PLOS NËMMEN: Chitinase mRNA Niveauen vun Chemeschen Hinnen alleguer deenen Single Standard DNA: dono Mammalian Chitinase Ass engem Major ët an der Mouse Stomach

Wat VerfÜgung

Chitinases der β-1-4 glycosidic Obligatiounen vun chitin hydrolyze, engem gréisser strukturell Komponent vun Holz liewen, crustaceans an Insekten. Obwuel Mamendéieren, net chitin oder seng synthase produzéiere auszedrécken si zwee aktiv chitinases, chitotriosidase (Chit1) an dono mammalian chitinase (AMCase). Dës mammalian chitinases hunn bedeitend Opmierksamkeet ugezunn, wéinst hirer fräi Meenungsäusserung an Persounen mat enger Zuel vun agebousst Konditiounen, dorënner Gaucher Krankheet, Alzheimer an Asthma. Allerdéngs bleift de Beitrag vun dësen Enzymen zu der pathophysiology vun deene Krankheeten alles ze gin. D'quantification vun der Chit1 an AMCase mRNA Niveauen an de Verglach vun deenen Niveauen mat de Niveau vun bekannt Referenzmaterial Genen kann nëtzlech an biomedically relevant Informatiounen generéieren. Am Ufank, gegrënnt mir eng grouss Hinnen alleguer System real-Zäit déi vun ligating der cDNA Fragmenter vun der Zil- Genen produzéiert Standard DNA benotzt. Dëse System erlaabt eis den Ausdrock Niveau vun der chitinases an der Referenz Genen op d'selwecht Skala ze ofgedonkelt an vergläichen. Mir hu fonnt, datt AMCase mRNA bei extrem héich Niveauen an der Maus Mo. Wierderbuch steet. Den Niveau vun dëser mRNA an der Maus Mo. war 7- bis 10-fantastesch méi héich wéi den Niveau vun der housekeeping Genen a war ähnlech, datt de Niveau vun der mRNA fir pepsinogen C (progastricsin), e grousse Bestanddeel vun der gastric mucosa. Soumat ass AMCase mRNA eng grouss ët zu Maus Mo, datt AMCase Funktiounen als digestive Aktivitéit suggeréiert datt polymeric chitin Theorem an als Deel vun de Provider Ofwier géint chitin-haltege pathogens an der gastric Inhalter. Eis Methodik Nowäis fir d'quantification vun mRNAs fir Multiple Genen ganze Multiple uplanzen d'selwecht Skala benotzt VerfÜgung

Fro:. Ohno M, Tsuda K, Sakaguchi M, Sugahara Y, Oyama F (2012) Chitinase mRNA Niveauen vun Chemeschen Hinnen alleguer deenen Single Standard DNA: dono Mammalian Chitinase Ass engem Major ët an der Mouse Moo. One PLoS 7 (11): e50381. Doi: 10.1371 /journal.pone.0050381 VerfÜgung

Redakter: Dominik Hartl, Universitéit Tübingen, Däitschland VerfÜgung

Arnaque: August 6, 2012; Akzeptéiert: 19 Oktober 2012; Publizéiert: 21. November 2012 VerfÜgung

Copyright: © 2012 Ohno et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht war vun der Project Research Grant vun der Fuerschung Institut vu Wëssenschaft an Technologie, Kogakuin Uni ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Chitin, eng linear Polymer vun β-1-4-Hausnummeren N VerfÜgung -acetyl-d-glucosamine, ass déi zweet Équipe räich polysaccharide an Natur fonnt. Et Funktiounen als eng grouss strukturell Komponent vun Holz liewen, crustaceans, an Insekten awer net zu Mamendéieren [1] fonnt. Chitinases hydrolyze der β-1-4 glycosidic Obligatiounen vun der chitin Polymer. Obwuel Mamendéieren, net chitin oder seng synthase produzéiere auszedrécken si zwee aktiv chitinases, chitotriosidase (Chit1) an dono mammalian chitinase (AMCase) [2], [3]. VerfÜgung

D'Chit1 Niveau vun de Plasma Ofstand erhuewen ass vun Patienten mat Gaucher Krankheet, eng autosomal recessive Dëst Stockage Stéierungen [4]. Chit1 war den éischte mammalian chitinase sidd an gekloonten ginn [5], [6]. A recessively geierft hunn an Chit1 Aktivitéit ass allgemeng zu Caucasians observéiert [7]. AMCase war wéinst hirer indemnité Roll entdeckt a war fir seng dono pH beschtméiglecher genannt [8]. Dës mammalian chitinases sinn als Deel vun de Provider Ofwier Mechanismus géint chitin-haltege pathogens a Parasiten erauskoum [3], [9]. VerfÜgung

Béid Chit1 an AMCase sinn secreted Proteinen mat molekulare Gewiichter vun ongeféier 50 kDa. Béid Proteinen enthält eng N-Uschloss Katalysator Domän, eng artikuléiert Regioun, an engem C-Uschloss chitin-verbindlech public [6], [8]. Mouse AMCase weist Haaptrei homology zu Chit1, mat eng Identitéit vun 52% an engem System vun 60% [10]. Trotz dësen strukturell eraus, ënnerscheeden dës Enzymen vill mat Respekt un hir enzymatic Behuele bei dono pH. AMCase weist eng schéi pH beschtméiglecher um pH 2 an enger manner evident beschtméiglecher um pH 4-7 [8] hierkommen Chit1 weist just eng breet pH beschtméiglecher bei ronn pH 5 [5], [11]. VerfÜgung

Mammalian chitinases hunn bedeitend opmierksam duerch hir fräi Meenungsäusserung an Persounen mat aneren agebousst Konditiounen ugezunn. Chit1 ass zu Persounen mat Gaucher Krankheet fräi [4], chronescher obstructive deser Krankheet (COPD) [12], an Alzheimer [13] an am Fëmmerten [14]. AMCase Ausdrock an Aktivitéit sinn och während allergescher airway Äntwerte vun Maus Modeller vun Asthma [15] upregulated. Zousätzlech, induces polymeric chitin AMCase Ausdrock an de Rekrutement vun immun Zellen verbonne mat Allergie an Asthma [16]. Dës Resultater staark hindeit datt chitinolytic Enzymen wichteg Roll an vill pathophysiological Konditiounen Leeschtung. Allerdéngs bleift de Beitrag vun dësen Enzymen zu der pathophysiology vun deene Krankheeten alles ze gin. VerfÜgung

D'quantification vun der Chit1 an AMCase mRNA Niveauen an de Verglach vun deenen Niveauen mat dem Niveau vun bekannt Referenzmaterial Genen si wichteg Schrëtt an intelligent Abléck an der zu VIVO VerfÜgung Regulatioun vun mammalian chitinases. Viru Kuerzem, huet real-Zäit RT-Hinnen alleguer benotzt ginn mRNA Niveauen an vill Gentherapie Ausdrock Studien [17] zu ofgedonkelt - [20], well dës Method genuch sensibel ass mRNA z'entdecken aus souguer eng eenzel Zell. Real-Zäit Hinnen alleguer implizéiert Toast der normalization vun der Ausdrock Niveau vun der Gentherapie vun Intressi mat deene vun der housekeeping Genen dass konsequent an all vun den Echantillon ausgedréckt si geduecht gin. Allerdéngs klappt dat quantification Method den Niveau vun de verschiddene Gentherapie gët op d'selwecht Skala ze vergläichen. VerfÜgung

Am Moment Enquête, entwéckelt mir eng grouss real-Zäit RT-Hinnen alleguer System dass Norm DNA vun ligating der produzéiert benotzt cDNA Fragmenter vun der Zil- Genen. Dëse System erlaabt eis den Ausdrock Niveau vun der chitinases an der Referenz Genen op d'selwecht Skala ze ofgedonkelt an vergläichen. Eis Resultater weisen, datt AMCase eng grouss ët an der Maus Mo ass, proposéiert, datt déi entspriechend FAQ Funktiounen als digestive Aktivitéit datt chitin-haltege Liewensmëttel an als Deel vun de Provider Ofwier géint chitin-haltege pathogens an der gastric Inhalter Theorem.

spontan a Methode VerfÜgung

RNS, RNS Isolatioun a VerfÜgung cDNA Virbereedunge

d'Mouse Total RNS Master Panel (Clontech Laboratoiren) benotzt gouf de Otemschwieregkeeten Verdeelung vun ungen ënnersicht. Mir analyséieren véier verschidden embryonal Etappen an aacht erwuessener Stoffer. Ausserdeem war vun der Longen a Mamm vun 3-Mount-alen Mann Mais RNS isoléiert. C57BL /6J Mais (KLOR Japan) goufen um RIKEN Brain Science Institut Déieren Facility flegelhaft. All Déier Experiment an Iwwerteneestëmmung mat den institutionelle Richtlinnen gesuergt. De Protokoll ass duerch de Comité op d'Ethik vun Déieren Experimenter vun der RIKEN Brain Science Institut (Ministär Nr H19-2B013) abruecht. All Agrëff huet andems diethyl ETHER als Anästhesietechniken gesuergt, an all Efforten gemaach goufen Leed ze minimiséieren. Déi Stoffer fir mRNA Virbereedung sech duerch Drs gëtt. Miyazaki an Nukina um RIKEN Brain Science Institut. Total RNS war vun Longen a Mamm mat TRIzol Reagent (Invitrogen) laut den Hiersteller d'Instruktioune virbereet. Ewechzehuelen sech d'Spuer Montanten vun contaminating Frankräich DNA, déi total RNS Echantillon mat RQ1 RNase-Free DNase (Promega) behandelt no de Recommandatioune Protokoll d'Hiersteller. D'Konzentratioun vun der definitiv Saieren sech duerch Miessunge absorbance bei 260 nm mat engem BioPhotometer Plus (Eppendorf) alles. Jiddereng vun den insgesamt RNS Echantillon (3 μg) war haut zu ëmgedréint Transkriptiouns mat ënnerschiddleche hexamers als primers. D'Reaktioun Mëschung (15 μl) aus der Aktivitéit gefiermt [50 mm Tris-HCl (pH 8.3), 75 mm KCl, an 3 mm MgCl _{2], 100 NG vun zoufälleg hexamers, 10 mm dithiothreitol, an 0,5 mm deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). No Heizung ëmgedréint d'Léisung zu 60 ° C an 5 min an incubating der Mëschung bei 37 ° C fir 5 min, 200 U vun recombinant murine Leukämie Virus transcriptase (Invitrogen) ugebaut, an huet d'Mëschung bei 37 ° C fir 45 min incubated . De Géigendeel Transkriptiouns vun Heizung bis 95 ° C an 5 min kom- war. VerfÜgung}

Real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung

Primers fir real-Zäit RT-Hinnen alleguer entworf goufen baséiert op Primer Express Software (Obwuel Biosystems) a sech kommerziell (Fläch-Genosys, Fläch-Aldrich) Wierderbuch. D'Hinnen alleguer Reaktioune waren zu enger definitiver Volume vun 13 μl standing mat 2 × SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix, Agilent), 2,7 NG vun Maus cDNA oder passenden dilutions vun der externer Standarden (kuckt hei drënner), an der entspriechend Konzentratioune vun der primers fir d'chitinases, pepsinogen C, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) oder β-actin. Standard real-Zäit Hinnen alleguer Konditiounen fir de System (Mx3005P, Agilent) sech benotzt: en éischte denaturation an polymerase Aktivéierung Schrëtt fir 10 min bei 95 ° C, gefollegt vun 40 Zykle vun denaturation bei 95 ° C fir 1 min, 55 ° C fir 30 sec, an 72 ° C fir 1 min. Melting Kéiren sech no amplification entsteet. D'Hinnen alleguer Produiten waren op enger 10% polyacrylamide gelies electrophoresed an analyséiert der bloer Image Organer (ImageQuant Las 4000, GE Gesondheetswiesen) benotzt. D'Hinnen alleguer Léisung war mat ExoSAP-IT (USB Produkter) behandelt no den Instruktioune vum Fabrikant unincorporated primers an dNTPs eliminéiert ginn, an d'Produite sech mat dem Abi PRISM Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit an engem 3130 genetesch Organer Nepgen ( applizéiert Biosystems). D'Nukleotid Message vun der primers fir d'real-Zäit Hinnen alleguer ausgewielt ginn an Table S1 gewisen. VerfÜgung

Bau vun der Standard DNA VerfÜgung

D'Norm Skelett cDNA (913 Base) fir d'quantification vun ët Niveauen Hinnen alleguer déi real-Zäit gebaut huet wéi follegt. D'cDNA Fragmenter die Hinnen alleguer-Zil- Regioun plus 9-120 Base vun der Reliefsailen Regioune vun AMCase, Chit1, pepsinogen C, GAPDH, an β-actin sech aus Maus Mo. cDNA vun Hinnen alleguer Implikatioune benotzt wëll just hei awer Plus DNA polymerase (Toyobo) an oligonucleotides primer der Restriktioun Siten vun BGL VerfÜgung II, Xho VerfÜgung ech, Pompey VerfÜgung sin, oder net VerfÜgung ech (um 5'- an 3 wou ' - Extremitéiten) no de Protokoll d'Hiersteller. De Stiermer an ëmgedréint primers sinn an Table S2 opgezielt. D'Hinnen alleguer Produite goufen sidd der Wizard SV gelies an Hinnen alleguer Clean-Up System (Promega) benotzt an dann mat den entspriechende Restriktioun Enzymen verdaut. Den DNA Fragmenter benotzt agarose gelies electrophoresis an der Clean-Up System sidd an dunn Jonglenster zesumme mat T4 DNA ligase (Toyobo). D'Jonglenster Fragmenter sech mat der Forward primer 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 Kick "an de Géigendeel primer 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3" mat wëll just hei awer Plus DNA polymerase. 3'-DA war fir d'Implikatioune DNA benotzt Takara Taq t (Takara Bio) ugebaut, an de Produit gouf vun gelies electrophoresis sidd wéi uewe beschriwwen. Déi doraus resultéierend DNA war an der pGEM-T Easy Vecteure (Promega) duerch TA Klone gekloonten, no den Instruktioune vum Produzent. D'Nukleotid Haaptrei vun dem doraus erwuessenen plasmid war vun sequencing confirméiert. D'linearized multigene-haltege DNA ofgesprengt gouf duerch reamplification vum plasmid DNA mat der selwechter primers vun Hinnen alleguer mat wëll just hei awer Plus DNA polymerase virbereet. D'Fragmenter waren sidd an laachen ëmschriwwen uewen a benotzt als Standard DNA. VerfÜgung

Virbereedunge Five cDNAs Daach vum ganze Coding Regioun VerfÜgung

Fir eis absolute real-Zäit Hinnen alleguer Method validéieren, mir bereet voll coding cDNAs vun Hinnen alleguer d'primer baut opgezielt an Table S3 benotzt. Fënnef cDNAs deckt de ganzen coding Regioune vun zwee chitinases (Chit1 an AMCase) an der Referenz Genen (GAPDH, β-actin an pepsinogen C) huet vun Hinnen alleguer aus Maus Mo. cDNA Implikatioune benotzt wëll just hei awer Plus DNA polymerase a sech subcloned an der pGEM-T einfach Vecteure duerch TA Klonen, wéi uewe beschriwwen. De Message vun der cDNAs sech duerch sequencing ubelaangt, wéi zu Dorënner S1 beschriwwen. D'subcloned Fragmenter sech aus der plasmid DNAs mat der selwechter primers reamplified an sech dann als de ganze coding Regioun cDNAs benotzt. VerfÜgung

Standard verständlech VerfÜgung

D'Dokter Konzentratioun vun der multigene-haltege DNA Standard berechent huet baséiert op der Konzentratioun an der molekulare Gewiicht. Serial dilutions sech bereet mat der Norm Skelett Konzentratioun ugefaange, wou en CT vun ongeféier 13 (CT = fractional loung Zyklus Wäert) Kriseperiod. D'Norm DNA zu ënnerworf war 10-fantastesch Serien dilutions, rangéiert vun 10 0 bis 10 7 Molekülle, an der aliquots sech bei -20 ° C bis benotzen gefruer huet. VerfÜgung

Quantification vun mRNA Hinnen alleguer vun Real-Zäit mat de Standard verständlech oder der ΔΔ CT Language VerfÜgung

all Echantillonen an triplicate Implikatioune war, an all Experimenter gouf op d'mannst zwee Mol widderholl. Benotzt der Norm rop, d'Nummere vun Chit1, AMCase, GAPDH, β-actin, an pepsinogen C mRNA Molekülle sech mat der Versioun MxPro QPCR Software automatesch vermëttelt 4.10 (Agilent). All Wäerter sech als Molekülle pro 10 NG vun insgesamt RNS ausgedréckt. An e puer Momenter, goufen normalized de Wäerter géint den Niveau vun GAPDH oder β-actin mRNA. VerfÜgung

Fir eis dobäi Methodik Evaluéieren, mir der ΔΔ CT Method och agestallt [21], déi d'Moosse vun de Cycle loung verlaangt (Kosovo) vun Zil- Genen. CT Wäerter sech duerch d'MxPro QPCR Software benotzen GAPDH oder β-actin als normalizer berechent. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Grënnung vun der Real-Zäit Hinnen alleguer Assay VerfÜgung

D'Opstelle vun engem verléisslech Method fir d'Miessung vun den Ausdrock vun chitinase gët ass e wichtege Schrëtt an d'Bedeitung vun Maus chitinases enquêtéiert. Real-Zäit RT-Hinnen alleguer ass, am Moment, déi sensibel grouss Method fir d'Detektioun vu béiden niddereg-Iwwerfloss mRNAs a räich gët. Mir Verglach éischt der Gentherapie Ausdrock Niveau vun der Chit1 an AMCase Genen (kuckt Dorënner 1). Fir d'chitinase Niveau diskutéieren, déi mir zwee housekeeping Genen, GAPDH an β-actin, als Referenz Genen well se constitutively bei héijen Niveauen am meeschte Stoffer an Zellen ausgedréckt ginn [22]. Ausserdeem hutt mir pepsinogen C als Referenz Gentherapie am Mo. (och als progastricsin bekannt). Pepsinogen C ass en aspartic protease dat als digestive Aktivitéit Funktiounen an ass an de Mo produzéiert. Dës Aktivitéit soumat e grousse Bestanddeel vun der gastric mucosa [23]. Benotzt dëse dräi Referenzmaterial Genen, évaluéiert mir der Gentherapie Ausdrock vun Chit1 an AMCase zu Maus Stoffer (Dorënner 1). VerfÜgung

Mir éischt puer baut vun primers fir grouss Hinnen alleguer entworf a bewäert hir suitability baséiert op, ob se den eenzelne Produiten , wéi vun engem eenheetlechen vermëschen Temperatur (TM) an engem eenzege Band op engem 10% polyacrylamide gelies reflektéiert. D'Nukleotid Message vun de Produiten goufen och ubelaangt. Fir d'Spezifizitéit vun der primers iwwerpréifen, jiddereng vun der Hinnen alleguer Produiten war ënner andems e Maus Otemschwieregkeeten cDNA Mëschung real-Zäit Hinnen alleguer Konditiounen Implikatioune aus Stoffer aus véier embryonal Etappen an aacht erwuessener Stoffer a war a Kombinatioun mat anere Methoden assayed. Als zu Dorënner 2A-E gewisen, nëmmen een Héichpunkt wossten an der dissociation Kéiren fir Chit1 (TM = 79,7 ° C), AMCase (TM = 79,1 ° C), GAPDH (TM = 81,4 ° C), β-actin (TM = 82,0 ° C) an pepsinogen C (TM = 81,4 ° C). Um Enn vun der Hinnen alleguer, analyséiert mir de Produiten op engem 10% polyacrylamide gelies. Gelies electrophoresis zougedréckt kloer eenzel Gruppen um erwaart Gréisste vun Chit1 (69 BP), AMCase (81. BP), GAPDH (77. BP), β-actin (71 BP) an pepsinogen C (82 BP) (Dorënner 2F). D'Nukleotid Message vun der Hinnen alleguer Produite goufen direkt alles esou an d 'Material a Methoden Rubrik beschriwwen. Mir confirméiert, datt d'Hinnen alleguer Produiten aus der Zil- cDNAs Implikatioune huet (kuckt Dorënner 3B). Dës Resultater weisen, datt d'Hinnen alleguer Produiten spezifesch amplicons vun der Zil- cDNAs an datt mispriming ass negligible ënner eis experimentell Konditiounen. VerfÜgung

Bau vun der Standard Schabloun DNA fir d'Quantification a Se Gene Expression Dorënner Five Genen VerfÜgung

Mir machen de Ausdrock Niveau vun zwee chitinases an dräi Referenzmaterial Genen op d'selwecht Skala (Dorënner 1) ze vergläichen. Fir dësen Zweck, setzen mir eng grouss real-Zäit Hinnen alleguer System fir déi e Liewesniveau Skelett war néideg fir korrekt quantification (Dorënner 3A) weider. Mir gebaut e Liewesniveau Skelett DNA fir real-Zäit Hinnen alleguer vun ligating der fënnef Zil- Fragmenter vun engem eent-zu-eent Verhältnis, an dann dat Jonglenster DNA ofgesprengt gouf an der plasmid Vecteure gekloonten wéi an d 'Material a Methoden Sektioun (Dorënner 3A) beschriwwen . D'913-Nukleotid-laang Skelett aus DNA fënnef cDNA Fragmenter die Hinnen alleguer-Zil- Regioun plus 9-120 Base vun der Reliefsailen Regiounen an enthale der Restriktioun Siten vun BGL VerfÜgung II, Xho VerfÜgung ech , Pompey VerfÜgung ech an net VerfÜgung ech (kuckt Detailer zu Dorënner 3B). VerfÜgung

Validatioun vun de Standard men an der Chemeschen Real-Zäit Hinnen alleguer System VerfÜgung

d'vun quantification der chitinases souwuel an der Referenz mRNAs berout op Norm Kéiren. Serial dilutions vun der Norm Skelett DNA sech benotzt e Liewesniveau rop ze bauen d'real-Zäit RT-Hinnen alleguer quantification Strategien ze vergläichen an deeër dass déi fënnef mRNAs ze analyséieren benotzt goufen. All Norm Kéier war entsteet mat 10-fantastesch Serien dilutions vun der Norm DNA an der fënnef verschiddene primer Puer (Dorënner 4A-E, lénks). Exponential amplification war iwwer eng breet Palette vu Monaco haten, eng dynamesch Gamme vu siwen Uerder vun Magnitude noginn (Dorënner 4A-E, lénks). Andeems se mat der Norm Skelett DNA wouvun der fënnef cDNA Fragmenter, kënnen gläichberechtegt Quantitéiten un all fënnef Genen an all dilution benotzen zougewisen ginn der Norm Kéiren (Dorënner 4A-E, riets) ze bauen. VerfÜgung

Fir d'absolut Gläichheet Test vun de Kéieren, war e bekannte Konzentratioun vun der voll coding cDNA Kick an duerno als eng onbekannt Echantillonen analyséiert. Dëst assay war gesuergt, fir z'iwwerpréiwen, datt all getest dilution am erwaart Quantitéit duerchgesat. Als zu Dorënner 4A-E gewisen, riets, gläichberechtegt solle fir all getest dilution benotzt observéiert goufen d'Norm rop (kuckt Dorënner S2) ze bauen. D'quantification vun niddereg-Iwwerfloss gët a räich gët erlaabt eis d'Sensibilitéit an Zouverlässegkeet vun real-Zäit Hinnen alleguer ze confirméieren, wat beweist, datt eis real-Zäit Hinnen alleguer Method enger grousser dynamesch Gamme vun quantification offréiert, héich Richtegkeet, an héich Empfindlechkeet (Dorënner 4A- E, riets). Sou, eis real-Zäit Hinnen alleguer Method gëtt verléisslech Wäerter fir zwee chitinase Genen a fir Referenzmaterial Genen op der Skala. VerfÜgung

Expression vun Chit1 an AMCase zu Mouse Stoffer VerfÜgung

Fir ze studéieren der zu VIVO VerfÜgung Regulatioun vun Chit1 an AMCase Gentherapie Ausdrock, ofgebaut total RNS Echantillon aus véier embryonal Etappen an aus verschiddenen Erwuessenen Stoffer, sech mat enger mei real-Zäit Hinnen alleguer assay mat der Single Standard DNA (Dorënner 3) analyséieren. D'Resultater goufen als Molekülle pro 10 NG vun insgesamt RNS (Dorënner 5 an Dorënner 6) ausgedréckt. Souwuel de Chit1 an AMCase mRNAs waren an Maus Stoffer (Dorënner 5A an 5B) dicht ausgedréckt. Kloer Otemschwieregkeeten Charakteristika waren an der Ausdrock Musteren souwuel chitinase mRNAs observéiert. Héich Niveaue vu Chit1 mRNA waren an der Maus Mo. (Dorënner 5A, ieweschte Rot), gefollegt vun den Aen an d'haett fonnt. Chit1 mRNA war um niddereg, fonnt mä erhale Magnéitfeld, Niveauen an aner Stoffer (Dorënner 5A, manner Rot). AMCase mRNA Kannerbetreiung war am Mo. fonnt, gefollegt vun der submaxillary drüs (Dorënner 5B, ieweschte Rot), mä war och präsent an aner Stoffer (Dorënner 5B, manner Rot). VerfÜgung

Mir Verglach dann d'nennen vun AMCase zu Chit1. D'Kopie Zuel vun all mRNA war benotzt déi selwecht Norm dilutions alles. Mir hu fonnt, datt de Mo an der submaxillary drüs Kannerbetreiung AMCase mRNA (Dorënner 5C, ieweschte Rot) ausgedréckt. Den Trainer vun dëser Etude iwwerpréift Stoffer produzéiert méi AMCase wéi Chit1, an Chit1 war verwandelt nëmmen an den Ae (Dorënner 5C, manner Rot). VerfÜgung

Mir iwwerpréift nächst der famill quantification am Original an Dorënner virgestallt Donnéeën 5, dat war pro 10 NG vun insgesamt RNS als Molekülle ausgedréckt, mat housekeeping Genen wéi an spontan a Methoden beschriwwen. D'Resultater goufen als Ennerstëtzung Informatiounen zu Dorënner S3 gewisen (Daten war vun GAPDH normalized) an Dorënner S4 (normalized duerch β-actin). Dunn, analyséiert mir Daten zu Well dës 5 vun der ΔΔ CT Method [21] an den Zousätzlecht Informatiounen zu Dorënner S5 (normalized vun GAPDH) an Dorënner S6 (normalized duerch β-actin) gewisen. Wann der famill Ausdrock vun der presentéieren absolut a relativ quantification Methode fonnt vergläichen, gouf et keen groussen Ënnerscheed tëschent der Donnéeën ausser Ausdrock Chit1 mRNA, dee war am Iwwerfloss hunn an den Ae ausgedréckt wann duerch β-actin normalized (Dorënner 5, Dorënner S3 gesinn an Dorënner S4). Ähnlech Resultater goufen och déi relativ quantification mat der ΔΔ CT Method [21] (kuckt Dorënner 5, Dorënner S5 an Dorënner S6) kritt. Allerdéngs kéint mer net direkt géigesäitege Wëllen Niveau vun Chit1 an AMCase diskutéieren wann déi ΔΔ CT Method analyséiert. VerfÜgung

Analys vun Chit1, AMCase, Pepsinogen C, GAPDH, an β-actin zu Lung an Mo. Stoffer

hunn Vill Studien gouf op der pathophysiology vun mammalian chitinases zu haett Stoffer duerchgefouert. An dëser Etude, awer mir dass AMCase mRNA Kannerbetreiung an Maus Mo. Stoffer (Dorënner 5) ausgedréckt gëtt. Mir Verglach och den Ausdrock Niveau vun der chitinases an Referenzmaterial Genen mat der virbereet cDNAs aus der haett an Mo. Stoffer vun 3-Mount-al Mais (n = 5). Déi grouss Donnéeë sinn an Dorënner dës 6. Wann d'Chit1 Niveau bei 1.0, d'Bekannten Ausdrock Niveau vun cDNAs Formatioun huet sech AMCase, 14; GAPDH, 196; an β-actin, 681 an der Maus Otemschwieregkeeten (Dorënner 6A). Dëst Resultat bedeit dat haett Stoffer méi AMCase wéi Chit1 auszedrécken, obwuel d'AMCase Ausdrock Niveau méi niddreg wéi déi vun den zwee housekeeping Genen. VerfÜgung

Am Mo Stoffer, wann der Chit1 Niveau bei 1.0, d'Bekannten Ausdrock Niveauen Formatioun huet sech AMCase, 721; pepsinogen C, 2261; GAPDH, 61; an β-actin, 127 (Dorënner 6B). Béid GAPDH an β-actin Genen sinn bekannt housekeeping Genen a sinn constitutively bei héijen Niveauen am meeschte Stoffer an Zellen ausgedréckt. Pepsinogen C (progastricsin) ass eng aspartic protease dat als digestive Aktivitéit Funktiounen an ass an de Mo produzéiert. Dës Aktivitéit ass e wichtegen Volet vun der gastric mucosa [23]. Den Ausdrock Niveau vun AMCase war vill méi héich wéi déi vun GAPDH an β-actin a war fir den Niveau vun pepsinogen C. ähnlecher Dës Resultater weisen, datt Mo. AMCase eng grouss ët am gastric mucosa ass a virschloen, datt dës Aktivitéit wahrscheinlech ass wichteg ze spillen gestallt Rollen an de Moo. VerfÜgung

Mir och du-iwwerpréift relativ Ausdrock vun Chit1, AMCase an pepsinogen C an Dorënner 6 Hëllef vun presentéieren Method housekeeping Genen gewise wéi uewe beschriwwen. D'Resultater goufen als Ennerstëtzung Informatiounen zu Dorënner S7 (normalized vun GAPDH) an Dorënner S8 (normalized duerch β-actin) gewisen. Et war kee groussen Ënnerscheed tëschent Dorënner 6, Dorënner S7 an Dorënner S8. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Béid Chit1 an AMCase si geduecht an der Provider Ofwier géint chitin-haltege pathogens zu Hëllef [3], [ ,,,0],9]. Ausserdeem, ass AMCase eng effector Protein an allergescher inflammation. Dës chitinolytic Enzymen Leeschtung wichteg Roll an der pathophysiology vun allergescher airway Äntwerte vun Maus Modeller vun Asthma. Relativ wéineg bekannt ass, awer, iwwert de zu VIVO VerfÜgung géigesäitege Wëllen Niveau vun Chit1 an AMCase. D'quantification vun mRNAs kann nëtzlech an biomedically relevant Informatiounen generéieren. An dëser Etude, gegrënnt mir eng grouss System Hinnen alleguer real-Zäit kapabel vun der mRNA Niveau vun zwee mammalian chitinases bestëmmend a vun deenen Niveauen mat deene vun Referenzmaterial Genen een d'selwecht Skala benotzt. Eis Resultater weisen, datt AMCase Kannerbetreiung an der Maus Mo. ausgedréckt gëtt. VerfÜgung

Chemeschen real-Zäit RT-Hinnen alleguer stellt eng wichteg Viraus zu mRNA Quantifizéierung an erméiglecht der Detektioun vum Ausdrock vun engem bestëmmte Gentherapie vun Interessi um molekulare Niveau . Et gi vill Rapporten iwwert d'Detectioun vun extrem nidderegen Niveau vun mRNA dëser Technik benotzen. Allerdéngs, real-Zäit RT-Hinnen alleguer ass net engem oft benotzt, well et nach Aschränkungen an Quantifizéierung Multiple mRNAs benotzt déi selwecht Skala huet. Mir gebaut e Liewesniveau Skelett DNA vu fënnef cDNA Fragmenter (all ~200 Base laang). Dës Brochstécker abegraff Fragmenter fir zwee chitinases, ee Bewaacher geflitzt an zwee housekeeping Genen a waren zu eent-zu-eent nennen (Dorënner 3A) kombinéiert. GAPDH an β-actin, déi oft benotzt housekeeping Genen, goufen als intern Kontrollen a Referenze fir Hinnen alleguer amplification abegraff. Zousätzlech, benotzt mir pepsinogen C als Bewaacher Gentherapie, well et bei engem héijen Niveau am Mo. [23] produzéiert gëtt. Dës Method erlaabt der absolute quantification vun der Zuel vun Chit1 an AMCase mRNA Molekülle, wéi och d'Zuel vun Referenzmaterial mRNA Molekülle, pro 10 NG vun insgesamt RNS (unkomm /10 NG) (Dorënner 5 an Dorënner 6). Doriwwer kéint mer relativ quantification vun der Chit1 an AMCase mRNA Niveau mat zwou housekeeping Genen, GAPDH an β-actin (Ennerstëtzung Informatiounen Dorënner S3 an Dorënner S4) ënnersicht. VerfÜgung

rel quantification méi liicht ass wéi absolute quantification well en zu Leeschtunge Eechung rop ass net néideg. Am Verglach quantitation, mRNA Niveau vun der Gentherapie vun Interessi sinn aus deenen vun der housekeeping Genen Verglach [21]. Allerdéngs klappt dat quantification Method den Niveau vun de verschiddene Gentherapie gët op d'selwecht Skala ze vergläichen. Obwuel eiser Method Multiple Schrëtt verbonne mat dem Bau vun der Norm DNA a mat der Confirmatioun Prozesser verlaangt, kann dës Method Gentherapie Donnéeë Ausdrock, datt tëscht Genen (Dorënner 5 an Dorënner 6) direkt vergläichbar sinn. Eis real-Zäit Hinnen alleguer gëtt eng grouss dynamesch Gamme vun quantification an héich Empfindlechkeet, an der quantification vun niddereg-Iwwerfloss gët Nodeems eis d'Sensibilitéit an Zouverlässegkeet vun eiser Method (Dorënner 4) ze validéieren. Dës Technik ass ganz gutt geegent fir d'quantification an Verglach vun mRNA Niveauen ganze Multiple Genen d'selwecht Skala benotzt. Eis presentéieren Method ass applicabel ze biomedical Ingenieur souwéi zu Medeziner a praktesch benotzt. VerfÜgung

Am Moment Enquête, mir fonnt, datt AMCase mRNA bei extrem héich Niveauen an der Maus Mo. relativ zu de Niveau vun housekeeping Genen Wierderbuch ass (Well 5 an Dorënner 6). Den Niveau vun AMCase mRNA ass vergläichbar mat deem vun pepsinogen C (progastricsin) mRNA, e grousse Bestanddeel vun der gastric mucosa am Mo. (Dorënner 6B). Zousätzlech zu de Mo, goufen d'submaxillary Glands och grouss Quantitéiten vun AMCase (Dorënner 5) zu hinne fonnt. Wéi fir mammalian chitinase mRNAs synthesizing, sinn souwuel Mo an submaxillary Glands als bemierkenswäerte Stoffer erauskoum fir bedäit vun AMCase zu Maus produzéiert. VerfÜgung

Salz- Seier ass an de Mo secreted, dono Konditioune fir d'Verdauung vun Proteinen vun pepsin schafen bei ongeféier pH 2 [23], [24]. Mouse AMCase weist déiwer Seier Stabilitéit an ass déi aktiv um pH 2.0, déi et aus aner Maus Enzymen ënnerscheet [8]. D'ongewéinlech pH Stabilitéit an Ofhängegkeet vun der Maus AMCase op dono Konditiounen erlaben de efficace Verdauung vun chitinous Material ënner dono Konditiounen. D'Observatioun datt AMCase ass virun allem am Mo. Punkten fir seng méiglech Funktioun vun Agrarliewensmëttelindustrie ausgedréckt. Wild Mais iessen chitin-haltege Liewensmëttel wéi Insekten hierkommen Mais am Labo huet kënschtlech Bierger iessen gedréchent Béierbrauer 'Happ wouvun, déi och chitin an der Zell Mauer enthält. Sou, AMCase kann als digestive Aktivitéit Funktioun datt am gastric Inhalter polymeric chitin Theorem. VerfÜgung

Déi héchsten Niveau vun Chit1 war och an der Maus Mo. ausgedréckt. Allerdéngs war d'Chit1 Ausdrock Niveau vun de Mo. 1/721 déi vun der AMCase Ausdrock Niveau a méi niddreg wéi den Ausdrock Niveau vun zwee housekeeping Genen, GAPDH an β-actin (Dorënner 6A). Zousätzlech, heescht besëtzen Chit1 keng chitinolytic Aktivitéit um pH vun gastric Jus'en, déi ronderëm pH ass 2 [5], [11]. Et gouf gewisen, datt Chit1 um Site vun der Géigend-neutral pH produzéiert gëtt, wéi den Net-glandular Deel vun de Mo an de klenge Daarm [25]. Sou, heescht bäidroen Chit1 net Aktivitéit an der Maus Mo ze chitinase. VerfÜgung

Obwuel AMCase ausgedréckt ass virun allem an de Mo a submaxillary Glands, all aner zu dëser Etude iwwerpréift Stoffer ausgedréckt niddereg, mä Magnéitfeld, Niveaue vun Chit1 an AMCase . Den Ausdrock Niveau vun Chit1 an AMCase sech niddreg wéi déi vun der housekeeping Genen vun dëse Stoffer. Chit1 weist eng breet pH beschtméiglecher bei ronn pH 5 [5] hierkommen der Primärschoul optimal pH vun AMCase ass pH 2 an de Secondaire pH optimal ass um pH 4-7, mat AMCase engersäits manner wéi 30% vun hirer Aktivitéit um pH 2 an ass de pH Rei [8]. Béid Chit1 an AMCase erbléckt natierlech chitin an chitosan via endo-chitinase Aktivitéit an produzéiere chitobiose [8], [26]. Obwuel AMCase dominant iwwer Chit1 zu vill Maus Stoffer ass, et keng grouss Ënnerscheeder an hir chitinolytic Aktivitéit an Maus Stoffer kënnen. VerfÜgung

Méi AMCase mRNA wéi Chit1 mRNA war am meeschte Maus Stoffer observéiert, ausser fir d'Aen. Eis Resultater weist och, dass Gentherapie Ausdrock vun Chit1 kann developmentally regulariséiert ginn, proposéiert, datt et eng Roll an ontogeny spillt. Ënnersich d'Regelung vun den Ausdrock vun der mammalian chitinases konnt Abléck an d'Fro gestallt Rollen vun dësen Enzymen ginn. Eng detailléiert characterization vun de Promoteur Regioune vun Chit1 an AMCase Genen wéi och d'Identifikatioun vun Well VerfÜgung - an Ziel VerfÜgung -acting Faktoren néideg ginn déi selektiv Ausdrock vun dësen Enzymen ze verstoen <. br>

Obwuel Mamendéieren chitin oder chitin synthase net produzéiere, si se zu dësem Polymer duerch aussetzt chitin-haltege Parasiten an pathogens weiderdroën ausgesat. D'Realitéiten fir mammalian chitinases ass viraussiichtlech Ëmwelt- chitin, wéi dat am Holz liewen oder parasitic nematodes fonnt. An de Longen, kann souwuel Enzymen als Deel vun de Provider Ofwier Mechanismus Akt géint chitin-haltege pathogens, wéi Ëmwelt gestart a kleng Geldstécker, datt airway Allergiker induce.

• PLOS NËMMEN: Analys vu Moo an Delger Microbiomes vun der Eastern echt (Crassostrea virginica) aus virdrun Louisiana, USA
• PLOS NËMMEN: Fibroblast Wuesstem Factor 10-Fibroblast Wuesstem Factor Receptor 2b Mediated sécher net erfuerderlech fir Erwuesse Glandular Mo. Homeostasis