PLOS NËMMEN: Umeldung an Characterization vun CXCR4-Positiv Gastric Cancer BTS Stammzellefuerschung

Wat VerfÜgung

Firwat-Typ staark erhéijen sinn dacks vun engem héijen Undeel komponéiert vun proliferating selten (dh, deenen) Kriibs Zellen, déi besot betraff der Bedeelegung vun Kriibs Stammzellen (CSCs) Obwuel diffusen-Typ gastric Kriibs (GC) Patienten hunn eng schlecht hätt wéinst héich-heefeg Entwécklung vun peritoneal Publikatioun (Haaptleit), ass et limitéiert Wëssen dass den Haaptleit-verbonne CSCs an Efficacitéit vun CSC-gezielt Therapie vun diffusen-Typ GC. An dëser Etude, gegrënnt mir metastatic GC Zell Linnen héichgradeg vun zu VIVO VerfÜgung Auswiel fir de Räichtum vun Haaptleit-verbonne GC Zellen entworf. Vun microarray Analyse, fonnt mir CXC chemokine receptor Typ 4 (CXCR4) kënne fir héich metastatic CSCs engem Roman Bissau ginn, well CXCR4-positiv Zellen Hafen-onofhängeg wuesse kann, lancéieren erhéijen am Mais, bis cytotoxic Drogenofhängeger resistent ginn, an ënnerscheet Duechter produzéiere Zellen. An Medeziner Echantillonen, goufen dës CXCR4-positiv Zellen aus net nëmmen spéiden Metastasen Etapp (alldeeglech ascites) mee och éischter Etapp (peritoneal Skeletten) fonnt. Desweideren, Behandlung mat Wuesstem Faktor-β transforméiert verstäerkte der Anti-Kriibs Effet vun docetaxel via Aféierungs- vun Zell dat /asymmetric Zell Divisioun vun der CXCR4-positiv gastric CSCs souguer zu engem deenen Staat. Dofir, schätzen verspriechen dat inducers fir aus Moment sinn Anti-Kriibs Drogen duerch nei-Vëlos vun CSCs de Maximum therapeutesch Resultat Maîtrise VerfÜgung

Fro:. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi hun, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Umeldung an Characterization vun CXCR4-Positiv Gastric Cancer BTS Stammzellen. PLoS NËMMEN 10 (6): e0130808. Doi: 10.1371 /journal.pone.0130808 VerfÜgung

Redakter: Masaharu Seno, Okayama University, Japan VerfÜgung

Arnaque: 18. Februar 2015; Akzeptéiert: 25 Mee, 2015; Publizéiert: 25. Juni 2015 VerfÜgung

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dëst ass eng oppen Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz CC BY verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt si vum original Auteur an d'Quell Kaiser VerfÜgung

Data Disponibilitéit: All Daten sinn bannent de Pabeier a seng Ennerstëtzung Informatiounen Fichieren. All d'microarray Date goufen vun engem MIAME diversifiéiert Datebank, Geo agereecht; Bäitrëtt Zuel GSE53276 VerfÜgung

Funding:. Dëst Wierk war am Kader vun der National Institut vun Biomedical Innovation (fir d'Détailléiert Fuerschung fir Medical Produkter Biergbau Programm ID10-41), de Gesondheetsministère, Labour an Wuelergoen vun Japan ënnerstëtzt (fir den Drëtte Aneneegräifend 10-Joer Strategie fir Cancer Control H22-007), National Cancer Center Fuerschung an Entwécklung Fund (25-a-6, 26-a-3). Drs T Fujita, M Tamaoki an T Nishimura sinn d'Bezéier vun enger Research Residentepräiser Gemeinschaft vun der Fondatioun fir Promotioun vu Cancer Research zu Japan VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs (GC) ass eent vun de bedeitendste Ursaachen vun Kriibs-Zesummenhang Doudesfäll weltwäit. Histopathologically, kann GCs an zwou grouss Kategorien séiert ginn: intestinal-Typ an diffusen-Typ. Intestinal-Typ GC predominates an héich-Risiko geographescher Beräicher an entwéckelt duerch eng mi Etappen dorënner Helicobacter pylori VerfÜgung ( H VerfÜgung. pylori VerfÜgung) -associated atrophic gastritis, intestinal metaplasia (IM), an dysplasia. Par contre, diffusen-Typ GC, dee fir d'Halschent vun all GC Patienten Konten, huet eng grouss geographesch Verdeelung a wiisst och vun H VerfÜgung. pylori VerfÜgung -free, morphologically normal gastric mucosa ouni atrophic gastritis oder IM, an diffusen-Typ GC kann aus der intestinal-Typ ënnerscheeden zwou genetesch a phenotypically [1-5]. Anescht wéi de falender Heefegkeet vun der intestinal-Typ, déi prevalence vun der diffusen-Typ ass waarden Berichter weltwäit [6]. Iwwregens hätt fir fortgeschratt diffusen-Typ GC Patienten huet eng héich Taux vun peritoneal Publikatioun (Haaptleit) (78%) aarmséileg iwwert dat lescht Joerzéngt bleift, well vun Verglach zu deem vun intestinal-Typ (45%) [7]. Besonnesch, Patienten mat Bormann Typ IV GC eng extrem schlecht hätt, och wann se multidisziplinärem Behandlung [8] krut. Dofir, Haaptleit adresséieren ass eng dréngend Fro fir Verbesserung vun der Iwwregens hätt vun diffusen-Typ GC Patienten. VerfÜgung

Firwat-Typ GCs ginn normalerweis duerch eng extensiv stromal fibrosis mat aarmséileg vascularity a rare proliferative charakteriséiert ( i
. e VerfÜgung. deenen) Kriibs Zellen, déi zu engem Groussdeel therapeutesch Resistenz féiert. Vun der Embryone vun Chimiotherapie, transforméiert Wuesstem Faktor β (TGF-β) geduecht gouf, fir den aggressive Werdegang via epithelial-mesenchymal Transitioun an duerch Pinguin fibrosis [9] ze bedeelegen. Allerdéngs, TGF-β bremst och Zell Prolifératioun, induces apoptosis, an mediates dat am epithelial Zellen, suggeréiert, dass Deeler vun der TGF-β sécher Weeër entholl-suppressive Aktivitéit zu epithelial erhéijen hunn [10, 11]. Obwuel aktueller Beweiser déi kritesch Roll vun TGF-β an Kriibs Stammzellenfuerschung (CSC) Biologie bewisen huet, ass et limitéiert Informatiounen iwwert hir Roll an diffusen-Typ GCs. VerfÜgung

Et gemellt gouf, datt all Awunner vu entholl Zellen funktionell heterogeneity weisen déi verschidde Prolifératioun an dat Muecht an diversen Zorte vun erhéijen charakteriséiert [12]. Fir Kont fir esou entholl heterogeneity, zwee Modeller hunn proposéiert ginn: d'clonal Evolutioun Modell [13] an der CSC Modell [14]. De Fonds Modell huet grouss Opmierksamkeet kritt, well se eng räsonnabel Erklärung fir Resistenz ze konventionell chemo- an radiotherapy stellt, an deen quiescent oder luesen-Vëlos CSCs iwwerlieft, a Resultater am eventual entholl Réckwee [15-17]. Dofir, fir therapeutesch Strategien Zil- CSCs Imperativ sinn Reschtoffall Krankheet ze stellen an net nëmmen GC Terrain ze verhënneren, mä och aner Cancers. Ausserdeem, mat aktuellen Abléck an der bewosst Mechanisme vun carcinogenesis, ass de metastatic Potential vun entholl Zellen ze CSCs zougeschriwwen, deen clonally entholl Équipe um wäit Siten [18 19] lancéieren kann. Obwuel eng Zuel vun Molekülle Zell Uewerfläch wéi CSC lues zu enger grousser Villfalt vu mënschlechen malignancies proposéiert ginn, et zu GCs fir Haaptleit-verbonne CSCs kee Bewaacher Identifikatioun [20-23] gouf. Fir sou lues identifizéieren, als mir d'Notioun dass System a genetesch heterogen erhéijen hunn gemeinsam an Ausriichtung Mechanisme vun entholl Ënnerhalt no de Kontext vun enger bestëmmter microenvironment. An anere Wierder, Hypothes mir dass CSCs soll System vum Gutt-validéiert assays wéi zu VIVO VerfÜgung Transplantatioun definéiert ginn. An diffusen-Typ GC, do hu mer am Ufank op der peritoneum-spezifesch Kolonisatioun vun Zellen a beräichert den Haaptleit-verbonne CSCs vun widderhuelen zu VIVO VerfÜgung Zorten [24, 25]. Hei, fonnt mir CXC chemokine receptor Typ 4 (CXCR4) eng Bewaacher fir Haaptleit-verbonne gastric CSCs kann a bewisen, dass TGF-β d'Efficacitéit vun Anti-entholl Drogen via Aféierungs- vun Zell dat /asymmetric Zell Divisioun an der CXCR4 verbessert + CSC Populatioun souguer zu engem deenen Staat. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Séminairen Echantillon VerfÜgung

Séminairen Echantillon vun der National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan) an der Maîtrise gëtt sech schrëftlech informéiert Zoustëmmung vun all Patient an Akraafttriede vum National Cancer Center Finanzpolitiker Kritik Verwaltungsrot (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031). VerfÜgung

Zell Linnen an alleréischter Kulturen VerfÜgung

E Mënsch GC Zell Linn, HSC-60 gouf vun engem Fall etabléierten d'Prozedur mat wéi virdru beschriwwen [26]. Eng héich peritoneal-metastatic Zell Linn, war 60As6 aus HSC-60 etabléierten orthotopic Otemschwieregkeeten ofgestouss an SCID /SCID Mais mat sou kuerz folgendermoossen: d'xenografted entholl vun HSC-60 Zellen an der gastric Mauer vun enger Maus transplantéiert war. Mir widderholl sechs Zykle vun Wäilies ascitic entholl Zellen an der orthotopic inoculation vun deenen Zellen. Dës zwee Zell Strecken an eng RPMI-1640 mëttelfristeg haten mat 10% An et Kallef serum ergänzt. Mir etabléierten och zwee luciferase-ausdrécken Zell Linnen (HSC-60Luc an 60As6Luc). Sechs aner GC-ofgeleet Zell Linnen (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, a Kato III) goufen och ënnert der selwechter Conditioun haten. Vun deene sechs, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, an 58As9 sech duerch d'uewen Prozedur etabléierter [27, 28], a Kato III gouf vum amerikaneschen Type Kultur Collection kritt. Fir Primärschoul Kulturen, vu Patienten peritoneal Skeletten an ascites (NSC-16C, NSC-20C, an NSC-22C) an cultured an eng RPMI-1640 mëttelfristeg Zellen sech mat 10% An et Kallef serum nà gesammelt. VerfÜgung

Microarray Analyse VerfÜgung

Total RNS vun 60As6, 60As6Luc, HSC-60, an HSC-60Luc Zellen war vun ageliwwert den Zellen an eng ISOGEN lysis Prellbock (Nippon Gene, Toyama, Japan), gefollegt vun isopropanol Nidderschlag isoléiert. Mir gehaal microarray Analysë zweemol duerch Mënscherechter Genom U133 Plus 2.0 Singular benotzt (Affymetrix, Santa Clara, CA). D'Prozedure goufen no der Ëmwelt- 'Fournisseuren gehaal. D'flamenden Ofgrond sech mat engem GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) gescannt, an d'Date goufen duerch Microarray Suite Versioun 5.0 mat Affymetrix Default Analyse Astellungen a global mateneen als normalization Method analyséiert. D'Trierweiler mengen Zill Intensitéit vun all Partie war mutwëlleg gesaat 1000. de All microarray Donnéeën hunn an engem MIAME diversifiéiert Datebank, Geo verschéckt ginn; Bäitrëtt Zuel GSE53276. Vun engem 2-fantastesch änneren, goufen 684 Genen als spezifesche Genen fir 60As6 an 60As6Luc Zellen ausgewielt, an 1150 Genen huet fir HSC-60 an HSC-60Luc Zellen ausgewielt. VerfÜgung

Déieren Experimenter VerfÜgung

Six -week-al weiblech C.B17 /Icr-scid (SCID /SCID) Mais (Clea Japan, Japan) sech mat engem 12 h Liicht /donkel Dag Zyklus op enger Raumtemperatur flegelhaft. De Mais goufen ënner bestëmmten pathogen-gratis Konditiounen haten a gëtt steril Liewensmëttel, Waasser, an Käfeg. 1 × 10 4 bis 1 × 10 6 vun Kriibs Zellen mat 1 ml vun phosphate-gefiermt Salins (PBS) an dann heijen der postwendend misse Discours vum Gebrauch vun engem 1 26/2-Jauge Nol suspendéiert goufen. Mais sech gewien an Wochenzeitung gemooss. Humane Endpunkt Kritären agebaut bedeitendst Heefung vun postwendend misse ascites, dyspnea, piloerection, anemia, oder Gewiichtsverloscht vun 10% vun initial Gewiicht erausgeet. All Experimenter waren am Aklang mat der ethesch Normen vun der International Association vun der Sécuritéit vun Pain gehaal, a sech duerch de Komitee fir Ethik an Déieren trotzdeem vun der National Cancer Center guttgeheescht. Efforte gemaach goufen d'Zuelen an all Leed vun Déieren an d'Experimenter benotzt ze minimiséieren. VerfÜgung

RT-Hinnen alleguer VerfÜgung

Total RNS vun ageliwwert den Zellen an eng ISOGEN lysis gefiermt gefollegt vun isopropanol Nidderschlag isoléiert huet. Semi-grouss RT-Hinnen alleguer war bannent linear Gamme vu 25 bis 30 Zykle fir MUC5AC VerfÜgung duerchgefouert, CXCR4 VerfÜgung, CXCR7 VerfÜgung, CXCL12 VerfÜgung, LGR5 VerfÜgung, TGFBR1 VerfÜgung, TGFBR2 VerfÜgung, an ACTB VerfÜgung mat folgenden primers: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'an 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "fir MUC5AC VerfÜgung, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'an 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3" fir CXCR4 VerfÜgung, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' an 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 "fir CXCR7 VerfÜgung, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'an 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3 "fir CXCL12 VerfÜgung, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3' an 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3" fir LGR5 VerfÜgung, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'an 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3 "fir TGFBR1 VerfÜgung, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3' an 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3" fir TGFBR2 VerfÜgung, an 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'an 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3 "fir ACTB VerfÜgung. VerfÜgung

Immunocytochemistry VerfÜgung

Indirekt unisse immunocytochemistry war fir CXCR4 gesuergt, MUC5AC, an Smad2 /3 op zu 4-gutt Chambre drënner ugebaut Zellen. Zellen sech fir 20 min zu 4% paraformaldehyde bei Raumtemperatur fest. (R & D Systemer, är ganz Famill, Punktzuel) - no dräi Mol am PBS wäschen (), waren se mat anti-Mënsch CXCR4 monoclonal antibody incubated, anti-Mënsch MUC5AC antibody (Santa Cruz Biochimie, Santa Cruz, CA), oder anti- Mënsch Smad2 /3 antibody (BD Biosciences, Bedford, MA) gefollegt vun incubation mat engem 1: 1000 dilution vun Esel anti-Maus Alexa 488-conjugated serum (Invitrogen, Grand Island, NY) fir 1 HR bei Raumtemperatur. Zell Käre sech Kierchefënster mat 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (Invitrogen, Karlsbad CA). Fir Zell-antike assay, zortéiert Single CXCR4 + kleng Zellen sech Kierchefënster vun CellTracker Green (Invitrogen) fir d'Statioune Zellen nogezunn. VerfÜgung

Flow cytometry an Zell zortéieren VerfÜgung

60As6 Zellen (1 × 10 6 Zellen) mat der folgender antibodies bei 4 ° C fir 30 min Co-incubated waren: aus BioLegend kritt APC anti-Mënsch CD184 (CXCR4) (IgG2a, Klon 12G5) oder APC Mouse IgG2a, k Isotype Kontroll ( San Diego, CA). Verstuerwen Zellen sech mat propidium Kaliumiodid Fortgeschratten an aus der Analyse ausgeschloss. An Zell zortéieren, goufen d'CXCR4-positiven an CXCR4-negativ subpopulations sidd engem JSAN Zell sorter benotzt (Bay Bioscience, Kobe, Japan), a goufen duerch eng Software ze analyséieren, FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, ODER). Fir Zell Zyklus gebueden, sech Zellen fir 5 Deeg op e serum-gratis mëttelfristeg iwwerginn, an dono mat 0,05% trypsin-héich gesammelt, an duerno zu kal 80% Ethanol gespaart. Nuecht op -20 ° C No Bauer, huet den Echantillon vun PBS Katakombe (-) an zu 500μl vum PI /RNase Staining Respektiv (BD Pharmingen, San Diego, CA) incubated pro 1 × 10 6 Zellen fir 30 min bei Raumtemperatur virun Analyse. Flow cytometry Leeschtung war mat FACSCalibur (BD, Franklin sin, NJ), an analyséiert vun enger Software, FlowJo. VerfÜgung

Anchorage-onofhängeg Zell Wuesstem assay VerfÜgung

A mëll Agar Kolonie Opstellung assay war duerchgefouert mat der CytoSelect 96-Majo Zell sozialt Assay Kit (Zell Biolabs, San Diego, CA) folgenden d'Instruktioune vun den Hiersteller. Kuerz, 5 × 10 3 CXCR4-positiv oder CXCR4-negativ waren suspendéiert kleng Zellen zu DMEM 0,4% niddreg-vermëschen agarose an 10% FBS an rakommen op 1% vum Héich-vermëschen agarose wouvun DMEM an 10% FBS mat. No incubating CO d'Zellen fir 5 Deeg op 37 ° C an 5% _{2, goufen Zellen lysed a mat CyQuant GR Hoerfaarw fonnt. D'fluorescence vun der Kolonie Zellen grënnen gouf am Knappheet Microplate Reader (Safire, s, Mannedorf, Swizerland) op excitation /Emissioun Schwéngung Virsaz vun 485/520 nm. VerfÜgung}

Missiounen assay VerfÜgung

Zell Invasioun liesen Hëllef BD BioCoat entholl Missiounen Assay System (BD Biosciences) no den Instruktioune vun den Hiersteller ass alles. Kuerz, 4 × 10 5 vun 60As6 Zellen mat serum-fräi Medien sech an der ieweschter Chambre vun de System rakommen. Ënnen Wells sech mat Medien mat 10 Dummeldéng /ml SDF-1β (Invitrogen, Karlsbad CA) gefëllt. No 24 HR incubation, huet den Zellen an der ieweschter Chambre ofgegruewen an d'Zellen, datt duerch d'Matrigel Membran eruewert huet mat Diff-Quick stain (BD Biosciences) a gezielt manuell Kierchefënster. VerfÜgung

Caspase assay VerfÜgung

D'60As6 Zellen sech zu engem 96-Meter Plack (5 × 10 3 Zellen /gutt) virbereet. (; D Systemer 240-B, R &) an der Zell Kultur am caspase 3/7 assay war um 24 HR no der Aféierung vun recombinant TGF-β1 mat der Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, allem) gesuergt eng Konzentratioun vun 2 Dummeldéng /ml. VerfÜgung

Zell Wuesstem assays VerfÜgung

IC fir erauszefannen _{50 Wäerter géint docetaxel (Doc), souwuel HSC-60 an 60As6 Zellen sech cultured an der Presenz vun 0-100 nm Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) fir 4 Deeg op 37 ° C an 5% CO 2 vun de konventionelle MTT assay gefollegt. Fir ausseet geschéckt Behandlung mat Doc an TGF-β, all vun 60As6 Zellen an 2 Primärschoul Kulturen (NSC-16C an -22C) war an engem 6-gutt zappen virbereet (1 × 10 5 Zellen /gutt), gefollegt vun engem Traitement mat Doc (2,5 nm) an TGF-β1 fir 72 HR (0 oder 2 Dummeldéng /ml) bei 37 ° C an 5% CO 2. Zellen sech duerch trypan blo a gezielt mat TC20 Automatëscht Zell blëtzaarteg (Bio-Rad, Hercules, CA) Kierchefënster. VerfÜgung}

statistique Analyse VerfÜgung

All Donnéeën goufen als déi mengen ± SE ausgedréckt, an analyséiert benotzt der unpaired T-Test. D'akzeptéiert Niveau vu Bedeitung war p VerfÜgung &Si besteet; 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) war fir all Statistik analyséiert ginn. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Phenotypic Differenzen tëscht Elteren HSC-60 Zellen an der héichgradeg tumorigenic subline 60As6 Zellen VerfÜgung

Fir Adress de Phänomen vun diffusen-Typ GC-verbonne Haaptleit vun der Embryone vun molekulare a bewosst Biologie, mir eng héich peritoneal-metastatic Zell Linn gegrënnt, 60As6, aus engem diffusen-Typ GC ofgeleet Zell Linn, HSC-60, duerch zu VIVO VerfÜgung Zorten vun enger orthotopic inoculation vun der entholl Zellen an d'Isolatioun vun héich-metastatic mannste vun der ascites vun immunodeficient Mais aus [25]. Obwuel d'Verdueblung Zäit vun deenen zwee Zell Linnen war ähnlecher (30 HR fir HSC-60 a 31 HR fir 60As6) kënschtlech VerfÜgung, Multiple entholl noverfollegt méi séier gemaach 60As6 Zellen der intraperitoneal inoculation an d'Mais. D'Steiren Iwwerliewe Zäit gouf 167 Deeg ofgestouss vun 5 × 10 6 HSC-60 Zellen, am Ufank nëmmen déi ofgestouss vun der selwechter Zuel vun 60As6 Zellen zu engem wichtegen Opstellung bluddege ascites Schoss an de Steiren Iwwerliewe Zäit war just 28 Deeg. Anchorage-independency vläicht fir d'Iwwerliewe vun de gratis Kriibs Zellen am peritoneal Discours a fir Kolonisatioun verlaangt ginn. An Kolonie Opstellung assay, geformt 60As6 Zellen vill méi Kolonien am Verglach zu HSC-60 Zellen (S1 Lalumi) weist, dass 60As6 eng héich Fähegkeet vum Hafen-onofhängeg Wuesstem hiérarchique. Mir validéiert der chemoresistance och als eng grouss Besëtz vun CSCs bekannt. D'Zellen sech an der Präsenz vun docetaxel (Doc) cultured, déi fir den Traitement vun GC Patienten engem oft ugestallten Anti-Kriibs Drogenofhängeger ass. 60As6 zougedréckt enger 6-fantastesch héich IC _{50 Wäert vun Doc Verglach zu deem vun HSC-60 (52 nm an 8.4 nm, bzw.) (S2 Lalumi). Dës Donnéeë weisen, datt 60As6 eng héich chemoresistant phenotype verdengten huet. Doriwwer eraus, war d'Wirklechkeet vun HSC-60 Zellen wéi flaach a grouss Zeeche hierkommen, déi vun 60As6 Zellen war semi-Wénkel gekäppt a kleng, wat dacks fir CSCs (S3 Lalumi) observéiert zu der Wirklechkeet ähnlech ass. Mir iwwerpréift nächst der Lokalisatioun Lipid rafts benotzt Cholera toxin B subunit (CTxB) als Lipid Caisse Bissau, well et schon dass Lipid Caisse Stärekéip an hematopoietic Stammzellen beräichert huet sech gemellt gouf [29]. Eng Heefung vun der unisse CTxB war fir 60As6 Zellen observéiert awer net zu HSC-60, anerer CSC-wëll Besëtz vun der fréierer Zellen suggeréiert (S3 Lalumi). VerfÜgung}

Fir d'biologesch Differenzen tëscht HSC-60 an 60As6 Bewäert Zellen, am Verglach mir Gentherapie Ausdrock Profiler vun microarray Analyse (S1 Table). Down-Regulatioun vun dräi gastric pit Zell-dat lues ( MUC5AC VerfÜgung, MUC1 VerfÜgung, an TFF1 VerfÜgung) an e puer cytokeratins sech zu 60As6 fonnt. Par contre, e puer Stammzellenfuerschung lues ( LY75 VerfÜgung, CD44 VerfÜgung, GPNMB VerfÜgung, an CXCR4 VerfÜgung) waren an dëser Zell Linn upregulated. Den Ausdrock Profil hindeit datt 60As6 eng staark mesenchymal phenotype huet, déi eng Charakteristik vun epithelial Zell-ofgeleet CSCs ass. VerfÜgung

Mir propagéieren weider der mRNA Ausdrock vu souwuel eng typesch dat Bewaacher MUC5AC VerfÜgung [3 4] an engem Metastasen-verbonne chemokine receptor CXCR4 VerfÜgung [30] andeem RT-Hinnen alleguer. Am Aklang mat der microarray Resultater, MUC5AC VerfÜgung a CXCR4 VerfÜgung mRNAs zougedréckt engem géigensäiteg exklusiv Ausdrock am HSC-60 an 60As6 (Lalumi 1A). A chemokine SDF-1 encoded vun CXCL12 VerfÜgung ass bekannt CXCR4 a seng cognate receptor CXCR7 [30] zu kruet; Ee, d'mRNA vun CXCL12 VerfÜgung a CXCR7 VerfÜgung net zu entweder Zell Linn fonnt goufen. Den Ausdrock vun zwou MUC5AC an CXCR4 war och bei engem FAQ Niveau vun immunocytochemical staining (Lalumi 1B) confirméiert. Sou, proposéiere dësen Resultater, déi d'HSC-60 Zellen méi ënnerscheet Zellen ervirbréngen wéi d'60As6 Zellen do, déi meeschtens vun Strenz Zellen zesummegesat sinn. Geholl zesummen, all dës CSC-wëll Charakteristiken vun 60As6 weg datt d'Strenz subpopulation mat engem héich tumorigenicity an Drogenofhängeger-Resistenz konnt effikassten vun den Elteren Zellen während beräichert ginn an VIVO VerfÜgung Zorten. VerfÜgung

Umeldung an characterization vun gastric CSCs zu 60As6 an alleréischter cultured Zellen VerfÜgung

Mir iwwerpréift nächst der Roll vun CXCR4 vun diffusen-Typ GC Zellen fir Haaptleit. Als zu Lalumi 1A gewisen, huet d'receptor CXCR4 VerfÜgung héich zu 60As6 Verglach mat HSC-60 ausgedréckt, hierkommen hir ligand CXCL12 /SDF1 VerfÜgung war net zu zwee. Mä, ass et wichteg, datt dës ligand zu peritoneal mesothelial Zellen ausgedréckt ginn ass bekannt [31] an esou enger chemokine zu Funktioun wäit Metastasen duerch en Zesummespill mat CXCR4-ausdrécken Kriibs Zellen [30] zu induce. Dofir, iwwerpréift mir ob CXCR4 als Bewaacher CSCs fir Erkenntnesser Haaptleit-verbonne déngen kéinten. Den Ausdrock vun CXCR4 op 60As6 Zellen war vun fluorescence ageschalt Zell zortéieren (FACS) Analyse analyséiert. Laut der CXCR4 Ausdrock an vir Effekt Muster, Schatzkummer 60As6 Zellen e heterogeneity aus dräi verschiddene subpopulations: I. CXCR4 + kleng Zellen (15%), II. CXCR4 - kleng Zellen (65%), an III. CXCR4 - grouss Zellen (20%) (Lalumi 1Ci). D'Zellen sech dann mat engem Rengheet vum ech zu all subpopulation getrennt: 97%, II: 99%, an III: 54%, respektiv (Lalumi 1Cii-1Civ). Déi niddreg zortéieren Rengheet vum CXCR4 - grouss Zell subpopulation III dem kontaminéierte mat aggregéiert CXCR4 Deel war - kleng Zellen (Lalumi 1Civ, schwaarz-Statue Rot). Vun dësen dräi subpopulations, nëmmen e CXCR4 - grouss Zell subpopulation enthale MUC5AC + ënnerscheet Zellen (Lalumi 1Civ, dräi baussenzege Brieder). Vun Zell Wuesstem Iwwerwachung vun enger eenzeger Zell Niveau, war et fonnt dass CXCR4 - kleng Zellen proliferated hierkommen d'CXCR4 - grouss Zellen rauszesichen Zell Divisioun och 3 Deeg no Kultur (Lalumi 1D an S4 Lalumi) forméieren. Dës Conclusiounen hindeit datt CXCR4 - kleng Zellen flüchteg hire Zellen sinn, iwwerdeems de CXCR4 - grouss Zelle Zellen-die ënnerscheet VerfÜgung

No Centre de zwee subpopulation (ech an II), mir analyséieren. eng Verréckelung vun der Zell Bevëlkerung (Lalumi 2A); No 7 Deeg vu Kultur. CXCR4 + kleng Zellen entspriechende subpopulation ech generéiert selwer, CXCR4 - kleng Zellen, an CXCR4 - grouss Zellen (11%, 62%, an 21%, respektiv), wobäi CXCR4 - kleng Zellen ze subpopulation entspriechend II konnt klammen ginn haaptsächlech fir sech (80%) mat e puer groussen Zellen (17%) a ganz wéineg CXCR4 + kleng Zellen (2%). Dës Resultater hindeit, datt CXCR4 + kleng Zellen, dat Potential hunn an produzéiere CXCR4 - grouss Zellen méiglecherweis duerch eng Etapp vun CXCR4 -. Kleng Zellen an der Method vun Zell dat VerfÜgung

Doriwwer, engem CXCR4 + kleng eenzel Zell produzéiert enger Kolonie MUC5AC + ënnerscheet Zellen no 7 Deeg an Kultur (Lalumi 2B) mat. Dëst brengt war vun enger Zell-antike assay ënnerstëtzt kombinéiert mat liewen Zell staining an immunostaining vun MUC5AC (Lalumi 2C). Zousätzlech, CXCR4 + kleng Zellen sech engem héijen Niveau vun LGR5 VerfÜgung, déi als Bewaacher vun gastric epithelial Stammzellen läit um drüs vun normal mucosa [32] (Lalumi 2D bekannt ass fir ausdrécklech dës ). VerfÜgung

Next, mir Hafen independency an entholl-domat Fähegkeet vun den zwou kleng Zell subpopulation (ech an II validéiert). An der Kolonie Opstellung assay, CXCR4 + kleng Zellen vill méi Kolonien gegrënnt wéi de CXCR4 hutt - kleng Zellen (Lalumi 3A). Serial dilution Experimenter vun intraperitoneal inoculation zu immunodeficient Mais Teamchef CXCR4 + kleng Zellen och eng héich tumorigenic Fähegkeet (entholl Entwécklung zu 4/5 an 1/5 Mais op inoculation vun 10 haat 5 an 10 4 Zellen, bzw.) am Verglach mat CXCR4 - kleng Zellen (1/10 an 0/10 Mais folgenden 10 5 an 10 4 Zellen, bzw.) (Lalumi 3Bi). Virun allem, all fënnef entholl-Träger Mais no inoculation vun CXCR4 + kleng Zellen haten Multiple entholl noverfollegt (Lalumi 3Bii), an huet ugefaangen bluddeger ascites bannen 3 Wochen (Lalumi 3Biii) ze entwéckelen. VerfÜgung

Nieft diffusen-Typ GC Zell Linnen, mir propagéieren och d'Roll vun CXCR4 zu engem Medeziner Prouf (NSC-20C): eng primär Kultur vun der ascites vun engem mat Haaptleit diffusen-Typ GC Patient etabléiert. An RT-Hinnen alleguer an immunostaining Experimenter, et gouf confirméiert, datt de primären Kultur auszedrécken CXCR4 VerfÜgung awer net CXCR7 VerfÜgung (Lalumi 3C). Wichtegst, CXCR4 + kleng Zellen aus NSC-20C zortéiert haat souwuel eng repopulating Fähegkeet (Lalumi 3Di an 3Dii) an engem héich Kolonie Opstellung Fähegkeet (Lalumi 3Diii). VerfÜgung

Zesummenaarbecht vun der CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 Achs an Haaptleit VerfÜgung

an sechs anere diffusen-Typ GC ofgeleet Zell Linnen (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, a Kato III), ze propagéieren mer weider d'Relatioun tëschent der Ausdrock Status vun zwee CXCL12 /SDF-1 kenne (CXCR4 an CXCR7) an der Heefung vun ascites zu Mais mat de Kriibs Zellen inoculated intraperitoneally. Den RT-Hinnen alleguer Experimenter Teamchef zwee GC Zell Linnen (HSC-39 a Kato III) héich ausgedréckt CXCR4 VerfÜgung (Lalumi 4A). Desweideren, déi esouwuel vun dësen xenografted Mais Multiple entholl Véi a alldeeglech ascites (Lalumi 4B). Am Géigesaz, huet den aneren zwee Zell Linnen (HSC-44 an HSC-58) kee oder relativ niddreg CXCR4 Ausdrock, eng eenzeg oder puer deelweis goufen peritoneal entholl an rauszesichen ascites (Lalumi 4B) cumuléiert. Mir confirméiert och de Heefung vun ascites zu aneren héich peritoneal-metastatic subline 58As9 (ofgeleet vu HSC-58), déi ausgedréckt CXCR7 VerfÜgung op engem héijen Niveau awer net CXCR4 VerfÜgung. Eng aussergewéinlech Fall war 44As3 aus HSC44 ofgeleet, datt verschidde entholl Véi a alldeeglech ascites ouni den Ausdrock vun zwou CXCR4 VerfÜgung a CXCR7 VerfÜgung haten. Am Allgemengen, hunn mer eng héich Korrelatioun tëschent den Ausdrock Niveau vun CXCR4 VerfÜgung oder CXCR7 VerfÜgung an der aggressiv phenotypes zu siwen vun der aacht Zell Linnen ausser 44As3. VerfÜgung

An Medeziner Praxis , stellt peritoneal lavage Zytologie (CY) wichteg prognostic Informatioune fir GC Patienten, well et der "Som" vun Haaptleit virun hirer macroscopic Sortie kann entdecken. Och an de Fäll mat kee Haaptleit (P0), CY-positiv Patienten hunn eng schlecht hätt [33], proposéiert, datt e relativ wéineg metastatic CSCs an der peritoneal lavage vun deene Patienten präsent sinn. Dofir, ze propagéieren mir nächst der Präsenz vun CXCR4 + GC Zellen zu peritoneal Skeletten vun de Patienten ouni klinesch visuell ascites. CXCR4 VerfÜgung mRNA war dacks an de Skeletten an 9 vun 10 CY-negativ Patienten fonnt; awer, war d'mRNA an de Skeletten an 19 vun 34 CY-positiv Patienten (S5A Lalumi) fonnt. Mir confirméiert och d'Presenz vun der CXCR4 an cytokeratin double-positiv kleng GC Zellen op der cobblestone-gebuerene mesothelial fir d'Kultur gett Bruttoinlandprodukt Zellen zu enger kuerzfristeg (7 Deeg) Kultur vun de Patient d'ascites (S5B Lalumi). An eisem Experiment, verschwonnen der peritoneal mesothelial Zellen normalerweis zu Kultur langfristeg no ronn ee Mount. An esou langfristeg Kultur, mir hunn och d'Presenz vun e puer CXCR4- oder CXCR7-duerchaus positiv GC Zellen datt e Charakteristiken fir epithelial-mesenchymal Transitioun, vimentin (VIM) -positive (Pfeil Kapp an S5C Lalumi) huet awer cytokeratin (PAN ) -negative. Dofir, CXCR4 + GC Zellen sinn an der malignant ascites net nëmmen an de fréie Phase vun peritoneal Publikatioun (P0 /CY +), mä och zu méi progressiv Etappe vun engem Verkaf ascites Heefung charakteriséiert. An Zomm, seet de uewen experimentell a Krankheete Beweiser, datt en Deel vun CXCR4 + oder CXCR7 + GC Zellen hunn e Potential fir peritoneal Metastasen entwéckelen. VerfÜgung

Mir propagéieren nächst der funktionell Roll vun der CXCR4 sécher Passerelle an Haaptleit. Den Ausdrock vun CXCL12 VerfÜgung / SDF-1 VerfÜgung am Mënsch a Maus peritoneal mesothelium vun RT-Hinnen alleguer (Lalumi 5A) confirméiert gouf. Dofir, war d'Bedeelegung vun CXCL12 /SDF-1 fir Zell Invasioun propagéieren. Als zu Lalumi 5B gewisen, huet d'Zuel vun invasiv 60As6 Zellen drastesch vun SDF-1 fräi, wat beweist, datt dës Zellen der chemotaxis Fähegkeet SDF-1 hunn. Lentiviral shRNA-entschlof knockdown vun CXCR4 zu 60As6 attenuated SDF-1-mediated Invasioun awer net de entholl deelweis goufen Équipe an der peritoneal Discours vun Mais (net gewisen) betraff. Desweideren, CXCR4 Ausdrock vun enger Elteren Zell Linn HSC-60 gezwongen ni d'tumorigenicity fräi (net gewisen). Geholl zesummen, eis Daten drop hindeit, datt d'CXCR4 am Uschloss un de peritoneum Équipe ass awer net vun der entholl deelweis goufen Équipe. VerfÜgung

Mir zougedréckt schematically Prozesser vun direkten Haaptleit vun gastric Mauer an fortgeschratt GC Patienten duerch d'Interaktioun tëscht CXCR4 + oder CXCR7 + CSCs an den SDF-1-ausdrécken peritoneum (Lalumi 5C). Op der éischter Etapp vum Metastasen, déi CXCR4 + CSCs sech vun der gastric Mauer an der peritoneal Discours datts eraus. Duerno, befestegt dësen Zellen an de Keller Membran (well) vun der peritoneum an Äntwert op d'mesothelium-ofgeleet chemoattractant SDF-1 an colonize noverfollegt zu Form. Dës Evenementer geschéien op ville Plazen iwwer d'peritoneal Uewerfläch geplatzt an e Blockage vun Pompel-Funktioun an dann an der Heefung vun der ascites. VerfÜgung

TGF-β ënnerstëtzt Zell dat /asymmetresch Zell Divisioun vun CXCR4 + gastric CSCs VerfÜgung

TGF-β huet gemellt goufen d'Säit Populatioun vun e puer diffusen-Typ GC Zell Linnen [34] zu manner. Dofir, ze propagéieren mir ob TGF-β e Potential huet de Charakter vun CXCR4 + diffusen-Typ GC Zellen ze änneren. Mir iwwerpréift éischt den Ausdrock Niveau vun TGF-β kenne zu 60As6 Zellen an GC Primärschoul Kulturen ofgeleet aus zwee onofhängeg Patienten (NSC-16C an -22C). RT-Hinnen alleguer Experimenter weisen, datt souwuel vun zwee TGF-β receptor Genen ( TGFBR1 VerfÜgung a TGFBR2 VerfÜgung) ausgedréckt an all vun deenen Zellen (S6 Lalumi). Mir iwwerpréift och d'Lokalisatioun vun SMAD2 /3, well dës transcriptional Faktoren allgemeng bekannt sinn an d'Kären an Äntwert un den Aktivéierungscode vu TGF-β sécher ze cumuléiert. Well dës war zu Lalumi 6Ai, déi nuklear Heefung vun SMAD2 /3 an 60As6 Zellen no engem 30 min Behandlung mat 2 Dummeldéng /ml TGF-β fonnt. VerfÜgung

nächste Mir propagéieren wéi CXCR4 + GC Zelle vun der Aktivatioun vun TGF-β sécher betraff. Den RT-Hinnen alleguer Experimenter weisen eng Ofsenkung vun CXCR4 VerfÜgung mRNA zu 60As6 vun TGF-β Behandlung (Lalumi 6Aii). Analysë definitiven Flow cytometry datt TGF-β Behandlung CXCR4 + kleng Zellen vun 6.3% op 0,4% manner an CXCR4 ze erhéijen - grouss Zellen vun 17,1% op 43,2% (Lalumi 6B). Am Aklang mat enger Erhéijung vun die ënnerscheet Zellen, caspase 3/7 vun der ganzer Zell Bevëlkerung war vun TGF-β Behandlung (Lalumi 6C) ausgeléist. Dofir, kann TGF-β e Potential hun fir CXCR4 + CSCs fir die ënnerscheet Zellen induce. Mir propagéieren weider den Effet vun TGF-β op quiescent 60As6 Zellen, well CSCs geduecht sinn op engem deenen Staat ënner engem hypovascular Conditioun ze existéieren. No serum Ausschöpfung fir 5 Deeg, huet de CXCR4 + kleng Zellen zu 42% an (Lalumi 6Di). Ausserdeem, war e wichtegen Deel vun der 60As6 Bevëlkerung an G1 Phase (Lalumi 6Dii).

• PLOS NËMMEN: SIRT3 verbessert Glycolysis an Zouhuelen vun SIRT3-ausdrécken Gastric Cancer Cells
• PLOS NËMMEN: MicroRNA-137 dréit zu Dampened Tumorigenesis zu Mënscherechter Gastric Cancer vun AKT2