PLoS ONE: Identifikation og karakterisering af CXCR4-positiv mavekræft Stamceller

abstrakt

Diffus-type faste tumorer er ofte sammensat af en høj andel af sjældent prolifererende (dvs. hvilende) kræftceller, stærkt indikerer inddragelse af cancer stamceller (CSCS) Selvom diffus-typen mavekræft (GC) patienter har en dårlig prognose på grund af høj hyppige udvikling af peritoneal formidling (PD), det er begrænset viden om, at PD-associerede CSCS og effekt af CSC-targeting terapi i diffust-typen GC. I denne undersøgelse, vi etableret meget metastatiske GC cellelinier ved in vivo
valg designet til berigelse af PD-associerede GC celler. Ved microarray analyse fandt vi CXC kemokinreceptor type 4 (CXCR4) kan være en hidtil ukendt markør for stærkt metastatiske CSCS, eftersom CXCR4-positive celler kan vokse forankringsuafhængigt, initiere tumorer i mus, være resistente over for cytotoksisk lægemiddel, og producere differentierede datter celler. I kliniske prøver, blev disse CXCR4-positive celler fundet fra ikke kun sent metastase stadium (akkumulerede ascites), men også tidligere tidspunkt (peritoneale vaskevæsker). Desuden behandling med transformerende vækstfaktor-β forbedret anti-cancer virkning af docetaxel via induktion af celledifferentiering /asymmetrisk celledeling af CXCR4-positive gastriske CSCS selv i en sovende tilstand. Derfor differentiering inducere holde lovende for at opnå den maksimale terapeutiske resultat fra i øjeblikket tilgængelige anti-cancer medicin gennem re-cycling af CSCS

Henvisning:. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identifikation og karakterisering af CXCR4-positiv mavekræft stamceller. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, JAPAN

Modtaget: Februar 18, 2015; Accepteret: 25. maj 2015; Udgivet: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Alle microarray data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database, GEO; tiltrædelse nummer GSE53276

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institute of Biomedical Innovation (for Avanceret Forskning for Medical Products Mining Programme ID10-41), Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd Japan (for det tredje Omfattende 10-årig strategi for Cancer Kontrol H22-007), National Research og Development Fund Cancer center (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki og T Nishimura er modtagerne af en Research Resident Fellowship fra Fonden for fremme af Cancer Research i Japan

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Histopatologisk kan GCS inddeles i to hovedkategorier: tarm-typen og diffus-typen. Intestinal-typen GC dominerer i høj risiko geografiske områder og udvikler gennem nogle sekventielle faser, herunder Helicobacter pylori
( H
. pylori
) associeret atrofisk gastritis, intestinal metaplasi (IM), og dysplasi. Derimod diffus type GC, som tegner sig for halvdelen af ​​alle GC patienter, har en bred geografisk fordeling og udvikler selv fra H
. pylori
-fri, morfologisk normale maveslimhinden uden atrofisk gastritis eller IM, og diffus type GC kan afvige fra den intestinale type både genetisk og fænotypisk [1-5]. I modsætning til den faldende forekomst af den intestinale type, er forekomsten af ​​den diffuse type sigende stigende på verdensplan [6]. Prognosen for avanceret diffus-type GC patienter er forblevet fattige i det seneste årti på grund af en høj peritoneal formidling (PD) (78%) sammenlignet med den for intestinal-type (45%) [7]. Især patienter med Bormann type IV GC har en ekstremt dårlig prognose, selvom de fik multidisciplinær behandling [8]. Derfor adressering PD er et presserende problem for forbedring i prognosen af ​​diffuse type GC-patienter.

Diffus-typen GC'er er typisk kendetegnet ved en omfattende stromale fibrose med dårlig vaskularisering og sjældne proliferativ ( i
. e
. sovende) kræftceller, hvilket fører til en væsentlig terapeutisk modstand. Set ud fra kemoterapi, transformerende vækstfaktor β (TGF-p) er blevet tænkt at bidrage til den aggressive progression via epitel-mesenkymale overgang og ved at inducere fibrose [9]. Imidlertid TGF-β inhiberer også celleproliferation inducerer apoptose, og medierer differentiering i epitelceller, hvilket antyder, at komponenter af TGF-β signalveje har tumor-undertrykkende aktivitet i epiteliale tumorer [10, 11]. Selvom akkumulere beviser har vist kritiske rolle TGF-β i cancer stamceller (CSC) biologi, der er begrænsede oplysninger om sin rolle i diffust-typen GC'er.

Det er blevet rapporteret, at hver population af tumorceller vise funktionel heterogenitet kendetegnet ved distinkte proliferation og differentiering kapacitet i forskellige typer af tumorer [12]. At tage højde for en sådan tumor heterogenitet er der blevet foreslået to modeller: den klonale evolution model [13] og CSC model [14]. Sidstnævnte model har fået bred opmærksomhed, da det giver en rimelig forklaring på resistens over for konventionel kemo- og strålebehandling, hvor hvilende eller langsomt cykling CSCS overleve, og resulterer i en eventuel tumor tilbagefald [15-17]. Derfor, for at terapeutiske strategier målrette CSCS er bydende nødvendigt at udrydde resterende sygdom og til at forhindre gentagelser i ikke kun GC men også andre kræftformer. Desuden vil der med den nuværende indsigt i de cellulære mekanismer carcinogenese, er metastatiske potentiale af tumorceller tilskrives CSCS, som klonalt kan initiere tumordannelse på fjerne steder [18 19]. Selv om en række celleoverflademolekyler er blevet foreslået som CSC markører i en lang række humane maligniteter, har der ikke været nogen markør identifikation for PD-associerede CSCS i GC'er [20-23]. For at identificere sådanne markører, betragtede vi den opfattelse, at funktionelt og genetisk heterogene tumorer har fælles og iboende mekanismer tumor vedligeholdelse i henhold til forbindelse med en bestemt mikromiljø. Derfor vi hypotese, at bør defineres CSCS funktionelt ved godt validerede assays, såsom in vivo
transplantation. I diffuse type GC, vi i første omgang fokuseret på bughinden-specifikke kolonisering af celler og beriget PD-associerede CSCS ved gentagne in vivo
markeringer [24, 25]. Her fandt vi CXC kemokinreceptor type 4 (CXCR4) kan være en markør for PD-relaterede gastriske CSCS og viste, at TGF-β forøger effektiviteten af ​​antitumorlægemidler via induktion af celledifferentiering /asymmetrisk celledeling i CXCR4 ^{+ CSC befolkning selv i en sovende tilstand.}

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Kliniske prøver blev leveret af National Cancer center Hospital (Tokyo, Japan) efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver patient og godkendelse af National Cancer center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

cellelinjer og primære kulturer

Et menneske GC cellelinje blev HSC-60 er oprettet ved en samarbejdspartner anvendelse af proceduren som tidligere [26] beskrevet. En stærkt peritoneal-metastatisk cellelinie, 60As6 blev etableret fra HSC-60 ved anvendelse af orthotopisk væv implantation i SCID /SCID-mus som kort følger: xenotransplanteret tumor af HSC-60-celler blev transplanteret ind i det gastriske væg på en mus. Vi gentog seks cyklusser af høst ascitiske tumorceller og den ortotopisk inokulation af disse celler. Disse to cellelinjer blev opretholdt i en RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum. Vi har også etableret to luciferase-udtrykkende cellelinier (HSC-60Luc og 60As6Luc). Seks andre GC-afledte cellelinier (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, og KATO III) blev også opretholdt under samme betingelse. Af disse seks, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, og 58As9 blev oprettet ved den ovenstående procedure [27, 28], og KATO III blev opnået fra American Type Culture Collection. For primære kulturer blev celler opsamlet fra patienternes peritoneale vaskevæsker og ascites (NSC-16C, NSC-20C, og NSC-22C) og dyrket i en RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum.

microarray analyse

Totalt RNA fra 60As6, 60As6Luc, HSC-60, og HSC-60Luc celler blev isoleret ved at suspendere cellerne i en ISOGEN lyseringsbuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) efterfulgt af isopropanol udfældning. Vi har udført microarray-analyser to gange ved hjælp af Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Procedurerne blev udført i overensstemmelse med leverandørens protokoller. De arrays blev scannet med en GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), og dataene blev analyseret ved Microarray Suite-version 5.0 med Affymetrix standardindstillinger analyse indstillinger og global skalering som normalisering metode. Den trimmede middelværdi mål intensiteten af ​​hvert array blev arbitrært sat til 1000. Alle de microarray data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database, GEO; tiltrædelsen nummer GSE53276. Af en 2-gange ændring, blev 684 gener udvalgt som specifikke gener for 60As6 og 60As6Luc celler, og 1150 gener blev udvalgt til HSC-60 og HSC-60Luc celler.

Dyreforsøg

Six -Uge gammel kvinde C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) mus (CLEA Japan, Japan) blev avlet ved en stuetemperatur med en 12 timers lys /mørke daglige cyklus. Musene blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser og forudsat sterile fødevarer, vand og bure. 1 × 10 ^{4 til 1 × 10 6 af cancerceller blev suspenderet med 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter sprøjtet ind i bughulen ved anvendelse af en 26 1/2-gauge nål. Mus blev vejet og målt ugentligt. Humane endpoint kriterier omfattede betydelig ophobning af abdominal ascites, dyspnø, hårrejsning, anæmi, eller vægttab på over 10% af oprindelig vægt. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i IASP og blev godkendt af Udvalget for Etik i dyreforsøg af National Cancer Center. blev gjort en indsats for at minimere antallet og enhver lidelser dyr, der anvendes i forsøgene.}

RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret ved at suspendere cellerne i en ISOGEN lysispuffer efterfulgt af isopropanol udfældning. Semi-kvantitativ RT-PCR blev udført inden for lineære område fra 25 til 30 cyklusser for MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
, og ACTB
hjælp følgende primere: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'og 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "for MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'og 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3' for CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 'og 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3' for CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'og 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' for CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'og 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' for LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'og 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' for TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'og 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' for TGFBR2
, og 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'og 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' for ACTB
.

immuncytokemi

Indirekte fluorescerende immuncytokemi blev udført for CXCR4, MUC5AC, og Smad2 /3 på celler dyrket i 4-brønds kammer dias. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter tre gange vask i PBS (-), blev de inkuberet med anti-humant CXCR4 monoklonalt antistof (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-humant MUC5AC antistof (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA) eller anti- human Smad2 /3-antistof (BD Biosciences, Bedford, MA) efterfulgt af inkubering med en 1: 1000 fortynding af æsel-anti-muse Alexa 488-konjugeret serum (Invitrogen, Grand Island, NY) i 1 time ved stuetemperatur. Cellekerner blev farvet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). For celle-slægt assay, sorteret enkelt CXCR4 ^{+ små celler blev farvet af CellTracker Green (Invitrogen) til sporing af de levedygtige celler.}

Flowcytometri og celle sortering

60As6 celler (1 × 10 ^{6 celler) blev co-inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med de følgende antistoffer: APC anti-human CD184 (CXCR4) (IgG2a, klon 12G5) eller APC Mouse IgG2a, k isotypekontrol opnået fra BioLegend ( San Diego, CA). Døde celler blev mærket med propidiumiodid og udelukkes fra analysen. I cellesortering blev CXCR4-positive og CXCR4-negative subpopulationer oprenset under anvendelse af en JSAN cellesorterer (Bay Bioscience, Kobe, Japan), og blev analyseret ved en software, FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). For cellecyklus analyser blev cellerne overført til et serum-frit medium i 5 dage, og derefter høstet med 0,05% trypsin-EDTA, og derefter suspenderet i kold 80% ethanol. Efter fiksering natten over ved -20 ° C blev prøverne vasket i PBS (-) og inkuberet i 500 pi af PI /RNase Staining Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) per 1 x 10 6 celler i 30 minutter ved stuetemperatur før analyse. Flowcytometri blev udført under anvendelse FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), og analyseret ved en software, FlowJo.}

forankringsuafhængig cellevækst assay

En blød agar-kolonidannelse assayet blev udført ved hjælp af CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) følge anvisningerne fra producenten. Kort fortalt blev 5 x 10 ^{3 CXCR4-positive eller CXCR4-negative små celler suspenderet i DMEM indeholdende 0,4% lavtsmeltende agarose og 10% FBS og podedes på 1% af lavtsmeltende agarose indeholdende DMEM og 10% FBS. Efter inkubering af cellerne i 5 dage ved 37 ° C i 5% CO _{2, cellerne blev lyseret og detekteret med CyQuant GR farvestof. Den fluorescens kolonidannende celler blev læst i Multifunktionel Microplate Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) ved excitation /emission bølge længder på 485/520 nm.}}

Invasion assay

Cell invasion blev bestemt ved hjælp af BD BioCoat Tumor invasion Assay System (BD Biosciences) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kort beskrevet 4 × 10 ^{5 i 60As6 celler med serumfrie medier blev podet ind i det øvre kammer af systemet. Bundbrønde blev fyldt med medier med 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Efter 24 timers inkubation blev cellerne i det øvre kammer fjernet, og cellerne, der invaderede gennem Matrigel membranen blev farvet med Diff-Quick-farvning (BD Biosciences) og talt manuelt.}

Caspase-assay

De 60As6 celler blev fremstillet i en 96-brønds plade (5 x 10 ^{3 celler /brønd). Caspase 3/7 assay blev udført under anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay (Promega, Madison, WI) ved 24 timer efter tilsætning af rekombinant TGF-β1 (240-B, R &D Systems) i cellekultur en koncentration på 2 ng /ml.}

analyser cellevækst

for at bestemme IC _{50 værdier mod docetaxel (dok), både HSC-60 og 60As6 celler blev dyrket i tilstedeværelse af 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) i 4 dage ved 37 ° C i 5% CO 2 efterfulgt af konventionel MTT-assayet. Til validering af kombinationsbehandling med Doc og TGF-β, blev alle 60As6 celler og 2 primære kulturer (NSC-16C og -22C) fremstillet i en 6-brønds plade (1 x 10 ^{5 celler /brønd) efterfulgt af en behandling med Doc (2,5 nM) og TGF-β1 (0 eller 2 ng /ml) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO 2. Celler blev farvet ved trypanblåt og talt med TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdien ± SE, og analyseret ved anvendelse af den uparrede t-test. Det accepterede signifikansniveau var s
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) blev anvendt til alle statistiske analyser.

Resultater

fænotypiske forskelle mellem forældrenes HSC-60 celler og de meget tumorigen Delområde 60As6 celler

Til tage fænomenet med diffus-typen GC-associeret PD set fra molekylær- og cellebiologi, vi etableret en yderst peritoneal-metastatisk cellelinie, 60As6, fra en diffus-typen GC afledt cellelinie, HSC-60, gennem in vivo Salg markeringer består af en orthotopisk inokulering af tumorcellerne og isoleringen af ​​højt metastatiske dem fra ascites i immunsvækkede mus [25]. Selv fordoblingstiden for disse to cellelinjer var sammenlignelige (30 hr til HSC-60 og 31 timer for 60As6) in vitro
, 60As6 celler dannede multiple tumorknuder hurtigere efter intraperitoneal inokulering i musene. Den mediane overlevelsestid var 167 dage efter implantation af 5 × 10 ^{6 HSC-60 celler, hvorimod implantation af det samme antal 60As6 celler resulterede i en bemærkelsesværdig dannelse af blodige ascites og median overlevelsestid var kun 28 dage. Anchorage-uafhængighed kan være nødvendig for overlevelsen af ​​frie kræftceller i bughulen og for kolonisering. I kolonidannelse assay 60As6 celler dannet mange flere kolonier sammenlignet med HSC-60-celler (S1 Fig), der viser, at 60As6 besidder en høj evne forankringsuafhængig vækst. Vi valideret kemoresistens også kendt som en vigtig egenskab ved CSCS. Cellerne blev dyrket i nærvær af docetaxel (Doc), som er et hyppigt anvendt anticancerlægemiddel til behandling af GC patienter. 60As6 viste en 6 gange højere IC _{50 værdien af ​​Doc sammenlignet med den af ​​HSC-60 (52 nM og 8,4 nM) (S2 Fig). Disse data indikerer, at 60As6 har opnået en høj kemoterapi fænotype. Endvidere blev morfologien af ​​HSC-60-celler karakteriseret som flad og stort, mens den for 60As6 celler var semi-flydende og små, som ligner morfologien ofte observeret for CSCS (S3 Fig). Dernæst undersøgte lipidklumper lokalisering ved hjælp koleratoksin B-underenhed (ctxB) som en lipidklump markering, da det allerede er blevet beskrevet, at lipidklump klynger blev beriget i hæmatopoietiske stamceller [29]. En ophobning af den fluorescerende CTXB blev observeret for 60As6 celler, men ikke i HSC-60, hvilket tyder på en anden CSC-lignende ejendom til de tidligere celler (S3 Fig).}}

For at vurdere de biologiske forskelle mellem HSC-60 og 60As6 celler, sammenlignede vi genekspressionsprofiler efter microarray analyse (S1 tabel). Nedregulering af tre gastrisk pit celle-differentiering markører ( MUC5AC
, MUC1
, og TFF1
) og nogle cytokeratiner blev fundet i 60As6. Derimod flere stamcelle markører ( LY75
, CD44
, GPNMB
, og CXCR4
) blev opreguleret i denne cellelinie. Ekspressionsprofilen antyder, at 60As6 har en stærk mesenkymale fænotype, der er karakteristisk for epitelcelleafledt CSCS.

Vi undersøgte yderligere mRNA ekspression af både en typisk differentieringsmarkør MUC5AC
[3 , 4] og en metastase-associerede chemokinreceptor CXCR4
[30] ved RT-PCR. I overensstemmelse med microarray resultater, MUC5AC
og CXCR4
mRNA viste en gensidigt udelukkende udtryk i HSC-60 og 60As6 (Fig 1A). En kemokin SDF-1 kodes af CXCL12
vides at binde CXCR4 og dens beslægtede receptor CXCR7 [30]; imidlertid mRNA'et fra CXCL12
CXCR7
ikke blev detekteret i nogen cellelinie. Ekspressionen af ​​både MUC5AC og CXCR4 blev også bekræftet på et protein niveau ved immuncytokemisk farvning (Fig 1B). Således antyder disse resultater, at HSC-60-celler havn mere differentierede celler end de 60As6 celler, der primært består af udifferentierede celler. Tilsammen alle disse CSC-lignende karakteristika 60As6 viser, at udifferentieret subpopulation med en høj tumorgenicitet og lægemiddel-resistens effektivt kunne beriges fra forældrenes celler under in vivo
markeringer.

Identifikation og karakterisering af gastrisk CSCS i 60As6 og primære dyrkede celler

Vi næste undersøgte rolle CXCR4 i diffust-type GC celler til PD. Som vist i figur 1A, receptoren CXCR4
blev stærkt udtrykt i 60As6 sammenlignet med HSC-60, mens deres ligand CXCL12 /SDF1
ikke var i begge. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at denne ligand er kendt for at blive udtrykt i peritoneale mesoteliale celler [31] og for at fungere som en chemokin at inducere fjernmetastaser gennem en interaktion med CXCR4-udtrykkende cancerceller [30]. Derfor har vi undersøgt, om CXCR4 kunne tjene som markør for at identificere PD-associerede CSCS. Ekspressionen af ​​CXCR4 på 60As6 celler blev analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse. Ifølge CXCR4 udtryk og frem spredning mønster, 60As6 celler udviste en heterogenitet, der består af tre forskellige subpopulationer: I. CXCR4 ^{+ små celler (15%), II. CXCR4 - små celler (65%), og III. CXCR4 - store celler (20%) (fig 1CI). Cellerne blev derefter adskilt til hver subpopulation med en renhed på I: 97%, II: 99%, og III: 54% (fig 1Cii-1Civ). Den lave sortering renhed CXCR4 - stor celle delpopulation III henføres til forurening med aggregerede CXCR4 - små celler (Fig 1Civ, sort-boxed panel). Blandt disse tre subpopulationer, kun en CXCR4 - stor celle delpopulation indeholdt MUC5AC + differentierede celler (Fig 1Civ, tre ydre paneler). Ved cellevækst overvågning i en enkelt celle niveau, blev det konstateret, at CXCR4 - små celler spredt, mens CXCR4 - store celler ikke undergå celledeling selv 3 dage efter kultur (Fig 1D og S4 Fig). Disse resultater tyder på, at CXCR4 - små celler er forbigående forstærkende celler, mens CXCR4 - store celler er terminalt differentierede celler}

Efter sortering af to delpopulation (I og II), vi analyserer. enhver forskydning af cellepopulationen (figur 2A); efter 7 dages dyrkning. CXCR4 ^{+ små celler svarende til delpopulation jeg genererede selv, CXCR4 - små celler, og CXCR4 - store celler (11%, 62% og 21%, henholdsvis), mens CXCR4 - små celler, der svarer til delpopulation II var i stand til at give anledning primært sig selv (80%) med nogle store celler (17%) og meget få CXCR4 + små celler (2%). Disse resultater tyder på, at CXCR4 + små celler har differentiering potentiale og producere CXCR4 - store celler muligvis gennem en fase af CXCR4 -. Små celler i ordningen af ​​celledifferentiering}

Desuden en CXCR4 ^{+ lille enkelt celle produceret en koloni indeholdende MUC5AC + differentierede celler efter 7 dage i kultur (figur 2B). Dette fund blev understøttet af en celle-slægt assay kombineret med levende cellefarvning og immunfarvning af MUC5AC (fig 2C). Desuden CXCR4 + små celler viste sig at udtrykke et højt niveau af LGR5
, som er kendt som en markør af gastriske epitelceller stamceller lokaliseret ved kirtel af normal mucosa [32] (Fig 2D ).}

Dernæst vi valideret forankringen uafhængighed og tumorfremkaldende evne af de to små cellesubpopulation (i og II). I kolonien dannelse analysen, CXCR4 ^{+ lille celler dannet mange flere kolonier end gjorde CXCR4 - små celler (Fig 3A). Seriel fortynding eksperimenter af intraperitoneal podning i immundefekte mus afslørede, at CXCR4 + små celler også besad en højere tumorigen evne (tumor udvikling i 4/5 og 1/5 mus upon podning af 10 5 og 10 4 celler, henholdsvis) i forhold til CXCR4 - små celler (1/10 og 0/10 mus efter 10 5 og 10 4 celler, henholdsvis) (fig 3BI). Især alle fem tumorbærende mus efter podning med CXCR4 + små celler havde flere tumorknuder (fig 3Bii), og begyndte at udvikle blodige ascites inden for 3 uger (Fig 3Biii).}

Udover diffus-type GC cellelinjer, undersøgte vi også rollen som CXCR4 i en klinisk prøve (NSC-20C): en primær kultur etableret fra ascites af en diffus type GC patient med PD. I RT-PCR og Immunofarvning eksperimenter blev det bekræftet, at den primære kultur udtrykke CXCR4
men ikke CXCR7
(fig 3C). Vigtigere er det, CXCR4 ^{+ små celler sorteret fra NSC-20C besad både en repopulation evne (Fig 3Di og 3Dii) og en høj kolonidannelse evne (Fig 3Diii).}

Inddragelse af CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 akse i PD

i seks andre diffuse-type GC afledte cellelinier (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, og KATO III), vi yderligere undersøgt forholdet mellem ekspression status for to CXCL12 /SDF-1 receptorer (CXCR4 og CXCR7) og akkumulering af ascites i mus inokuleret med cancercellerne intraperitonealt. De RT-PCR-forsøg viste, at to GC cellelinier (HSC-39 og KATO III) stærkt udtrykt CXCR4
(Fig 4A). Endvidere begge disse xenotransplanterede mus havde flere tumorknuder og akkumulerede ascites (Fig 4B). I modsætning hertil har de to andre cellelinier (HSC-44 og HSC-58) viste ingen eller ganske lav CXCR4 ekspression, en enkelt eller nogle få peritoneal tumor nodule og ikke ophobes ascites (Fig 4B). Vi bekræftede også ophobning af ascites i en anden meget peritoneal-metastatisk sublinie 58As9 (afledt af HSC-58), som gav udtryk for CXCR7
på et højt niveau, men ikke CXCR4
. Et særligt tilfælde blev 44As3 stammer fra HSC44 der havde flere tumor knuder og akkumulerede ascites uden ekspression af både CXCR4
CXCR7
. Samlet set fandt vi en høj korrelation mellem ekspressionsniveauet af CXCR4
eller CXCR7
og aggressive fænotyper i syv af de otte cellelinjer undtagen 44As3.

I klinisk praksis , peritoneal lavage cytologi (CY) indeholder vigtige prognostisk information til GC patienter, fordi det kan detektere "afkom" af PD før dens makroskopiske manifestation. Selv i de tilfælde, uden PD (P0), CY-positive patienter har en dårlig prognose [33], hvilket tyder på, at en hel metastatiske CSCS er til stede i peritoneal lavage af disse patienter. Derfor vi næste undersøgt tilstedeværelsen af ​​CXCR4 ^{+ GC celler i peritoneale vask fra patienter uden klinisk betydende ascites. CXCR4
mRNA blev sjældent påvist i vaskene i 9 af 10 CY-negative patienter; imidlertid blev mRNA'et påvist i vaskene i 19 af 34 CY-positive patienter (S5A Fig). Vi bekræftede også tilstedeværelsen af ​​CXCR4 og cytokeratin dobbelt-positive små GC celler på de brostensbelagte-formede mesotelceller knyttet til kulturen parabol overflade i en kortsigtet (7 dage) kultur af patientens ascites (S5B Fig). I vores eksperimenter, de peritoneale mesotelceller sædvanligvis forsvandt i langtidsdyrkning efter ca. en måned. I en sådan langsigtet kultur, fandt vi også tilstedeværelsen af ​​nogle CXCR4- eller CXCR7-meget positive GC celler, der viste et karakteristika for epitelial-mesenkymale overgang, vimentin (VIM) -positiv (pil hoved i S5C Fig) men cytokeratin (PAN )-negativ. Derfor CXCR4 + GC celler er til stede i de maligne ascites ikke kun i den tidlige fase af peritoneal formidling (P0 /CY +), men også i mere gradvist karakteriseret ved en åbenlys ascites akkumulation. I summen, ovennævnte eksperimentelle og kliniske tyder på, at en del af CXCR4 + eller CXCR7 + GC celler har et potentiale for at udvikle peritoneal metastaser.}

Vi næste undersøgt funktionelle rolle CXCR4 signalvejen i PD. Udtrykket af CXCL12
/ SDF-1
i den menneskelige og mus peritoneal mesothelium blev bekræftet ved RT-PCR (figur 5A). Derfor blev undersøgt inddragelse af CXCL12 /SDF-1 for celleinvasion. Som vist i fig 5B, blev antallet af invasive 60As6 celler drastisk forøget med SDF-1, hvilket indikerer, at disse celler har evnen til at kemotaksi SDF-1. Lentiviral shRNA-induceret knockdown af CXCR4 i 60As6 svækket SDF-1-medieret invasion men ikke påvirket tumoren knudedannelse i bughulen af ​​mus (ikke vist). Desuden tvunget CXCR4 ekspression i en parentale cellelinje HSC-60 aldrig steg tumorigeniciteten (ikke vist). Tilsammen vores data tyder på, at CXCR4 er involveret i tilknytning til bughinden, men ikke i tumoren knude formation.

Vi viste skematisk processer direkte PD fra gastrisk væg i avancerede GC patienter gennem samspillet mellem CXCR4 ^{+ eller CXCR7 + CSCS og SDF-1-udtrykkende bughinden (fig 5C). På det første trin af metastase, blev CXCR4 + CSCS kaste ud af mavens væg ind i bughulen. Efterfølgende disse celler tillægger basalmembranen (BM) af peritoneum som reaktion på mesothelium-afledte kemoattraktant SDF-1 og kolonisere til dannelse knuder. Disse hændelser optræder på talrige steder over den peritoneale overflade, hvilket resulterer i en blokade af pumpe-funktion og derefter i ophobning af ascites.}

TGF-β fremmer celledifferentiering /asymmetrisk celledeling af CXCR4 + gastriske CSCS Salg

TGF-β er blevet rapporteret at formindske den side befolkning på ca. diffus-type GC cellelinier [34]. Derfor har vi undersøgt, om TGF-β har et potentiale til at ændre de særlige kendetegn ved CXCR4 ^{+ diffus-type GC celler. Vi undersøgte først ekspressionsniveauerne af TGF-p-receptorer i 60As6 celler og GC primære kulturer afledt fra to uafhængige patienter (NSC-16C og -22C). RT-PCR-forsøg viste, at begge af to TGF-β-receptor-gener ( TGFBR1
TGFBR2
) udtrykt i alle disse celler (S6 Fig). Vi undersøgte også lokaliseringen af ​​SMAD2 /3, da disse transkriptionelle faktorer er almindeligt kendt for at akkumulere i kernerne som reaktion på aktivering af TGF-β-signalering. Som vist i fig 6Ai, den nukleare akkumulering af SMAD2 /3 blev detekteret i 60As6 celler efter en 30 minutters behandling med 2 ng /ml TGF-β.}

Derefter undersøgte vi, hvordan CXCR4 ^{+ GC celler er påvirket af aktiveringen af ​​TGF-β-signalering. RT-PCR forsøg viste et fald på CXCR4
mRNA i 60As6 af TGF-β behandling (Fig 6Aii). Flowcytometri analyser afslører, at TGF-β behandling mindske CXCR4 + små celler fra 6,3% til 0,4% og øge CXCR4 - store celler fra 17,1% til 43,2% (figur 6B). I overensstemmelse med en stigning på terminalt differentierede celler, blev caspase 3/7 i hele cellepopulationen aktiveret af TGF-β behandling (Fig 6C). Derfor kan TGF-β har et potentiale til at inducere CXCR4 + CSCS til terminalt differentierede celler. Vi yderligere undersøgt effekten af ​​TGF-β på hvilende 60As6 celler, da CSCS menes at eksistere i en sovende tilstand under en hypovaskulære tilstand. Efter serum udtømning i 5 dage, CXCR4 + små celler øges op til 42% (fig 6Di). Desuden er en betydelig del af 60As6 populationen var i G1-fasen (fig 6Dii).}

• PLoS ONE: SIRT3 Forbedrer Glycolysis og spredning i SIRT3-udtrykkende Gastric Cancer Cells
• PLoS ONE: MicroRNA-137 Bidrager til afdæmpet tumorigenese i Human Gastric Cancer ved Målretning AKT2