PLoS ONE: identifikavimas ir apibūdinimas CXCR4 Teigiamas skrandžio vėžio kamienines ląsteles

Anotacija

Difuzinė tipo kietas navikai dažnai sudaro didelę dalį sudaro retai plinta (ty ramybės) vėžinės ląstelės, stipriai nurodant vėžio kamieninių ląstelių dalyvavimą (CSCS), nors difuzinis tipo skrandžio vėžio (GC) pacientai turėtų prastos prognozės dėl didelio dažnai vystymosi peritoninės sklaidos (PD), jis yra ribotas žinios, kad PD susijęs CSCS ir veiksmingumas CSC nukreipimą terapija difuzinis tipo GC. Šiame tyrime, mes sukūrėme labai neišplitusios GC ląstelių linijas in vivo pervežimas atrankos sukurtoms PD-susijęs GC ląstelių praturtėjimo. Iki mikrogardeliq analizės, mes nustatėme, CXC chemokino receptorių 4 tipo (CXCR4) gali būti romanas žymeklis labai metastazavusiu CSCS, nes CXCR4 teigiamas ląstelės gali augti tvirtinimo-savarankiškai, inicijuoti navikų pelių, būti atsparūs citotoksinio vaisto, ir gamina diferencijuotą dukrą ląstelės. Klinikinių mėginių, šie CXCR4 teigiamas ląstelės buvo rasta ne tik iš vėlai metastazių etape (sukaupta ascitas), bet ir anksčiau (pilvaplėvės praplovimo). Be to, gydymas transformuojantis augimo faktorius-ß sustiprintas kovos su vėžio poveikis docetakselio per indukcijos ląstelių diferenciacijos /asimetrinės ląstelių dalijimąsi CXCR4 teigiamas skrandžio CSCS net ramybės būsenoje. Todėl diferencijavimo induktoriai surengti žada gauti maksimalų gydomąjį rezultatus iš šiuo metu turimų priešvėžiniais vaistais per naujo dviračių ir CSCS

nurodomoji dalis:. Fujita T Chiwaki F Takahashi RU, Aoyagi K Yanagihara K Nishimura T, ir kt. (2015) identifikavimas ir apibūdinimas CXCR4 Teigiamas skrandžio vėžio kamieninėmis ląstelėmis. PLoS ONE 10 (6): e0130808. Doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

redaktorius: Masaharu Seno, Okayama universitetas, Japonija

Įstojo: Vasario 18, 2015; Priėmė: Gegužės 25, 2015 m Paskelbta: Birželis 25, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Fujita ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus. Visi mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į MIAME atitinkančio duomenų bazės, GEO; prisijungimas skaičius GSE53276

Finansavimas:. Šis darbas buvo iš dalies remiamą nacionalinio instituto Biomedicininės inovacijų (už pažangių mokslinių tyrimų medicinos produktų Kasyba programa ID10-41), Sveikatos apsaugos ministerijos, darbo ir gerovės Japonijoje (už Trečia Visuotinio 10 metų strategija vėžio kontrolės H22-007), nacionalinio vėžio centro mokslinių tyrimų ir plėtros fondo (25-A-6, 26-A-3). Drs, T Fujita M Tamaoki ir T Nishimura yra dėl mokslinių tyrimų Resident stipendija iš skatinimo vėžio tyrimų Japonijoje fondo gavėjai

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio mirčių visame pasaulyje. Histopathologically, GCS galima suskirstyti į dvi pagrindines kategorijas: žarnyno tipo ir difuzinio tipo. Žarnų tipo GC vyrauja didelės rizikos geografinėms teritorijoms ir plėtoja per kai vienas po kito einančių etapų, įskaitant Helicobacter pylori
( H pervežimas. pylori
) -associated atrofinė gastritas, žarnyno metaplazijos (MP), ir displazija. Priešingai, difuzinis tipo GC, kuris sudaro pusę visų GC pacientų, turi platų geografinį pasiskirstymą ir plėtoja net iš H
. pylori
-nemokama, morfologiškai normalus skrandžio gleivinė be atrofinį gastritas ar IM ir difuzinis tipo GC gali skirtis nuo žarnyno tipo tiek genetiškai ir fenotipą [1-5]. Skirtingai nei mažėjantis sergamumas žarnyno tipo, iš difuzinio tipo paplitimas Pranešama didėja visame pasaulyje [6]. Pažangiosios difuzinis tipo GC pacientų prognozė išliko prastos per pastarąjį dešimtmetį, nes dideliu greičiu peritoninės sklaidos (PD) (78%), palyginti su žarnyno tipo (45%) [7]. Visų pirma, pacientai, sergantys IV Bormann tipo GC turi itin prastą prognozę, netgi jei jie gavo daugiafunkciniam gydymą [8]. Todėl, sprendžiant PD yra aktuali problema, kad reikia pagerinti pasklidosios tipo GC pacientų prognozei.

Difuzinė tipo GCS paprastai būdingas platus stromos fibrozė su prasta kraujagyslių ir retų antiproliferacinės ( i
. El
. neįsigaliojusių) vėžinės ląstelės, kurios sukelia didelę terapinę pasipriešinimą. Nuo chemoterapijos požiūriu, transformuojantis augimo faktoriaus beta (TGF-beta) buvo manoma, kad prisidėti prie agresyvaus progresavimo per epitelio-mezenchiminių perėjimo ir paskatinti fibrozė [9]. Tačiau, TGF-β taip pat slopina ląstelių proliferaciją, indukuoja apoptozę, ir tarpininkauja diferenciaciją epitelinių ląstelių, tai rodo, kad komponentai TGF-β signaliniu keliu, turi naviko-slopinančio veiklą epitelinių navikų [10, 11]. Nors kaupti įrodymus parodė kritinį vaidmenį TGF-beta vėžio kamieninių ląstelių (CSC) Biologija, yra nedaug informacijos apie jo vaidmenį difuzinis tipo GKS.

Buvo pranešta, kad kiekvienas iš vėžinių ląstelių populiacija rodo funkcinį heterogeniškumas būdingas atskiras proliferacijos ir diferenciacijos pajėgumų skirtingų tipų auglių [12]. Apskaityti tokio naviko heterogeniškumo, buvo pasiūlytos dvi modeliai: klonų modelis evoliucija [13] ir "CSC modelis [14]. Pastarasis modelis sulaukė didelio dėmesio, kadangi ji suteikia pagrįstą paaiškinimą atsparumą įprasto chemoterapijoje ir radioterapija, kurioje inertiškos arba lėtai Dviračiai CSCS išlikti, ir rezultatai galiausiai naviko recidyvo [15-17]. Todėl gydymo strategijas nukreipti CSCS yra būtina išnaikinti likutinė ligą ir išvengti pasikartojimų ne tik GC, bet ir kitų vėžio formų. Be to, su dabartiniais įžvalgų korinio mechanizmų Kancerogeninis ir metastazėms potencialas vėžinių ląstelių priskiriamos CSCS, kurie gali klonavimu inicijuoti naviko formavimasis atokias vietas [18 19]. Nors iš ląstelių paviršiaus molekulių skaičius buvo pasiūlyta kaip CSC žymenų įvairiausių žmogaus piktybinių navikų, nebuvo žymeklis identifikavimas PD-susijęs CSCS į GCS [20-23]. Nustatyti tokius žymenis, mūsų nuomone, sąvoka, kad funkciškai ir genetiškai nevienodos navikai, pagal konkretaus mikroaplinkos kontekste bendrų ir vidinius mechanizmus naviko priežiūra. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad CSCS turėtų būti apibrėžtos funkciškai gerai patikrintus tyrimus, pavyzdžiui, in vivo, pervežimas transplantacijos. Be difuzinis tipo GC, mes iš pradžių orientuota į pilvaplėvės konkrečių kolonizacijos ląstelių ir praturtino PD-susijęs CSCS pasikartojančių vivo
pasirinkimus [24, 25]. Čia mes rasti CXC chemokino receptorių 4 tipo (CXCR4) gali būti žymeklis PD-sukeliamų skrandžio CSCS ir parodė, kad TGF-β pagerina priešvėžiniai vaistai veiksmingumą per indukcijos ląstelių diferenciacijos /asimetrinės ląstelių dalijimąsi į CXCR4 ^{+ "CSC gyventojų net ramybės būsenoje.}

medžiagos ir metodai

klinikinius mėginius

Klinikiniai mėginiai buvo numatyta nacionalinio vėžio centro ligoninė (Tokijas, Japonija), gavusi parašyta informuoti sutikimą iš kiekvieno paciento ir patvirtinimo pagal nacionalinio vėžio centro institucinių ekspertizės valdyba (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Mobilaus ryšio linijų ir pirminių kultūrų

žmogaus GC ląstelių linija, SAK-60 buvo įsteigtas bendradarbis naudojant procedūrą, kaip aprašyta anksčiau [26]. Labai pilvaplėvės-metastazavusiu ląstelių linija, 60As6 buvo įkurta iš SSK-60 naudojant orthotopic audinių implantacijai į SCID /SCID pelių kaip trumpai tokia: xenografted navikas SAK-60 ląstelių buvo persodinami į skrandžio sienelės pele. Mes pakartota šešis ciklus derliaus nuėmimo ascitic vėžinių ląstelių ir orthotopic suleistas šių ląstelių. Šie dvi ląstelių linijos buvo išlaikytos RPMI-1640 terpėje, papildytoje 10% serumas iš veršiuko embriono. Mes taip pat nustatė dvi liuciferazės ekspresija ląstelių linijas (SAK-60Luc ir 60As6Luc). Kiti šeši GC gautas ląstelių linijas (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 ir KATO III) taip pat buvo tvarkomos pagal tą pačią sąlygą. Iš šių šešių, SAK-39, SAK-44, 44As3, SAK-58 ir 58As9 buvo nustatyta pirmiau nurodyta tvarka [27, 28], o KATO III buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros Kolekcija. Pirminius kultūrų ląstelės buvo renkami iš pacientų pilvaplėvės nuoplovose ir ascitu (NSC-16C, NSC-20 C, ir NSC-22C) ir išaugintų į RPMI-1640 terpėje, papildytoje su 10% serumas iš veršiuko embriono.

mikrogardeliq analizė

viso RNR 60As6, 60As6Luc, SSK-60, ir SSK-60Luc ląstelių buvo izoliuotas sustabdantį į ISOGEN lizės buferio ląstelių (Nippon genų, Tojama, Japonija), po izopropanolio kritulių. Mes atlikome Mikrogardelė analizuoja du kartus, naudojant žmogaus genomo U133 Plus 2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Šios procedūros buvo atliekami pagal tiekėjo protokolus. Masyvų nuskaityta su GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), ir duomenys buvo analizuojami mikrogardeliq Suite 5.0 versija su Affymetrix numatytųjų analizės parametrus ir pasaulio mastelio kaip normalizavimo metodą. Iškirptas vidutinis tikslinės intensyvumas kiekvieno masyvo buvo savavališkai nustatyti iki 1000. Visos mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į MIAME atitinkančio duomenų bazės, GEO; prisijungimas skaičius GSE53276. Iki 2 kartų kaita, 684 genai buvo pasirinktas kaip specifinių genų už 60As6 ir 60As6Luc ląstelių, ir 1150 genai buvo atrinkti SAK-60 ir SAK-60Luc ląsteles.

Animal eksperimentai

Šeši -week-amžiaus patelė C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) pelės (CLEA Japonija, Japonija) buvo veisiami ne kambario temperatūroje 12 val šviesumo /tamsumo kasdien ciklą. Pelėms buvo prižiūrimi pagal konkrečias patogenais neužkrėstų sąlygomis ir sterilias maisto, vandens ir narvus. 1 × 10 ^{4-1 × 10 6 vėžinių ląstelių buvo sustabdytos su 1 ml tirpalo fosfato buferio druskų tirpalo (PBS) ir tada įpurškiamas į pilvo ertmę naudojant 26 2/1-adata. Pelės buvo sveriami ir matuojamas kiekvieną savaitę. Poveikio žmonėms kriterijai įtraukti didelį kaupimosi pilvo ascitas, dusulys, pasišiaušusius plaukus, anemija, ar svorio viršija 10% pradinio svorio. Visi eksperimentai buvo atliekami laikantis etinių gairių Tarptautinės asociacijos skausmo tyrime ir buvo patvirtintas Etikos komiteto bandymus su gyvūnais Nacionalinio vėžio centro. buvo stengiamasi sumažinti skaičių ir bet kokį gyvūnų kančias naudojamas eksperimentų.}

AT-PGR

Viso RNR buvo išskirta sustabdant ląsteles į ISOGEN lizės buferiniame tirpale, po to izopropanolio kritulių. Pusiau kiekybinis AT-PGR buvo atliekama per tiesinio intervalo nuo 25 iki 30 ciklų MUC5AC pervežimas CXCR4 pervežimas CXCR7 pervežimas CXCL12
, LGR5
TGFBR1
TGFBR2
, ir ACTB
naudojant šiuos pradmenis: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 "ir 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "už MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3" ir 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 "už CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3" ir 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 "už CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 "ir 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3" už CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 "ir 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3" už LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 "ir 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3" už TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 "ir 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3" už TGFBR2
ir 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 "ir 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3" už ACTB
.

imunocitocheminiais

Netiesioginis fluorescencinė imunocitocheminiais buvo atlikta CXCR4, MUC5AC ir Smad2 /3 dėl auginamų 4 bei kamerinių skaidres ląsteles. Ląstelės buvo nustatyta 4% paraformaldehido kambario temperatūroje 20 min. Po tris kartus plaunant PBS (-), jie buvo inkubuojami su anti-žmogaus CXCR4 monokloninis antikūnas (R & D sistemos, Mineapolis, MN) anti-žmogaus MUC5AC antikūnas (Santa Krusas Biochemija, Santa Krusas, Kalifornija), arba anti- žmogaus Smad2 /3 antikūnas (BD biomokslai, Bedford, MA), po to inkubacijos su 1: 1000 praskiedus asilas anti-pelės Alexa 488-konjuguoto serume (Invitrogen, Grand Island, NY) už 1 val kambario temperatūroje. Mobilaus ryšio branduoliai buvo tamsintas su 4 ", 6-diamidino-2-fenilindolo dihidrochlorido (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ląstelės Lineage tyrimą, surūšiuoti vieną CXCR4 ^{+ mažos ląstelės buvo susitepę CellTracker žalia (Invitrogen) norint nustatyti gyvybingų ląstelių.}

tėkmės citometrijos ir ląstelių rūšiavimo

60As6 ląstelės (1 × 10 ^{6 ląstelės) buvo bendrai inkubuojami 30 min, esant 4 ° C temperatūroje su šių antikūnų: APC anti-žmogaus CD184 (CXCR4) (IgG2a, klonas 12G5) arba APC Pelės IgG2a, k izotipo kontrolės gaunamas iš BioLegend ( San Diego, CA). Negyvosios ląstelės buvo paženklinti propidiumo jodido ir pašalinti iš analizės. Ląstelių rūšiavimo, CXCR4-teigiamas ir neigiamas CXCR4 pogrupius buvo išgrynintas naudojant JSAN ląstelių rūšiavimo (įlanka biologijos, Kobė, Japonija), ir buvo analizuojami programinę įrangą, FlowJo (medis Star Inc, Ashland, OR). Už ląstelės ciklo analizes, ląstelės buvo perkelti į serumo neturinčioje terpėje už 5 dienas, ir vėliau išaugintų su 0,05% tripsinu-EDTA, ir po to suspenduojamas šalto 80% etanolio. Po to, kai nustatantis per naktį -20 ° C temperatūros, mėginiai buvo išplautos PBS (-) ir inkubuojami 500μl PI /RNaze Dažymo buferis (BD Pharmingen, San Diego, CA) už 1 × 10 6 ląstelės 30 min kambario temperatūra prieš analizę. Tėkmės citometrijos buvo atliekama naudojant FACSCalibur (BD, Franklin ežerų, NJ), ir analizuojami programinę įrangą, FlowJo.}

Ankoridžas nepriklausomas ląstelių augimą tyrimas

minkštas agaras kolonija formavimas tyrimas buvo atliktas naudojant CytoSelect 96 šulinėlių Mobilusis transformacijos tyrimą rinkinį (Mobilieji BioLabs, San Diegas, CA) po gamintojo nurodymus. Trumpai, 5 × 10 ^{3 CXCR4 teigiamos arba CXCR4-neigiamas mažos ląstelės buvo sustabdytos DMEM, kurių sudėtyje yra 0,4% žemos lydymosi temperatūros agarozės ir 10% FBS ir pasėjamos į 1% žemos lydymosi temperatūros agarozės, kurių sudėtyje yra DMEM ir 10% FBS. Po to, kai inkubavimą 5 dienas ląsteles 37 ° C temperatūroje 5% CO _{2, ląstelės buvo lizuojamos ir aptinkamas kartu su CyQuant GR dažų. Iš kolonijas sudarančių ląstelių fluorescencija buvo skaitoma Daugiafunkcinis microplate skaitytuvas (Safire, TECAN, Männedorf, Swizerland) ne sužadinimo /išmetimo bangų ilgių 485/520 nm.}}

invazija tyrimas

Mobilusis invazija buvo nustatoma naudojant BD BioCoat naviko invazija tyrimo sistema (BD biomokslų) pagal gamintojo nurodymus. Trumpai, 4 × 10 ^{5 60As6 ląstelių, turinčių laikmenų be serumo buvo pasėjamos į viršutinį kameroje sistemos. Apačia šuliniai buvo užpildyti su žiniasklaida su 10 ng /ml, SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija). Po 24 val inkubavimo Aukštutiniame kambaryje ląstelės buvo pašalintos ir ląstelės įsiveržė per Matrigel membrana buvo tamsintas su DA-Quick dėmių (BD Biosciences) ir skaičiuojami rankiniu būdu.}

kaspazės tyrimas

Pateikti 60As6 ląstelės buvo paruošti 96-šulinėlių plokštelės (5 × 10 ^{3 ląstelių /gerai). Kaspazės 3/7 tyrimas buvo atliktas naudojant kaspaze GLO 3/7 tyrimas (PROMEGA, Madison, WI) po 24 val po to, rekombinantinis TGF-β1 to (240-B, R & D sistemas) į ląstelių kultūrą iš 2 ng /ml koncentracija.}

Mobilusis augimo tyrimai

Norėdami nustatyti IC _{50 vertės prieš docetakselio (DOC), abu HSC-60 ir 60As6 ląstelės buvo auginamos dalyvaujant 0-100 nM Dok (Aventis Pharma, Tokijas, Japonija) 4 dienas 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 po įprastiniu būdu per MTT. Siekiant patvirtinti sudėtinį gydymą su Doc ir TGF-beta, visi 60As6 ląstelių ir 2 pirminių kultūrų (NSC-16C ir -22C) buvo gautas 6-šulinėlių plokštelės (1 × 10 ^{5 ląstelių /gerai), po to gydymas su Doc (2,5 nM) ir TGF-β1 (0 arba 2 ng /ml) 72 val 37 ° C temperatūroje 5% CO 2. Ląstelės buvo susitepę Trypan mėlyna ir skaičiuojamas TC20 automatizuotos ląstelių skaitiklis (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statistinė analizė

Visi duomenys buvo išreikštas vidurkis ± SE ir analizuojami naudojant neporinis t-testą. Priimtas reikšmingumo lygmuo P
< 0,05. SPSS (SPSS, Čikaga, IL) buvo naudojamas visų statistinės analizės.

Rezultatai

Fenotipinė skirtumai tarp tėvų SAK-60 ląstelių ir labai tumorogeniškas SubLine 60As6 ląstelių

Jei spręsti difuzinis tipo GC susijęs PD nuo molekulinės ir ląstelių biologijos požiūriu reiškinį, mes sukūrėme labai peritoninė-metastazavusiu ląstelių liniją, 60As6, iš pasklidųjų tipo GC gautų ląstelių linijos, HSC-60, per in vivo
pasirinkimai sudaryti iš orthotopic Sėjimas į vėžinių ląstelių ir labai metastazavusiu tie atskirai nuo imuninės pelių [25] ascitas. Nors padvigubinti laikas iš šių dviejų ląstelių linijų buvo panaši (30 val už SAK-60 ir 31 val už 60As6) in vitro
, 60As6 ląstelės susiformavo daug auglių mazgeliai greičiau po pilvo ertmę suleistas į pelių. Išgyvenamumo mediana laikas buvo 167 dienų po implantacijos 5 × 10 ^{6 SAK-60 ląstelių, o iš to paties skaičiaus 60As6 ląstelių implantacija lėmė nepaprastą formavimo kruvinų ascitas ir mediana buvo tik 28 dienų. Ankoridžas-nepriklausomumas gali būti reikalingas nemokamas vėžinių ląstelių pilvaplėvės ertmę ir kolonizacijos išlikimui. Kolonijas formavimosi tyrime, 60As6 ląstelės susidaro daug daugiau kolonijų, palyginti su SAK-60 ląstelių (S1 pav), įrodančiais, kad 60As6 turi aukštą gebėjimą tvirtinimo nepriklausomas augimą. Mes patvirtinęs Atsparumas cheminėms taip pat žinomas kaip pagrindinis turto CSCS. Ląstelės buvo kultivuojamos docetakselio buvimą (Doc), kuris yra dažnai dirba priešvėžinis vaistas GC pacientų gydymui. 60As6 parodė 6 kartus didesnis IC _{50 vertę Doc palyginti su SAK-60 (52 Nm ir 8,4 nM) (S2 pav). Šie duomenys rodo, kad 60As6 įgijo aukštą chemoterapijai atsparia fenotipą. Be to, SAK-60 ląstelių morfologija buvo apibūdinamas kaip plokščias ir didelis, o kad 60As6 ląstelių buvo pusiau kintamos, ir mažas, kuris yra panašus į morfologijos dažnai stebimas CSCS (S3 pav). Mes šalia išnagrinėjo lipidų plaustai lokalizacija naudojant choleros B toksiną subvieneto (CtxB) kaip lipidų plaustas persekiotoją, nes ji jau buvo pranešta, kad lipidų plaustas klasteriai buvo prisodrintas kraujodaros kamieninių ląstelių [29]. buvo pastebėta 60As6 ląstelių, bet ne SSK-60 kad, fluorescentinės CtxB kaupimas, rodo kitą CSC-kaip turtą buvusiems ląstelių (S3 pav).}}

Jei vertinti biologinius skirtumus SSK-60 ir 60As6 ląstelės, mes palyginti genų ekspresijos, profilius mikrogardelių analizės (S1 lentelė). Žemyn reguliavimo trijų skrandžio kasyklų ląstelių diferenciacijos žymekliai ( MUC5AC
MUC1
, ir TFF1
) ir kai citokeratinams buvo rasti 60As6. Priešingai, keletas kamieninių ląstelių žymenys (, LY75
CD44
GPNMB
, ir CXCR4
) buvo aktyvinama šiame ląstelių linija. Sąvoka profilis rodo, kad 60As6 turi stiprią mezenchiminių fenotipą, kuris yra epitelinių ląstelių pagamintų CSCS charakteristika.

toliau nagrinėjo iRNR išraišką tiek tipiškas diferenciacijos persekiotoją MUC5AC pervežimas [3 4] ir metastazių susijęs chemokino receptorius, CXCR4
[30] RT-PGR. Pagal mikrogardeliq rezultatus MUC5AC parsisiųsti ir CXCR4
mRNR parodė abipusiai išskirtinę išraišką SSK-60 ir 60As6 (pav 1A). Chemokinų SDF-1 užkoduotas CXCL12
yra žinoma, kad jungiasi CXCR4 ir jo specifiniu receptorių CXCR7 [30]; Tačiau iRNR, CXCL12 parsisiųsti ir CXCR7
nebuvo aptikta arba ląstelių linija. Tiek MUC5AC ir CXCR4 sąvoka taip pat buvo patvirtinta baltymų lygio imunocitocheminiam dažymo (pav 1B). Taigi, šie rezultatai rodo, kad SAK-60 ląstelių uostą dažniau diferencijuotas ląsteles nei daryti 60As6 ląstelių, kurios yra daugiausia sudaryti iš nediferencijuotose ląsteles. Kartu paėmus, visi šie "CSC panašios charakteristikos 60As6 rodo, kad nediferencijuotą subpopuliacija su dideliu tumorogeniš- ir narkotikų atsparumas gali būti efektyviai praturtintas iš tėvinės ląstelės metu in vivo
pasirinkimus.

identifikavimas ir charakterizavimas skrandžio CSCS į 60As6 ir pradinių išaugintų ląstelių

Mes šalia išnagrinėjo CXCR4 vaidmenį difuzinis tipo GC ląsteles PD. Kaip parodyta pav 1A, receptoriaus CXCR4
buvo labai išreikštas 60As6 palyginti su SSK-60, o jų ligando CXCL12 /SDF1
buvo ne abiem. Tačiau, reikia pažymėti, kad šis ligandas yra žinoma, kad būti išreikštas pilvaplėvės mesothelial ląstelių [31] ir veikti kaip chemokino sukelti toli metastazių per sąveikos su CXCR4 išreiškiančias, iš vėžinių ląstelių [30]. Todėl mes išnagrinėti, ar CXCR4 gali tarnauti kaip nustatyti PD-susijęs CSCS persekiotoją. Iš CXCR4 išraiška 60As6 ląstelių buvo analizuojami fluorescencija aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS) analizė. Pasak CXCR4 saviraiškos ir pirmyn išsklaidymo modelį, 60As6 ląstelės eksponuojami heterogeniškumas, susidedanti iš trijų skirtingų gyventojų grupėms: I. CXCR4 ^{+ maži kūneliai (15%), II. CXCR4 - mažos ląstelės (65%), ir III. CXCR4 - didelės ląstelės (20%) (pav 1Ci). Po to ląstelės buvo atskirtos, kad kiekvienos amžiaus grupės su I grynumo: 97%, II: 99%, ir III: 54%, atitinkamai (pav 1Cii-1Civ). Mažas rūšiavimas grynumas CXCR4 - didelis ląstelių subpopuliacija III buvo priskirtinos užteršimo apibendrintą CXCR4 - mažos ląstelės (pav 1Civ, juoda-supakuota grupė). Tarp šių trijų gyventojų grupėms, tik CXCR4 - didelis ląstelių subpopuliacija esančius MUC5AC + diferencijuotos ląstelės (pav 1Civ trys plokštėmis). Iki ląstelių augimo stebėsenos vieno ląstelių lygyje, buvo nustatyta, kad CXCR4 - mažos ląstelės padaugėjo, o CXCR4 - didelės ląstelės nebuvo atlikta ląstelių dalijimąsi net 3 dienas po to, kai kultūros (pav 1D ir S4 pav). Šie rezultatai rodo, kad CXCR4 - mažos ląstelės yra laikinas stiprinančių ląstelių, o CXCR4 - didelės ląstelės mirtinai diferencijuoti ląsteles}

Po rūšiavimo du pogrupis (I ir II), mes analizuoti. bet kurį iš ląstelių populiacijos (pav 2A) perėjimas; po 7 dienų kultūrą. CXCR4 ^{+ mažos ląstelės, atitinkantys pogrupį Aš generuoja patys, CXCR4 - mažos ląstelės, ir CXCR4 - didelės ląstelės (11%, 62% ir 21%, atitinkamai), o CXCR4 - mažos ląstelės, atitinkantys pogrupį II galėjo sukelti daugiausia sau (80%) su kai kurių didelių ląstelių (17%) ir labai mažai CXCR4 + mažų ląstelių (2%). Šie rezultatai rodo, kad CXCR4 + mažos ląstelės turi diferenciacijos potencialą ir gaminti CXCR4 - didelės ląstelės galbūt iš CXCR4 etape -. Mažų ląstelių ląstelių diferenciacijos sistemos}

Be to, CXCR4 ^{+ mažas galvaniniai parengė kolonija, kuriame MUC5AC + diferencijuotos ląstelės po 7 dienų kultūroje (pav 2b). Ši išvada parėmė ląstelių linijos testo kartu su gyvų ląstelių dažymosi ir imunodažymu iš MUC5AC (pav 2C). Be to, CXCR4 + mažos ląstelės buvo parodyta išreikšti aukšto lygio LGR5
, kuri yra žinoma kaip skrandžio epitelio kamieninių ląstelių, esančių po įprastinio gleivinės liaukos [32] (pav 2D persekiotoją ).}

Be to, mes patvirtinti tvirtinimo nepriklausomybę ir navikų susidarymą galimybę iš dviejų mažų ląstelių pogrupį (I ir II). Kolonijoje formavimosi tyrime, CXCR4 ^{+ mažas ląstelių susidaro daug daugiau kolonijų nei padarė CXCR4 - mažas ląstelių (pav 3a). Serijos atskiesti eksperimentai pilvaplėvės ertmę, suleistas, turintiems imuninės pelėmis parodė, kad CXCR4 + mažos ląstelės taip pat turėjo didesnę tumorogeniškas gebėjimai (naviko vystymąsi 4/5 ir 1/5 pelėms upon suleistas 10 5 ir 10 4 ląstelės, atitinkamai), palyginti su CXCR4 - mažų ląstelių (1/10 ir 0/10 pelėmis 10 5 ir 10 4 ląstelės, atitinkamai) (pav 3Bi). Pažymėtina, kad visi penki naviko guolis pelės po Sėjimas CXCR4 + mažos ląstelės turėjo kelis auglio mazgelių (pav 3Bii) ir pradėjo kurti kruvinų ascitas per 3 savaites (pav 3Biii).}

Be difuzinis tipo GC ląstelių linijas, mes taip pat tyrė CXCR4 vaidmenį, klinikinio mėginio (NSC-20c): įsteigta nuo difuzinio tipo GC pacientui PD ascitas pagrindinį kultūrą. Be RT-PGR ir imunodažymu eksperimentų, buvo patvirtinta, kad pagrindinis kultūra išreikšti CXCR4
bet ne CXCR7
(pav 3C). Svarbu tai, kad CXCR4 ^{+ maži rūšiuojami nuo NSC-20C ląstelės turėjo tiek pakartotinos populiacijos gebėjimą (pav 3Di ir 3Dii) ir aukštos kolonija formavimo galimybes (pav 3Diii).}

dalyvaujant CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 ašis PD

kitų šešių difuzinis tipo GC kilęs ląstelių linijas (SAK-39, SAK-44, 44As3, SAK-58, 58As9 ir KATO III), mes toliau nagrinėjo tarp santykius išraiška statusas du CXCL12 /SDF-1 receptorių (CXCR4 ir CXCR7) bei ascitas kaupimosi pelių paskiepytas vėžinių ląstelių pilvaplėvės ertmę. RT-PGR eksperimentai parodė, kad du GC ląstelių linijas (HSC-39 ir KATO III) labai išreiškė CXCR4
(pav 4A). Be to, abu šie xenografted pelių turėjo kelis auglio mazgų ir sukauptus ascitas (pav 4b). Priešingai, kitos dvi ląstelių linijos (HSC-44 ir HSC-58) parodė ne arba gana žemas CXCR4 išraiška, vieną ar keletą peritoninė naviko mazgelis ir nebuvo sukaupti ascitas (pav 4b). Mes taip pat patvirtino, ascitas kauptis kitoje labai pilvaplėvės metastazių SubLine 58As9 (iš SSK-58), kuris išreiškiamas CXCR7
aukšto lygio, bet ne CXCR4
. Vienas išimtinis atvejis buvo 44As3 kilęs iš HSC44 kad turėjo keletą vėžinių mazgų ir sukauptus ascitas be tiek išraiškos CXCR4 parsisiųsti ir CXCR7
. Apskritai, mes nustatėme aukštą koreliaciją tarp ekspresijos lygį, CXCR4
arba CXCR7
ir agresyvūs fenotipų septyniose iš aštuonių ląstelių linijų, išskyrus 44As3.

klinikinėje praktikoje , pilvaplėvės plovimas citologija (CY) suteikia svarbią prognostinę informaciją GC pacientams, nes tai gali aptikti "sėkla" PD iki jo makroskopinis apraiška. Net tais atvejais, be jokių PD (P0), CY-teigiami pacientai turi prastą prognozę [33], o tai rodo, kad nemažai metastaziniai CSCS buvimą pilvaplėvės plovimas šių pacientų. Todėl kitą kartą tyrė CXCR4 ^{+ GC ląstelių buvimą pilvaplėvės nuoplovose iš pacientų, klinikai reikšmingos ascitas. CXCR4
iRNR buvo retai aptinkama skalbimų 9 iš 10 CY-neigiamų pacientų; Tačiau, mRNR buvo aptikta, praplovimo 19 iš 34 CY-teigiamų pacientų (S5A pav). Mes taip pat patvirtino, kad CXCR4 ir citokeratino dukart teigiamos mažų GC ląstelių buvimą akmenimis formos mesothelial ląstelių pridedamas prie kultūra indų paviršiaus per trumpą laiką (7 dienos) kultūra paciento ascitu (S5B pav). Mūsų eksperimentų, pilvaplėvės mesothelial ląstelės paprastai dingo ilgalaikės kultūros maždaug po vieną mėnesį. Tokiu ilgalaikės kultūros, mes taip pat nustatė, kad kai kurios CXCR4- ar CXCR7-labai teigiamų GC ląstelių buvimą, kad parodė dėl epitelio-mezenchiminių perėjimo, vimentin charakteristikos (VIM) -positive (rodyklė galva S5C pav), bet citokeratino (PAN ) neigiamojo. Todėl CXCR4 + GC ląstelės yra išlikę piktybinių ascitas ne tik anksti peritoninės sklaidos taisykles (P0 /CY +), bet ir daugiau laipsniškai išsiskyrusių atvira ascitas kaupimosi. Apibendrinant, pirmiau eksperimentiniai ir klinikiniai duomenys rodo, kad iš CXCR4 dalis + arba CXCR7 + GC ląstelės turi potencialą plėtoti peritoninė metastazes.}

Kitas ištirti funkcinį vaidmenį CXCR4 signalizacijos kelią į PD. Žodžio CXCL12
/ SDF-1
žmogaus ir pelės peritoninės mesothelium buvo patvirtinta RT-PCR (pav 5a). Todėl buvo tiriama iš CXCL12 /SDF-1 dalyvavimas ląstelių invaziją. Kaip parodyta Fig 5B, invazinių 60As6 ląstelių skaičius buvo žymiai padidėjo SDF-1, tai rodo, kad šios ląstelės turi chemotaksio gebėjimą SDF-1. Lentiviruso shRNR sukeltas parbloškimo iš CXCR4 į 60As6 susilpnintas SDF-1-medijuojamos invazija bet neturi įtakos naviko mazgelis susidarymą pilvaplėvės ertmę pelių (neparodyta). Be to, priversti CXCR4 ekspresiją vaiko ląstelių linijos SSK-60 niekada padidėjo tumorogeniš- (neparodytas). Kartu paėmus, mūsų duomenys rodo, kad CXCR4 dalyvauja tvirtinimo prie pilvaplėvės bet ne auglys gumbelių formavimąsi.

Mes parodėme schematiškai procesus tiesiogiai PD iš skrandžio sienelės pažangių GC pacientų per tarp CXCR4 sąveika ^{+ arba CXCR7 + CSCS ir SDF-1-išreikšti pilvaplėvės (pav 5C). Pirmos pakopos metastazių, CXCR4 + CSCS buvo mesti iš skrandžio sienos į pilvaplėvės ertmę. Vėliau, šios ląstelės pridėti prie pamatinės membranos (BM) pilvaplėvės reaguojant į mesothelium gautas chemoattractant SDF-1 ir kolonizuoti, kad susidarytų mazgus. Šie reiškiniai atsiranda daugelyje vietų per pilvaplėvės paviršiaus, todėl siurblio funkcijos-blokados ir tada iš ascitas kaupimosi.}

TGF-β skatina ląstelių diferenciacija /asimetriškas ląstelių padalinys CXCR4 + skrandžio CSCS

TGF-β buvo pranešta sumažinti šoninį gyventojų kai kuriose pasklidoji tipo GC ląstelių linijų [34]. Taigi, mes ištirti, ar TGF-β turi potencialą keisti iš CXCR4 ^{+ difuzinis tipo GC ląstelių savybes. Mes pirmą kartą išnagrinėjo raiškos lygius TGF- receptorius 60As6 ląstelių ir GC pirminių kultūrų, gautų iš dviejų nepriklausomų pacientų (NSC-16C ir -22C). AT-PGR tyrimai parodė, kad tiek iš dviejų TGF-β receptorių genų ( TGFBR1 parsisiųsti ir TGFBR2
) išreiškė visų šių ląstelių (P6 pav). Mes taip pat nagrinėjo SMAD2 /3 lokalizacijos, nes šie transkripcijos veiksniai yra plačiai žinoma, kad kaupiasi branduolių reaguojant į TGF-beta signalizacijos aktyvavimo. Kaip parodyta Fig 6Ai, branduolinės kaupimo SMAD2 /3 buvo aptikta 60As6 ląstelių po 30 min gydymo pradžios su 2 ng /ml TGF-beta.}

šalia ištirti, kaip CXCR4 ^{+ GC ląstelės yra įtakos TGF- signalizacijos aktyvavimo. RT-PGR eksperimentas parodė, kad sumažėjo, CXCR4
mRNR 60As6 iki TGF-beta gydymo (pav 6Aii). Tėkmės citometrijos analizuoja rodo, kad TGF-β gydymas mažina CXCR4 + mažas ląsteles nuo 6,3% iki 0,4% ir padidinti CXCR4 - dideli ląsteles nuo 17,1% iki 43,2% (pav 6b). Pagal, kurio terminiu būdu, diferencijuotos ląstelės augimą, kaspazės 3/7 į visą ląstelių populiacijos buvo aktyvuota TGF- gydymo (pav 6C). Todėl, TGF-β gali turėti potencialą sukelti CXCR4 + CSCS į nepagydomai diferencijuotų ląstelių. Mes toliau nagrinėjo TGF-beta poveikį nesidalinančius 60As6 ląstelių, nes CSCS yra manoma, kad egzistuoja ramybės būseną po hypovascular būklės. Po išeikvojimo 5 dienas serume, CXCR4 + mažos ląstelės padidėjo iki 42% (pav 6Di). Be to, didelė dalis 60As6 gyventojų buvo G1 fazės (pav 6Dii).}

• PLoS ONE: SIRT3 Pagerina Glikolizė ir platinimu SIRT3 ekspresija skrandžio vėžio Cells
• PLoS ONE: MicroRNA-137 Prisideda prie prislopinti tumorigenezei žmogaus skrandžio vėžio nukreipiant AKT2