] _{i risposte (Figura 3A). ABGT non ha anche invertire l'attenuazione evocata da 10 micron nicotina (Figura 3C).}}

Etichettatura dei β2 ma non α7 nAChR nel tessuto residenti macrofagi

Per fornire ulteriori elementi di prova per il coinvolgimento di β2 nAChR, ma non di α7 nAChR nella effetto inibitorio della nicotina sul ATP-evocato [Ca ^{2 +] sono stati eseguiti _{i risposte, etichettatura immunoistochimica di b2 nAChR ed etichettatura vitale di α7 nAChR da ABGT nei macrofagi residenti muscolare dello stomaco (Figura 4). La maggior parte dei macrofagi residenti muscolare dello stomaco sono stati b2 nAChR-immunoreattiva (Figura 4A) sostenendo l'effetto antagonista osservato di DHBE sull'inibizione nicotinico delle risposte ATP. L'anticorpo utilizzato per la beta2 nAChR è specifico a causa della mancanza di beta2 nAChR immunoreattività in un β2 knockout topo nAChR (Figura 4B).}}

etichettatura Vital di α7 nAChR da ABGT ha rivelato l'assenza di α7 nAChR nei macrofagi del tessuto residenti stomaco mouse (Figura 4C), al contrario, macrofagi intestinali sono stati etichettati da ABGT (Figura 4D). La mancanza di α7 nAChR nei macrofagi residenti stomaco muscolare confermato l'assenza di antagonismo di α7 nAChR-preferendo bloccanti ABGT e MLA su l'effetto inibitorio della nicotina sul ATP evocato [Ca ^{2 +] _{i risposte in queste cellule.}}

Discussione

Ad oggi, l'effetto della nicotina è stato studiato solo in macrofagi isolati o linee cellulari di macrofagi. Qui abbiamo sviluppato un in vitro
modello di topo stomaco preparazione del plesso muscolo-mioenterico per studiare l'effetto della nicotina sui macrofagi tessuto residenti all'interno del loro ambiente naturale. Questo studio è quindi il primo a dimostrare che la nicotina inibisce direttamente attivazione dei macrofagi del tessuto residenti attraverso subunità β2 contenente nAChR e, quindi, fornisce la base per la segnalazione funzionale tra i neuroni colinergici e macrofagi nell'intestino. La nostra conclusione è supportata da diverse linee di prove. In primo luogo, ATP evocato [Ca ^{2 +] _{i transienti in macrofagi è significativamente ridotto di nicotina anche in presenza del tetrodotossina nervi bloccante. In secondo luogo, l'attenuazione nicotina indotto risposte ATP nei macrofagi è stata invertita DHBE, ma non da esametonio, mecamilamina, ABGT o MLA. I risultati farmacologici sono stati sostenuti dalla dimostrazione di b2-positiv ma ABGT-negativi subunità nAChR sui macrofagi gastrici. In terzo luogo, la maggior parte dei macrofagi erano nelle immediate vicinanze delle fibre nervose colinergiche varicose. Simile prossimità dei macrofagi a fibre nervose è stata osservata nei ratti muscolare intestinale [3].}}

Il nostro criterio utilizzato per definire la vicinanza tra i macrofagi e le fibre nervose colinergiche (900 nm a distanza) è d'accordo con il concetto di comunicazione extrasinaptica . Secondo questo concetto un volume transmission basato diffusione può verificarsi a 100 nm per distanze micron tra la sorgente e la destinazione [19]. Partiamo dal presupposto che la maggior parte, se non tutti, i nervi colinergici nelle immediate vicinanze di macrofagi originati da corpi cellulari neuronali mienterici sulla base della nostra precedente osservazione che le fibre vagali non contattare macrofagi residenti intestinali [3], questo è supportato anche dai risultati che vagale gastrica fibre efferenti quasi esclusivamente terminano nei gangli enterici [20], dove attivano la maggior parte dei neuroni mienterici attraverso i recettori nicotinici [15].

Il CAIP rappresenta un sistema fisiologico per controllare l'attivazione dei macrofagi in condizioni infiammatorie. E 'stato dimostrato l'effetto anti-infiammatorio di attivazione CAIP in vivo
da stimolazione del nervo vagale in modelli murini di sepsi e ileo postoperatorio [2,3] e in vitro
dalla somministrazione di nicotina a sezionato , lipopolisaccaridi macrofagi -stimulated [1-4,21]. Nel presente studio, abbiamo scoperto che la nicotina ha ridotto l'aumento di ATP indotta intracellulare Ca ^{2 + nei macrofagi residenti nello stomaco. È interessante notare che questo effetto è stata invertita dalla β2 nAChR subunità preferendo antagonista DHBE suggerendo il coinvolgimento di questa subunità nella modulazione nicotina-mediata dei macrofagi residenti. Questa osservazione è coerente con la nostra precedente constatazione che DHBE invertito l'inibizione nicotina indotta del fattore di necrosi tumorale-α rilascio (TNF-α) e aumento della fagocitosi in macrofagi peritoneali isolati [6]. In linea, la produzione di citochine di cellule di neuroblastoma umano stabilmente trasfettate con α4β2 nAChR è significativamente ridotta dal pretrattamento nicotina [22]. Anche se questi dati suggeriscono che α4β2 nAChR possono mediare l'effetto della nicotina in aumento ATP indotta in intracellulare Ca 2 +, recenti evidenze indicano che subunità beta2 possono anche montare con altre subunità alfa, compreso subunità α7. Una recente pubblicazione di discutere le proprietà elettrofisiologiche di α7β2 nAChR espressi in linee cellulari epiteliali umane, ha dimostrato che basse concentrazioni di DHBE antagonizzata α7β2 nAChR ma non α7 nAChR [16]. Questi e altri dati sul profilo farmacologico di DHBE suggerirebbero che DHBE è un antagonista altamente selettivo dei beta2 nAChR, ma non discrimina in modo affidabile tra i vari gruppi di α3, α4 o α7 con β2. Tuttavia, il nostro immunoistochimica ed etichettatura vitale dei macrofagi residenti gastrici non sarebbero favorevoli coinvolgimento di α7 nAChR perché macrofagi gastrici non sono stati etichettati da ABGT ma hanno espresso la β2 subunità nAChR.}

Tuttavia, optiamo per un'interpretazione piuttosto conservatore dei nostri dati e concludere che nAChR β2 sono criticamente coinvolta nell'inibizione della nicotina di attività dei macrofagi anche se è probabile che alla concentrazione utilizzata nel nostro studio DHBE preferibilmente blocchi α4β2 nAChR. La nostra preparazione è ideale per affrontare in studi futuri il possibile contributo di α7β2 nAChR studiando l'effetto della nicotina nei macrofagi del tessuto residenti da α7 nAChR, b2 nAChR e α7β2 nAChR doppio topi knock-out. strategie simili dovrebbero essere utilizzati per studiare il significato di un α4β2 nAChR.

E 'importante notare che l'azione antagonista di DHBE non è selettivo per i macrofagi come DHBE, come esametonio e mecamylamine, blocca anche sinapsi nicotinici a gastrico neuroni mienterici [15]. Tuttavia, i recettori nicotinici sui macrofagi devono possedere proprietà diverse rispetto a quelle nei neuroni enterici poiché né esametonio né mecamylamine invertite la nicotina indotta attenuazione delle risposte ATP-evocate in macrofagi. Esametonio e mecamylamine esercitano le loro azioni intasamento il poro del canale nicotinico [23-25]. La loro incapacità di invertire l'inibizione di nicotina di macrofagi può suggerire l'esistenza di un nAChR atipica nei macrofagi. Infatti, la registrazione di Ca ^{2 + transitori in risposta alla somministrazione di nicotina rivelato un aumento [Ca 2 +] _{i solo nel 13% dei macrofagi (6 su 45 macrofagi, dati non riportati). Questa popolazione è molto più piccola che la percentuale di macrofagi in cui la nicotina modulata ATP evocata [Ca 2 +] i.}}

Abbondanti prove suggeriscono che α7 nAChR gioca un ruolo cruciale nella riduzione di nicotina indotta la produzione di citochine macrofagi [2,3,6,26]. In precedenza, abbiamo infatti dimostrato che la nicotina non è riuscito a ridurre la produzione di TNF-α nei macrofagi peritoneali di topi α7 nAChR knockout [6], mentre l'effetto anti-infiammatorio nel piccolo intestino di stimolazione del nervo vago nel nostro modello di ileo postoperatorio si perde in questi KO [4]. Nel presente studio, tuttavia, l'effetto della nicotina sulla attivazione dei macrofagi ATP indotta non è stato bloccato dalla nAChR α7 preferendo bloccanti ABGT e MLA, sostenendo contro il coinvolgimento di nAChR α7. Ciò è ulteriormente supportata dalla mancanza di etichettatura di stomaco muscolare macrofagi di α7 nAChR-preferendo α-bungarotoxin. Nell'intestino, però, abbiamo fatto osservare α-bungarotoxin macrofagi etichettati muscolare positivi [4 e questo studio], indicando le differenze regionali specifici nel fenotipo di queste cellule immunitarie.

Nonostante l'apparente mancanza di ABGT sensibili α7 nAChR nel nostro studio appare in contraddizione con i nostri risultati precedenti, siamo abbastanza sicuri che questi dati non sono a causa della incapacità di ABGT di competere per il sito di legame, come la stessa concentrazione utilizzata nei nostri blocchi di studio neuronale α7 nAChR nel cervello e nel isolati macrofagi alveolari [18].

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