PLoS ONE: epigenetinius Triukšmo slopinimo miR-338-3p Prisideda prie tumorogeniš- skrandžio vėžio nukreipiant SSX2IP

Anotacija

MicroRNA neseniai buvo pripažinta kaip vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis ir metastazių. Čia mes pranešti, kad Pasaulis-338-3p buvo epigenetically nutildė skrandžio vėžiu, o jo žemyn reguliavimas reikšmingai koreliavo su skrandžio vėžio klinikos funkcijų. Įdomu pastebėti, atkurti Pasaulis-338-3p išraiška SGC-7901 skrandžio vėžio ląsteles slopina proliferaciją, migraciją, invazija ir tumorogeniškumo in vitro parsisiųsti ir vivo
, bent jau iš dalies per apoptozės sužadinimui. Be to, mes įrodyti onkogenas SSX2IP yra miR-338-3p taikiniu. Mes siūlome, kad Pasaulis-338-3p veikia kaip naviko slopintuvas skrandžio vėžio, ir metilinimo statuso savo CpG saloje galėtų būti potencialus diagnostikos persekiotoją skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Li P Chen X S L, Li C, Zhi Q, J. B, ir kt. (2013) epigenetinius Triukšmo slopinimo miR-338-3p Prisideda prie tumorogeniš- skrandžio vėžio nukreipiant SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. Doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

redaktorius: Alfons Navarro Barselonos universitetas, Ispanija

Įstojo: Sausis 17, 2013 m Priimta 10 gegužės 2013 m Paskelbta: Birželis 24, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Li et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (skaičių 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 ir 81272749), mokslas ir technologijos (11jc1407602 skaičių 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200 ir 101409042000) Komisijos Šanchajaus savivaldybė, Šanchajaus Key drausmės ( S30204) ir pagrindiniai projektai Nacionalinės mokslo & Technologijos ramstis programa Kinijoje (numeriai 2008BA152B03 ir 2011BA203191), Kinija Docentas mokslo fondas (numeris 2011M500796). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra piktybinis navikas su dideliu sergamumu ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1]. Ankstyvoji diagnostika norma skrandžio vėžys yra žemas, o pacientai paprastai yra sunku diagnozuoti, kol vėžys išsivystė į įpusėjęs arba metastazių. Taigi, ji yra labai svarbi atlikti išsamų tyrimą dėl skrandžio vėžio patogenezės ir ieškoti naujų molekulinių formuotojams ir terapinių tikslų.

mikro RNR yra maži RNR, kad reguliuoti genų ekspresiją, ir jie dalyvauja į biologinių signaliniu keliu, įvairių [2]. Keli tyrimai parodė reikšmingą skirtumą mikro RNR raiškos profiliavimo tarp vėžinių ląstelių ir ląstelių, gautų iš sveikų audinių, nurodant, kad mikro RNR suvaidino svarbius vaidmenis Tumorigenesis [3], [4]. Taigi, mikro RNR neseniai tapo genetinės diagnostikos ir gydymo tikslo HotSpot kaip nauji onkogenų ar slopintuvas genų [5], [6]. Nenormalus išraiška mikro RNR audiniuose arba serume yra glaudžiai susijęs su keliais žmogaus piktybinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio [7], [8], ir keletas žemyn reguliuojamos mikro RNR skrandžio vėžio audiniuose turi naviko slopina funkcijas. Pavyzdžiui, Tegul-7 MicroRNA šeima buvo pirmasis nustatė kaip anksčiau slopinančioje, represuoti RAS IR C-MYC išraiška pritaikymo lygį [9]. Sąvoka lygis atvangos 7a ženkliai sumažėja skrandžio auglių, o Rasa baltymas yra žymiai didesnis skrandžio naviko [10]. Be to, miR-15b, miR-16 ir miR-21 ir tt buvo prijungtas prie vystymosi ir klinikine diagnoze skrandžio vėžio [11], [12]. Mūsų grupė taip pat pranešė vėžio vaidmenį PPN-126, PPN-409-3p ir Pasaulis-155 skrandžio vėžio [13] - [15]

MicroRNA Mikrogardelė buvo atliktas aptikti Mirna profilius skrandžio. vėžys, ir mes nustatėme, kad miR-338-3p buvo žymiai žemyn reguliuojama (neskelbtų duomenų). Pasaulis-338-3p, esančios chromosomų 17q25.3 su 22 NT, buvo pranešta priono sukeltos neurodegeneraciją kaip PPN-338-3p išraiškos pirmasis ilgio mažinamas pelių smegenyse infekuotų pelių pritaikytos Sunkiai [ ,,,0],16]. Pasaulis-338-3p gali reguliuoti iRNR lygį savo šeimininko genų apoptozę susijusių tirozino kinazės (AATK) žiurkės neuronų [17]. Kita vertus, miR-338-3p buvo reguliuojama pacientams, sergantiems pavienių šoninės amiotrofinės sklerozės (sals), kitas nervų sistemos pažeidimų [18] rūšies. Svarbiausia, miR-338-3p į Tumorigenesis vaidmuo buvo anksčiau siūlė, kaip Pasaulis-338-3p žemyn reguliuojama tiesiosios žarnos vėžio [19], ir reglamentuoja Hepatito B virusas X baltymo (HBX) slopina proliferaciją ir invazija iš hepatomos ląstelių privalomas nukreipti genus CyclinD1 ir smoothened į kepenų ląstelių karcinoma [20] - [22]. Tačiau miR-338-3p vaidmuo GC vis dar nežinoma.

Šiame tyrime mes toliau nagrinėjo žemyn reguliavimo išraišką PPN-338-3p GC audinių, palyginti su pacientų atitiko normalu audiniai, ir nustatė, kad sąvoka lygis miR-338-3p buvo glaudžiai koreliuoja su clinicopathologic kintamųjų GC. Negimdinis išraiška miR-338-3p slopina proliferaciją, invazija ir metastazes skrandžio vėžio ląsteles, mažina tumorogeniškas gebėjimą skrandžio vėžio ląstelių nuogas pelių ir skatina apoptozę. Mes taip pat rodo, kad Pasaulis-338-3p gali veikti kaip naviko slopintuvas tiesiogiai nukreipti SSX2IP. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-338-3p yra potencialus diagnostikos žymeklį ir terapinis taikinys skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

1. Mobilaus ryšio linijos ir kultūros

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901, NVI-N87, BGC-823 ir AGS buvo įsigytos iš Šanchajaus institutai biologijos mokslų, Kinijos mokslų akademija [23] - [26]. Kato-III ir SNU-1 buvo įsigytas iš ATCC (American tipas Kultūrų rinkinys) [24], [27], MKN28 ir MKN45 buvo gauti iš Japonijos vėžio tyrimų išteklių banko [28], kad įamžino skrandžio epitelio ląstelių linija, GES -1 buvo dovana prof Feng Bi (Huaxi ligoninė, Sičuano universitetas, Chengdu, Sichuan provincija, Kinija) [29], [30]. HEK293T, žmogaus embrioninių inkstų ląstelių linija, buvo išsaugota mūsų institute. Skrandžio vėžio ląstelių linijas, buvo auginamos RPMI1640, papildytoje 10% FBS (vaisiaus jaučio serumo), esant 37 ° C temperatūroje, drėgnoje atmosferoje 5% CO2. HEK293T ląstelės buvo auginamos DMEM (Dulbecco modifikuota Eagle vidutinės) papildytas to paties kultūringas būklės aukščiau.

2. Etikos taisyklės

Parašė informuotas sutikimas tyrime buvo gauti iš visų dalyvių. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas etikos komiteto Ruijin ligoninė, medicinos mokyklos, Šanchajaus Jiao Tong universiteto.

3. Audinių mėginiai

pirminis navikas audiniai ir suderintus ne navikų audiniuose buvo renkami iš 66 pacientų, kuriems atliekama radikali gastrostomija tuo Chirurgijos departamento Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos. Nė vienas iš pacientų gautos priešoperacinė gydymą. Visi audinių mėginių buvo surinkti su pacientų informuoto sutikimo ir patvirtino patologinį tyrimą, o histologinis rašyti buvo grindžiamas Lauren klasifikacija. Į TNM klasifikacijos apibrėžimai buvo pagal Tarptautinės Sąjungos kovos su vėžiu (2002).

4. RNR išskyrimas ir qPCR

Viso RNR buvo išskirta iš ląstelių linijų ir audinių mėginių Pasaulis
Vana ™ Mirna išskyrimas Kit (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Kokybė ir kiekis RNR bandiniuose buvo vertinamas standartinio elektroforezės ir spektrofotometriniu metodais. Sąvoka lygis miR-338-3p ląstelių linijų ir audinių mėginių buvo matuojamas pagal qPCR ir apskaičiuotas, kaip aprašyta [13]. Sąvoka lygis SSX2IP mRNR buvo matuojamas qPCR pagal TaqMan® genų ekspresijos tyrimus protokolą (Applied Biosystems). GAPDH iRNR lygis buvo naudojamas normalizuoti.

5. DNR išskyrimas bei metilinimo analizė

Genomo DNR iš audinių mėginių buvo išgrynintas naudojant DNAzol (Invitrogen). Natrio bisulfito konversija buvo atliktas naudojant Qiagen Epitect bisulfite rinkinį (QIAGEN) pagal gamintojo. Metilinimo statulos buvo atliktas metilinimas konkretaus PGR (MSP). Už denatūruotą ar nedenatūruotu DNR pradmenys buvo sukurti programinės įrangos Metilo Gruntas Express v1.0 (ABI) .Sriegines metilinimas priekį gruntas PPN-338-3p CPG: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 "ir atvirkštine gruntas: 5 ' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ", The unmethylation priekį gruntas PPN-338-3p CPG: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3" ir atvirkštinis gruntas: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 "

6.. Praeinantis transfekciją Mirna imituoja

Mirna-338-3p imituoja ir neigiamus kontrolinius imituoja buvo įsigytos iš GenePharma (Šanchajus, Kinija) .Cells buvo pasėjamos į ląstelių kultūrų lėkštelėse 20 val prieš transfekciją užtikrinti 70% ląstelių santakoje momentas transfekciją. Transfekciją Mirna imituoja į ląsteles buvo atliekami naudojant Lipofectamine2000 (Invitrogen) pagal gamintojo tvarka. Į Mirna imituoja dirbo galutinė koncentracija 100 nm. 48 h po transfekciją, qPCR ir Vakarų dėmė buvo atlikta.

7. Ląstelių proliferaciją Analizės

ląstelių proliferacija buvo vertinama WST (vandenyje tirpus tetrazolio druska) tyrimas naudojantis mobiliuoju skaičiavimo KIT-8 (Dojindo) pagal gamintojo instrukcijas. 24 h po transfekciją su Mirna imituoja, ląstelių (2 × 10 ^{3 ląstelių /gerai) buvo sėkla į 96-duobučių lėkštelėse. Plokštelės buvo inkubuojamos 5 dienas. Gyvybingų ląstelių skaičius buvo įvertintas matuojant optinį tankį esant 450 nm bangos ilgiui.}

8. Minkštas Agaras kolonija formavimas Analizės

GC ląstelės transfektuotose Mirna imituoja buvo sumaišymo su 0,3% minkšta agaro RPMI1640 sudėtyje turintys 10% FBS ir sluoksniuotos ant 0,6% įtvirtino agaro RPMI1640, kurioje yra 10% FBS į 6-duobučių lėkštelėse (1 × 10 ^{3 ląstelių /gerai). Plokštelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _{2. Kolonijos, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 50 ląstelių buvo skaičiuojami.}}

9. Mobilusis Migracija ir invazija Analizės

Migracija ląstelių buvo atliekama naudojant QCM ^{TM24-Na Kolorimetrinis Migracijos Analizės komplektas (Millipore) pagal gamintojo instrukcijas. Dėl invazijos metodu, Mobilusis invazija Analizės komplektas (Millipore) buvo naudojamas pagal gamybos instrukcijas. Ląstelės (1 × 10 5) 300 pL serumo neturinčioje terpėje buvo pridėta prie viršutinių kamerų ir kultivuojamos 48 h. Ne migravimas ar ne užplūsta ląstelės buvo pašalintas medvilninius tamponai, ląstelių, kurios migravo arba įsiveržė į membranos apačioje buvo tamsintas su ląstelių dėmių buferio numatyta, kad tyrimo metu komplektas ir skaičiuojami pagal mikroskopu ir Fotografuota. Trys nepriklausomi eksperimentai buvo atliekami tomis pačiomis sąlygomis.}

10. Apoptozė analizė

Mobilusis apoptozė analizė, suformuota su aneksinu-FITC apoptozę nustatymo rinkinys I (BD), pagal gamintojo instrukcijas. Kiekvienas tyrimas buvo pakartotas tris kartus ir kartojamas tris kartus nepriklausomai. Branduolinės susitraukimo susijęs su apoptozės funkcija buvo nustatyta, Hoechst 33342 (Beyotime) pagal protocol.The morfologija buvo regimos fluorescencinio mikroskopo, kad buvo malonu esant bangos ilgiui 350 nm ir išmatuoto 460 nm.

11. Statybos plazmidžių ir liuciferazės Aktyvumas Analizės

laukinio tipo (WT) fragmentas 3'UTR iš SSX2IP ar vietų mutantas (Mut) 3'UTR srities ir SSX2IP turinčio spėjamą MIR-338-3p jungimosi vietų susintetinti , Fragmentai buvo klonuoti į pMIR-ataskaita liuciferazės vektoriaus (Ambion), kuriame Firefly parsisiųsti ir pavadino pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{WT ir pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells buvo sėklų į 24-duobučių lėkštelėse 24 val iki transfekciją. 500 ng pMIR /SSX2IP-3'UTR srities WT arba pMIR /SSX2IP-3'UTR Mut buvo gerai perkeltų į kiekvieną, kartu su 20 ng PRL-TK vektoriaus (Promega), kuriame, Renilla
liuciferazė ir 60 pmol mir-338-3p ar kontrolės imituoja. Ląstelės buvo nuimta po 48 h transfekciją. "Firefly parsisiųsti ir Renilla
liuciferazės veikla buvo matuojamas naudojant dvejopo liuciferazė reporterio testą (PROMEGA) pagal gamintojo instrukcijas.}

12. Stabilus transfekcijq miR-338-3p ekspresijos vektorius

pSilencer-Pasaulis-338-3p vektorius ir pSilencer-Pasaulis-kontrolė vektorius buvo pernešta į SGC-7901 ląstelių atitinkamai naudojant Lipofectamine2000 (INVITROGEN), ir atrinkti 100 mikrogramų /ml higromicino B (Invitrogen) 4 savaites. Stabiliai Transfekuoti ląstelių klonai buvo nuskintos ir palaikoma pusę atrankos koncentracijos.

13. Navikas ksenografiniuose Modelis

SGC-7901 ląstelių (2 × 10 ^{6 ląstelių /pelė) stabiliai transfektuotose pSilencer-miR-338-3p ar pSilencer kontrolės vektorius buvo po oda švirkščiamas į 4 savaičių senumo vyrų nude pelėms (Institute of zoologijos Kinijos mokslų akademija, Šanchajus, Kinija) .Sriegines pelėms buvo tikrinami kartą per savaitę, naviko mazgeliai buvo matuojamas slankmačiu. Pelės buvo numarinti 4 savaites po injekcijos, ir augliai buvo pašalinta ir pasverti. Naviko tūris buvo vertinamas pagal šią formulę:. Kiekis = (plotis + ilgis) /2 × plotis × ilgis × 0.5236.Tumor augimo kreivės buvo apskaičiuotas}

14. Imunohistocheminis

aptikimas SSX2IP buvo atliktas parafino sekcijų su anti-SSX2IP antikūnų (Abcam, skiedimas 1:1000). Imuninė kompleksas buvo ryškinamos su Dako REAL ^{TMEnVision ™ aptikimo sistema, peroksidazės /DAB, Triušis /Pelės (Dako), pagal gamintojo tvarka. Branduolys buvo counterstained hematoksilinu.}

15. Statistinė analizė

santykiai tarp Mir-338-3p ekspresijos lygio ir clinicopathologic parametrų buvo analizuojami asmuo X
^{2 testą. Skirtumai tarp grupių skirtumai buvo analizuojami naudojant Studentas , T
testus. Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą (SPSS Inc, Čikaga, IL, JAV) ir P
< 0,05 buvo laikomas reikšminga}

Rezultatai

1. , Iš miR-338-3p išraiška yra žemyn reguliuojama GC ląstelių linijų ir audinių

Jei tyrinėti PPN-338-3p GC vaidmenį, mes pirmą kartą palygino raiškos lygis PPN-338-3p į aštuoni skrandžio vėžio ląstelių linijas, kurių įamžinta normalų skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos (GES-1). Kaip parodyta Fig. 1A, PPN-338-3p buvo gerokai žemyn reguliuojama GC ląstelių linijų, palyginti su GES-1. Norėdami patvirtinti šį rezultatą, mes taip pat palygino PPN-338-3p išraiškas GC audinių ir gretimų ne navikų audiniuose. 66 GC suporuotas mėginiai buvo įtrauktos į šį tyrimą. Rezultatai rodo, kad vidutinis raiškos lygis miR-338-3p buvo reikšmingai mažina reguliuojama navikų audiniuose, palyginti su gretimų ne-navikų audiniuose (1b pav.). Be to, mes išaiškintas tarp Pasaulis-338-3p saviraiškos ir clinicopathologic veiksnių koreliaciją. Kaip parodyta 1 lentelėje 59,1% (39/66) GC mėginių parodė žemyn reguliavimą PPN-338-3p žemiau dvejopas cut-off (santykinė išraiška santykio < 0,5), ši situacija buvo laikomas gerokai žemyn -regulated. Remiantis šia cut-off, 66, klinikiniai atvejai buvo suskirstyti į dvi grupes: Pasaulis-338-3p mažesnis išraiška grupė (n = 39) ir Pasaulis-338-3p didesnė raiška (N = 27). Apatinė išraiška grupė parodė polinkį didesnių naviko dydis, daugiau limfmazgių metastazių, giliau vietos invazija ir daugiau pažangių TNM etape, tačiau reikšmingai koreliuoja su amžiumi, lytimi ar histologinis tipas (1 lentelė).

2. Pasaulis-338-3p yra Epigenetically Silenced skrandžio vėžio

Kaip epigenetinius triukšmo slopinimo yra bendra priemonė žemyn reguliavimo Mirna išraiška [31], [32], mes nusprendėme analizuoti CPG sala pasiskirstymą promotoriaus regionas miR-338-3p metilo Gruntas Express v1.0 programa. Rezultatai parodė, kad CpG salos egzistuoja skyriuje (-690 iki -241) iki transkripcijos starto vietoje (TSS). Mes išnagrinėjome metilinimo statusą CpG salų promotoriaus regione metilinimo konkrečių PGR (MSP), apimantis -366 regioną -576 (2a. Pav). Naudojant JEP, mes nustatėme, kad Mir-338-3p CpG sala buvo plačiai metilinti GC ląstelių linijų, palyginti su skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos (GES-1). Kaip ir tikėtasi, gydymas su 5-aza sukeltas didelę demetilinimo (2B pav.). Tipinės rezultatai MSP analizės PPN-338-3p GC navikų audiniuose ir suderinti gretimų ne navikų audiniuose buvo parodyta pav. 2C. Metilinimo lygis PPN-338-3p CpG salų vėžinių audinių ir gretimų ne navikų audiniuose iš 66 GC pacientų buvo 78,79% ir 24,24% atitinkamai (** P
. ≪ 0,01, 2D pav) , Kai ROC kreivė kreivė ir plotas po koncentracijos kreive (AUC) ir denatūruotą statuso PPN-338-3p GC buvo apskaičiuotos, AUC buvo 0,773 ± 0,042, žymiai didesnis negu hipotezei ( "P <
0,001), ir 95% pasitikėjimo intervalas buvo 0,690 iki 0.856 (pav. 2E). Taigi, metilinimas statusas miR-338-3p CpG saloje galėtų būti potencialus molekulinės žymeklis GC.

3. Pasaulis-338-3p Slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją

Nuo Pasaulis-338-3p yra gerokai žemyn reguliuojama GC, kaip parodyta pirmiau, ji gali veikti kaip naviko slopintuvas. Todėl kitą kartą nustatyti, ar raiškos miR-338-3p skrandžio vėžio ląsteles galėtų turėti įtakos ląstelių augimą. Sintetinis Pasaulis-338-3p imituoja ar neigiami kontroliniai imituoja buvo pernešta į SGC-7901 ląstelių, kurioje išraiška lygis Mir-338-3p yra mažiausia, po WST tyrimo stebėti ląstelių augimą.

negimdinis išraiška miR-338-3p į SGC-7901 ląstelių buvo patvirtinta qPCR ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių transfektuotose Pasaulis-338-3p imituoja augo žymiai lėčiau nei kontrolinėje grupėje (3a pav.) (* p
< 0,05, ** P <
0,01). Norėdami papildomai apibūdinti PPN-338-3p ląstelių augimui poveikį, minkštas-Ager kolonija formavimas tyrimas buvo atliktas. Mes nustatėme, kad kolonijų skaičius iš SGC-7901 ląstelių, transfekuotų su miR-338-3p imituoja buvo žymiai mažiau negu kontrolinės grupės (pav 3B-C temperatūroje.) (** P
< 0,01) , Nuosekliai, slopinimas miR-338 sukelto į SGC-7901 platinimu (pav S2 Failų S1, * P
. ≪ 0,05). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas kontrolės GES-1 ląstelių (pav S1 A-B Failų S1, * P
. ≪ 0,05). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338-3p slopina augimo tempus tiek GC ląstelių ir skrandžio epitelinių ląstelių
, in vitro.

4. Pasaulis-338-3p slopina Migracija ir invazija GC Cells in vitro

Remiantis mintimi, kad Pasaulis-338-3p tarnauja kaip naviko slopintuvas GC, mes toliau nagrinėti jo poveikį ląstelių migracija ir invazija, kritinis ryžtingas piktybinės ligos progresavimo ir metastazių. Kaip parodyta Fig. 4, migracinių SGC-7901 ląstelių transfektuotose Pasaulis-338-3p imituoja skaičius buvo gerokai mažesnis nei kontrolinėje grupėje (105,00 ± 11.16 vs 145.00 ± 7.00 ** P
. ≪. 0,01 4 pav A-B), ir skaičius invazinių SGC-7901 ląstelių transfektuotose miR-338-3p buvo gerokai mažiau, palyginti su kontroline grupe (41,33 ± 4,04 vs 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. pav., C-4 D). Nuosekliai, slopinimas Pasaulis-338-3p sukeltos migracijos ir invazijos SGC-7901 ląstelių (pav S3 Failų S1, * P
. ≪ 0,05). Priešingai, PPN-338-3p neturėjo įtakos migracijos GES-1 (pav. S1 E Failų S1), tikėtina, nes GES-1 ląstelės trūksta migracijos ir vėžinių ląstelių invazinių pobūdį. Šie rezultatai demonstravo PPN-338-3p vaidmenį slopinant tiek migracija ir invazija GC ląsteles.

5. Pasaulis-338-3p gali sukelti skrandžio vėžio ląstelių Apoptozę

Jei išsiaiškinti PPN-338-3p mechanizmą GC ląstelių dauginimąsi slopinančio poveikio, mes patikrinome apoptozę analizė tėkmės citometrijos. Rezultatai parodė, kad apoptozės lygis buvo gerokai padidėjo Pasaulis-338-3p imituoja transfekuota grupėje, palyginti su kontroline imituoja transfekuota grupės (** P
< 0,01) (pav. 5A-B). Mes taip pat išnagrinėjo morfologines savybes apoptozės įskaitant kondensuotu chromatino ir branduolinės fragmentacijos Hoechst 33342 dažymą ir patvirtino, kad apoptozės norma buvo padidinta Pasaulis-338-3p imituoja Transfekuoti ląstelės (pav. 5c). Nuosekliai, slopinimas Pasaulis-338 inhibuoja apoptozės SGC-7901 ląstelių (S4 pav File S1, * P
. ≪ 0,05). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas kontrolės GES-1 ląstelių (pav S1, C-D Failų S1 ** P
. ≪ 0,01). Šie rezultatai parodė, kad padidėjusi miR-338-3p indukuoja apoptozę GC ląstelių, kurios galėtų prisidėti prie augimo slopinimas savybių PPN-338-3p.

6. Pasaulis-338-3p Slopina tumorogeniš- ir padidina apoptozę vivo

Kitas išbandytas, ar negimdinis išraiška miR-338-3p gali įtakoti augimą ir apoptozę skrandžio naviko in vivo .
SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su mir-338-3p ekspresijos vektoriumi (p Duslintuvas
-miR-338-3p) arba valdymo vektorių (p Duslintuvas
-miR -kontrolė). Stabilios klonai su arba p , duslintuvas
-miR-338-3p arba p Duslintuvas
-miR kontrolės atrinko ir švirkščiamas po oda į nuogas pelėmis ir auglių formavimasis buvo stebimi. SGC-7901 ląstelių transfektuotose miR-kontrolė parodė laipsnišką augimą, tačiau buvo slopinamas, kai negimdinis išraišką PPN-338-3p. Po 28 dienų, nuogas pelėms buvo numarinti, ir buvo matuojamas naviko masė ir tūris (pav. 6 A-E). Vidutinis svoris navikų, atsiradusių iš pSil encer
-miR-338-3p ląstelių grupė buvo gerokai mažesnis nei auglių iš p Duslintuvas
-miR kontrolės ląstelių grupė (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229.52 mg ** p
. < 0,01)

Jei išnagrinėti, ar apoptozė prisideda prie šios pastebėta vivo
naviko augimo slopinimą ant miR-338-3p per -expression, TUNEL tyrimas buvo atliktas naviko audiniuose. Rezultatai parodė, kad navikų audiniuose, iš p Duslintuvas
-miR-338-3p pateikta žymiai daugiau teigiamų dažymo ląsteles, lyginant su kontroline grupe (** P
. ≪ 0,01, pav 6F-G ). Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-338-3p slopina skrandžio tumorigenezei in vivo
, bent iš dalies stimuliuoja apoptozę in situ.

7. Pasaulis-338-3p tikslai 3'-UTR iš onkogeno SSX2IP

Kaip miRNAs dažnai reguliuoti tikslinių genų ekspresiją, mes ieškoma MIR-338-3p anketa tariamą tikslus naudojantis interneto paieškos įrankiais (pvz TargetScan, Microrna.org ir PicTar). Numatytos visos naudojamų programų genai buvo laikomi kandidatėmis tikslus PPN-338-3p. Tarp visų hitai, SSX2IP sukelia mūsų dėmesį, ankstesni tyrimai parodė, kad SSX2IP yra ūminis mieloleukemija susijusio antigeno ir galimas imunoterapija taikiniu leukemija [33] - [35], o mūsų Darbo parodė, kad SSX2IP skatina invazija ir migracija kepenų ląstelių karcinoma ląstelės ir prisideda prie atsparumo chemoterapijos [36].

Vienas potencialus Pasaulis-338-3p privalomas svetainė buvo prognozuojama pagal SSX2IP 3'UTR srities (pav. 7a). Norėdami patvirtinti šią sąveiką, mes įdėti laukinio tipo arba mutantas 3'UTR fragmentas SSX2IP į pMIR-ataskaitos liuciferazės vektorių. Gaunami konstruktai buvo bendrai perkeltų su Pasaulis-338-3p imituoja ar kontrolės imituoja į HEK293T ląstelių, po liuciferazės reporterio testą. Santykinis liuciferazė veikla pMIR /SSX2IP-3'UTR srities ^{WT, bet ne pMIR /SSX2IP-3'UTR Mut, buvo gerokai numalšino miR-338-3p (** P pervežimas . <. 0,01), palyginti su kontrolinių imituoja (7b pav), nurodant, kad Pasaulis-338-3p tiesiogiai jungiasi prie SSX2IP 3'UTR srities veikti kaip slopintuvas}

kitas išnagrinėjo įtaką miR-338-3p dėl SSX2IP išraiškos, matuojant iRNR ir baltymų lygius SSX2IP po transfekuoja SGC-7901 ląsteles Pasaulis-338-3p ar kontrolės imituoja. Kaip parodyta Fig. 7C-D, PPN-338-3p neturėjo SSX2IP pervežimas iRNR lygio poveikį vertinant pagal qPCR, bet sukelia žymiai sumažinti SSX2IP baltymų lygį, palyginti su kontrolės-perkeltų. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338-3p slopina SSX2IP išraiška po transkripcijos lygio, tikėtina, per privalomas į SSX2IP 3'UTR srities. Visų pirma, mes taip pat nustatė, kad capase-3 ir procasepase-3, du svarbu Apoptozė genai, buvo atitinkamai sumažėjo (7C pav.).

8. Iš miR-338-3p išraiška yra atvirkščiai koreliuoja su Expression lygis SSX2IP Baltymai skrandžio vėžio

Pasaulis-338-3p žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ir SSX2IP yra remiama taikinio geno PPN-338 -3p, skatino mus spėlioti, kad SSX2IP gali būti padidėjusi skrandžio vėžio audiniuose ir, palyginti su suderintų ne navikų audiniuose.

Imunohistocheminis analizė SSX2IP antigeno atskleidė dažymo padėtį SSX2IP baltymų navikų audiniuose ir atitiko ne navikų audiniuose, 66 skrandžio vėžiu samples.65% (43/66) skrandžio vėžio audiniuose rodomas padidėjęs immuostaining už SSX2IP baltymų, lyginant su suderintų ne navikų audiniuose. Visų pirma, 84% (31/37) skrandžio vėžio audiniuose rodomas padidėjęs imunodažymu GC pavyzdžių Mir-338-3p žemos raiškos grupės, o duomenys yra 41% (12/29) į Mir-338-3p aukštos išraiška grupė. Taigi, iš PPN-338-3p ir SSX2IP skrandžio vėžio audiniuose išraiškos analizė patvirtino, kad atvirkštinė koreliacija tarp PPN-338-3p išraiškos ir jos tikslinio geno SSX2IP (asmuo chi kvadrato testas egzistavimą: P
< 0,001, Ietininkas Koreliacija r = -0,442 P
< 0,001, 8 pav)

9... Negimdinis išraiška SSX2IP gelbsti fenotipų sukėlė daugiau nei gaminančių MIR-338-3p GC Cells

Jei SSX2IP yra pagrindinė tikslinė numalšino miR-338-3p GC, negimdinis išraiška SSX2IP turėtų gelbėti fenotipų sukelia miR-338-3p per gamybos GC ląsteles. Norėdami patikrinti šią idėją, ir SSX2IP ekspresijos vektorius arba tuščias vektorius atskirai perkeltų į SGC-7901, po to citologinių tyrimų siekiant įvertinti ląstelių proliferaciją, migraciją, invazija ir apoptozę. Kaip ir tikėtasi, padidėjusią SSX2IP iš dalies arba visiškai panaikina slopinantį poveikį PPN-338-3p GC ląstelių apie kiekvieną aspektą Mes išnagrinėjome (9 pav. A-D). Kita vertus, SSX2IP neturi įtakos miR-338-3p (pav. S5 į failo S1) išraiška. Taigi, mes padarė išvadą, kad vėžys slopintuvas funkcija miR-338-3p GC yra bent iš dalies slopina per savo taikinio geno SSX2IP.

Diskusijos

Šiame tyrime mes nustatėme, kad mažas -expression miR-338-3p buvo kliniškai susiję su didesniu naviko dydis, daugiau limfmazgių metastazių, giliau vietos invazijos ir pažangios TNM etape. Tuo citologinis lygio, iki reguliavimą PPN-338-3p inhibuoja platinimu, kolonijos formavimas, invazijos ir migracijos skrandžio vėžio ląsteles. Be to, per išreikšti Pasaulis-338-3p skrandžio vėžio ląsteles žymiai sumažino tumorigenezei nuogas pelių in vivo
. Kartu paėmus, mūsų rezultatai aiškiai rodo, auglio slopinamojo vaidmenį PPN-338-3p skrandžio vėžio.

miRNAs neseniai buvo pripažintas svarbiausių naviku susijusio reguliavimo veiksnių. Nors reguliavimo mechanizmas miRNAs raiškos Tumorigenesis vis dar neaišku, epigenetinius reguliavimas buvo pasiūlyta vaidinti svarbų vaidmenį [31] [32]. DNR metilinimas įvyksta daugiausia CpG salos paprastai esančių promotoriaus regione geno, maždaug 70% Promotorių regionų žmogaus genomo yra daug CpG salos [37]. Sumažintos posakiai PPN-34b, PPN-129 ir miR-10b visi sukelia hypermethylation į vykdytojų [38], [39]. Suderinamas su šios sąvokos, metilinimo lygis CpG salos PPN-338-3p skrandžio vėžio audiniuose iš tiesų buvo rastas didesnis nei suderintų gretimų ne navikų audiniuose, o tai rodo, kad Pasaulis-338-3p yra epigenetically nutildė GC. Šio epigenetinio tylos PPN-338-3p skrandžio vėžio priežastis išlieka silpnas, ir mes spėlioti, kad veiksniai, pavyzdžiui, CagA, kuris buvo pranešta anksčiau, kad epigenetically įtakos mikro RNR išraišką skrandžio vėžio [40], gali dalyvauti šiame reglamente , Svarbu tai, kad hiper-metilinimas statusas miR-338-3p rengėjas yra potencialus biologinis skrandžio vėžio diagnozę.

Nuo miRNAs funkcija per reguliuojant jų vartotojų genų ekspresiją, pagrindinis klausimas dėl, kaip Pasaulis-338- 3p prisideda prie GC, kuris genas (-ai) ji reguliuoja.

Čia mes identifikuoti SSX2IP kaip svarbus naujų tikslą PPN-338-3p, ir jei abu citologinis ir histologinis įrodymų, naviko skatinimo vaidmenį SSX2IP GC. Daug tyrimų parodė, kad SSX2IP yra ūminis mieloidinė leukemija susijusio antigeno ir potencialus imunoterapija tikslas leukemijos [33] - [35]. Svarbu tai, kad SSX2IP buvo parodyta mūsų ankstesnių tyrimų skatinti judrumą, invazija ir migracijos ir atsparumą hepatomos ląstelių chemoterapija, nurodant savo svarbų vaidmenį kuriant ir metastazių. Jo homologiczne genas graužikams yra ADIP
(afadin DIL domeno bendrauja baltymų), amino rūgščių seka ADIP baltymų pele ir žiurkėmis parodė 88% ir 87% identiškumą su SSX2IP baltymų, atitinkamai. ADIP lokalizuotas ląstelių ląstelių adherens sankryžas, o tai gali skatinti ląstelių mobilumą aktyvuojant Rac1 per Vav2 [41], [42]. Jis spėja, kad SSX2IP galėtų skatinti ląstelių judrumą, invazija ir metastazes per aktyvuoti Rac1.

Įdomu, kad Rac1 išraiška skrandžio vėžio audiniuose buvo didesnis nei suderintų gretimų ne navikų audiniuose, jo išraiška lygis buvo žymiai susijęs su TNM etape. 7 skrandžio vėžio ląstelių linijų, iš Rac1 išraiška buvo didesnis nei skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos (GES-1) [43], kuris buvo sutapo su šio reiškinio, mes rasti su miR-338-3p skrandžio vėžio ląstelių ir audinių. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338-3p, kaip slopinančio veiksnys skrandžio vėžiui, gali sumažinti tikslinio geno SSX2IP išraišką slopinti Rac1 aktyvacijos. Iš SSX2IP dalyvavimas kelių vėžio sustiprina biologinę ir fiziologinę reikšmę Mir-338-3p /SSX2IP kaskadą vėžio išsivystymo, ir paskatino mus toliau tirti PPN-338-3p /SSX2IP būklės kitų rūšių vėžio. Nustatyti kitus galimus tikslus PPN-338-3p taip pat yra nebaigta.

Apibendrinant, šis tyrimas pirmasis aprašė MIR-338-3p kaip naviko slopintuvas, kuris dažnai tylėti per epigenetinio hypermethylation tuo promotoriaus regionas skrandžio vėžio. Funkciškai, PPN-338-3p slopina metastazėms bruožus GC ląstelių, tokių kaip dauginimosi, migracijos ir invazijos in vitro pervežimas ir sumažina GC ląstelių tumorogeniš- stimuliuoja apoptozę vivo
. Be to, mes nustatyti SSX2IP kaip esminis taikinio geno PPN-338-3p GC plėtrai.

• PLoS ONE: Pooperacinis chemoradioterapija palyginti Pooperacinis chemoterapija Visiškai rezekcijos skrandžio vėžio su D2 limfadenektomija: metaanalizė
• PLoS ONE: Mir-184 Įrišimas-Svetainės rs8126, T > C polimorfizmas į TNFAIP2 yra susijęs su rizika skrandžio vėžio