PLoS ONE: geografinį pasiskirstymą LGR5 + ląstelių koreliuoja su skrandžio vėžio progresavimo

Anotacija

Šiame tyrime mes patikrinome paplitimas, histoanatomical paskirstymą ir naviko biologinio reikšmė WNT tikslas baltymų ir vėžio kamieninių ląstelių žymuo LGR5 į navikų virškinimo sistema. Skirtumas išraiška LGR5 buvo tiriamas transkripcijos (realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos) ir pritaikymo lygis (imunohistocheminis) piktybinių ir atitinkamas nepiktybinių audinių 127 pacientų, apimantis šešias skirtingas pirminio naviko svetainių, ty stemplės, skrandžio, kepenų, kasos, gaubtinės žarnos ir tiesiosios žarnos. Klinikos-patologinė reikšmė LGR5 išraiška buvo tirtas 100 pacientams, sergantiems skrandžio karcinoma (GC). Ne neoplazminė audinių dažniausiai gyvendavo tik labai mažai išsibarsčiusios LGR5 ^{+ ląsteles. Atitinkami karcinomos stemplės, skrandžio, kepenų, kasos, gaubtinės ir tiesiosios žarnos parodė žymiai daugiau LGR5 + ląstelių, taip pat gerokai didesnis iš LGR5-mRNR lygį palyginti su atitinkamu ne neoplastiniu audinio. Dviviečiai dažymo eksperimentai atskleidė LGR5 coexpression su tariamų kamieninių ląstelių žymenų CD44, Musashi-1 ir ADAM17. Kitas mes patikrinome hipotezę, kad eilės pokyčiai skrandžio kancerogenezėje, t.y. lėtinio atrofinį gastritu, žarnyno metaplazijos ir invazinės karcinomos, susietus su tos LGR5 + ląstelių perskirstymo. Įdomu tai, kad teritorinis pasiskirstymas LGR5 pasikeitė: ne neoplastiniu skrandžio gleivinę, LGR5 + ląstelių buvo rasta daugiausia gleivinės kaklo srityje; žarnyne metaplazijos LGR5 + ląstelės buvo lokalizuota kriptų bazę, o GC LGR5 + ląstelių buvo dalyvauti luminal paviršiaus, naviko centro ir invazijos priekyje. Iš LGR5 išraiška navikas centro ir invazijos priešais GC reikšmingai koreliavo su vietos naviko augimą (T kategorijos) ir mazgų sklaidos (N-kategorijos). Be to, pacientams, sergantiems LGR5 + GCS turėjo trumpesnį išgyvenamumo mediana (28,0 ± 8,6 mėnesių), nei pacientams, sergantiems LGR5 - GCS (54,5 ± 6,3 mėnesių). Mūsų rezultatai rodo, kad LGR5 yra skirtingai išreikštas virškinimo trakto vėžio ir kad erdvinis histoanatomical platinimas LGR5 + ląstelių turi būti laikoma, kai yra ieškoma jų navikas biologinė reikšmė}

nurodomoji dalis:. Simonas E Petke D Böger "C" Behrens HM Warneke V Ebert, M, et al., (2012) geografinį pasiskirstymą LGR5 ^{+ ląstelių koreliuoja su skrandžio vėžio progresavimą. PLoS vieną iš 7 (4): e35486. Doi: 10,1371 /journal.pone.0035486}

redaktorius: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences Inc, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lie 5, 2011 m Priėmė: Kovo 16, 2012 m Paskelbta: Balandžio 18, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Simonas et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šie autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų.. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Virškinimo karcinomos yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir yra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1], [2]. Už prastos prognozės priežastys yra sudėtingos: daugelis vėžio ir virškinamojo trakto diagnozuojama stadijose išskyrus gydomųjų priemonių, nėra patikimų naviko žymenys, kurie gali leisti ankstyvą diagnozę ar perrinkimas didelės rizikos gyventojų. Gydymo galimybės yra ribotos lokaliai išplitusiu ir metastazavusio ir nemažai navikų kartojasi nepaisant pradinio terapinį atsaką [3]. Tariamą paaiškinimas neveiksminga terapija yra vėžio kamieninių ląstelių (CSC) buvimas. CSC hipotezė postulatai, kad navikas yra įvairiarūšių ląstelių populiacijų konglomeratas. Tik šio konglomerato subpopuliacija palaiko kolonijas formavimo galimybes, taigi ir pasikartojimo ir metastazavusiu plitimą. CSCS yra labiau atspari chemoterapijai, todėl naviko atsinaujinimo, progresavimo ir galiausiai paciento mirties [4], [5]. Nors "CSC modelis yra vis labiau priimtinas, identifikavimas ir patvirtinimas vadinamųjų kamieninių ląstelių žymenų gimtąja žmogaus audinių yra sunku ir labai trūksta. Neseniai, leucinas-turtinga, G-baltymu sujungtas receptorius (GPCR) ir WNT tikslinio geno LGR5
buvo nustatyta kaip naują kamieninių ląstelių persekiotoją plonosios žarnos, storosios žarnos ir plaukų folikulų pelių [6] , Išraiška LGR5 keliomis kitų organų rodo, kad ji gali atstovauti pasaulinio žymeklį suaugusių kamieninių ląstelių. Tačiau mažai žinoma apie jo išraiškos kepenų ir virškinimo trakto žmonėms.

Šiame tyrime siekėme užpildyti šią informacijos spragą ir išbandyti hipotezę, kad vėžys kamieninių ląstelių žymeklis LGR5 turi prognostinė ir naviko biologinio reikšmė.

medžiagos ir metodai

Dalykai

formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų piktybiniai ir atitinkantis ne piktybinis audinį nuo 127 pacientų šeši anatomines vietas kepenų ir virškinimo trakto takų (ty stemplės, skrandžio, kepenų, kasos, gaubtinės ir tiesiosios žarnos), buvo paimti iš patologijos krikščionių-Albrechts-universiteto Kylio institutų ir Charite universiteto ligoninės Berlyno (abu Vokietija) archyvuose. Visi pacientai buvo operuoti abiejuose universiteto ligoninės Šlėzvigo-Holšteino (1997-2009) arba Charite universiteto ligoninės Berlyne (1995-2008; 1 lentelę). Nepritvirtintas, švieži sušaldyti audinių buvo prieinama iš 105 šių pacientų su aštuonių skirtingų rūšių navikais, ty Bareto adenokarcinoma (9 pacientai) ir suragėjusių ląstelių karcinoma (7) stemplės, žarnyno (19) ir pasklidųjų taršos (21) tipo skrandžio vėžys, adenokarcinoma gaubtinės žarnos (19) ir tiesiosios žarnos (20), kepenų ląstelių karcinoma (HCC; 4), ir, cholangiokarcinomos (CC; 6). Pacientas charakteristikos yra apibendrinti 1 lentelėje

nepriklausoma serija 487 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo paimti iš patologijos krikščionių-Albrechts-universitetas (2 lentelėje ir lentelės 3) instituto archyve. Šie pacientai buvo atlikta arba visiškas arba dalinis pašalintas skrandis už adenokarcinomos skrandžio ar oesophago-skrandžio sankirtoje. Kiekvienas rezekcija pavyzdys buvo atlikta histologiniai patikrintų kvalifikuotas chirurginių patologai. Iš paciento mirties metu buvo gauta iš Epidemiologiniai vėžio registras
valstybės Schleswig-Holstein, Vokietija. Tolesni duomenys pacientų vis dar gyvas buvo paimti iš ligoninių įrašų ir Susisiekus su bendrosios praktikos.

Etika pareiškimas

Visi audinio mėginiai buvo imami kaip atliekamas po diagnostinės ar terapinės operacijos pacientas davė raštišką sutikimą. Pacientai, siūlančių mėginius tyrime buvo pseudoniminius ir anonimiškai analizuojami, todėl jokių atskirų susiję duomenys yra įtraukti į duomenų bazę. Tyrimas patvirtino vietos etikos komiteto universitetinės ligoninės Kylyje, Vokietijoje (numeris teisėjas. D 453/10).

Realaus laiko atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija

Viso RNR buvo izoliuotas nuo išaugintų ląstelių ir audinių cryoconserved naudojant Ambion anketa mirVana Mirna išskyrimas Kit (taikoma BIOSYSTEMS, Darmstadt, Vokietija), po kurio dezoksiribonukleazės gydymo turbo DNR nemokamai Kit (Ambion). RNR kokybė buvo vertinama 1,5% agarozės gelyje. Sintezei, 2 mikrogramų visos RNR buvo atvirkštinis transponuoti naudojant Transcriptor First Strand sintezei rinkinį (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija). Genų specifinius pradmenis buvo sintetinamas Biomers.net (Ulmas, Vokietija) (lentelė S1). Realaus laiko atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (Realaus laiko PGR) buvo atliekamas naudojant LightCyler® 480 zondai Master (Roche) ir LightCycler® 480 sistema (Roche). Lyginamieji Ct reikšmės buvo normalizuotas, kad iš trijų namų ruošą genų: homo sapiens sukcinato dehidrogenazės sudėtinga, subvieneto A flavoprotein (BP) (SDHA), homo sapiens kalpainas 2 (CAPN2) parsisiųsti ir ciklofilino C ( CYCC)
. Nėra šablono valdikliai (ne kDNR pagal PGR) buvo skaičiuojamas kiekvienam geno aptikti nekonkrečios arba genomo sustiprinimą ir gruntą dimerizaciją. Visi eksperimentai buvo atliekami dublikatų.

karta ir valymas Anti-LGR5 antikūnų

Polikloninis imuniniai serumai buvo sukurtas prieš karboksi-terminalas uodegos žmogaus LGR5 receptorius. Triušiai buvo paskiepyti su trimis skirtingais peptidais nuo SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (vadinamas Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (vadinamas 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (vadinamas 12) tapatybė, Pineda-abservice (Berlynas, Vokietija). Monospecifiniais IgG buvo gryninamas greitai baltymų skysčių chromatografijos su ÄKTAprime ™ sistemos (GE Healthcare, Uppsala, Švedija), naudojant baltymų A-kolonėlė (GE Healthcare "). Dėl visų vėlesnių analizių, t.y. imunofluorescenciniam, imunocitocheminiais, Vakarų dėmė ir imunohistocheminiu, ir monospecifiniai IgG frakcija giminingumas išvalytas nuo imunitetui peptidų Iki Pineda-abservice. Dot dėmė analizuoja ir imunohistocheminius tyrimai, ir monospecifiniai IgG anti-LGR5-11b antikūnų rodomas didelis afinitetas kartu su stipria ir konkretaus imunodažymu. Todėl, tai antikūnas buvo naudojami visoje šiame tyrime. Reaktyvumo ir specifiškumas monospecifiniais antikūnų buvo būdinga Vakarų dėmė; imunofluorescencinio ir imunocitocheminiam tyrimai.

plazmidžių statyti

išraiška statyti už LGR5 buvo sukurtas stiprintuvo visą koduojančią seką žmogaus LGR5 pervežimas (NM_003667.2) PGR (S1 lentelė ). Kad būtų lengviau subklonavimas dauginamą fragmentas į ekspresijos vektorius pcDNA3.1 (-), pirmyn gruntas buvo numatyta NheI apribojimas svetainės adapterį ir atvirkštinis gruntas buvo numatyta BamHI svetainę ir C-Myc žymę patikrinti sėkmingą transfekcijq. PGR fragmentai ir pcDNA3.1 (-) ekspresijos vektorius buvo suardomas atskirai NheI ir BamHI prieš perrišimas su T4-Ligase (Roche). Plazmidės buvo patikrintas virškinimui su NheI ir BamHI ir DNR sekos naudojant ABI PRISM BigDye Terminatorius ciklas Sekos Ready Reakcijai rinkiniai, Versija 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Vokietija).

Mobilusis kultūra ir transfekcija

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija MKN74 buvo gauta iš Japonijos sveikatos mokslų tyrimų išteklių banko (Osaka, Japonija) ir MKN45 iš Vokietijos kolekcija mikroorganizmų ir ląstelių kultūrų (Braunšveigas, Vokietija). HEK293 EBNA ląstelės buvo įsigyta Invitrogen (Carlsbad, CA, JAV). Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 Vidutinis (MKN74, MKN45) arba Dulbecco modifikuota Eagle terpė (HEK293) papildytas 10% (MKN74, HEK293) arba 20% (MKN45) vaisiaus galvijų serumo, 100 V /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino (PAA laboratorijos GmbH Pašingas, Austrija). DNR transfekavimas HEK293 EBNA, MKN74 ir MKN45 ląstelių buvo padaryta naudojant Lipofectamine LTX reagento (Invitrogen) pagal gamintojo nurodymus. Trumpai, ląstelės buvo auginamos šešių duobučių lėkštelėse. Stabilus transfekavimas MKN74 ir MKN45 ekspresijos plazmidės buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [7]. Trumpalaikiam transfekciją HEK293 ląstelių 1 mikrogramų plazmidės DNR ir 5 mikrol Lipofectamine LTX reagentas buvo skiedžiamas 500 iL Dulbecco modifikuota Eagle terpė be kraujo serume atitinkamai. Po inkubacijos 30 minučių kambario temperatūroje, mišinys buvo įtraukta į HEK293 ląstelėse. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, Transfekuoti ląstelės buvo nukirsta ir RNR arba baltymai buvo izoliuota. Ląstelės Transfekuoti su vektoriumi pcDNA3.1 (-) vienas ir untransfected ląstelės tarnavo kaip neigiamos kontrolės

Imunofluorescentinis

Dvidešimt keturias valandas po sėjos nuo CultureSlides (BD biomokslų, Erembodegem, Belgija),. ląstelės buvo išplauti su fosfato-buferio druskų tirpalo, nustatyta iš 7:3 acetone:methanol (20 minučių, -20 ° C), o vėliau laidžiomis su 0,1% Triton-X (5 minutes, esant kambario temperatūrai). tada Skaidrės buvo inkubuojami su C-Myc pelės monokloninis antikūnas (Klontex, Mountain View, CA, JAV) per naktį 5 ° C temperatūroje, drėgnas kameroje, po to anti-pelės Alexa Fluor 555 konjuguotos antrinio antikūno (Invitrogen). Aptikti sėkmingą transfekavimas LGR5, ląstelės buvo inkubuojamos su anti-LGR5-antikūno, po to anti-triušio antrinio antikūno konjuguota su Alexa Fluor 488 (Invitrogen), kurių kiekvienas vieną valandą kambario temperatūroje. Nepateikimas pirminių antikūnų LGR5 perkeltų HEK293 EBNA ląstelės tarnavo kaip neigiama kontrolė. Montavimas ir counterstaining buvo padaryta su VECTASHIELD Hard rinkinys įskaitant DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, JAV).

imunocitocheminiais

imunocitocheminiam dažymo buvo atliktas formalinu fiksuoto, paraffin- integruotas MKN45 skrandžio vėžio ląsteles. Šiam tikslui, MKN45 ląstelės buvo įdėta į mažų agarozės karoliukų, kaip aprašyta anksčiau [8]. , Toliau perdirbami ir imunodažymu su anti-LGR5-antikūno (skiedimo 1:1000) buvo atliktas pagal imunohistoche analizuoja žmogaus audinių pjūvių (žr žemiau). Praleidimas pirminio antikūno dėl LGR5 transfekuota MKN45 ląstelės tarnavo kaip neigiama kontrolė, o anti-LGR5-antikūnų dažymo specifiškumas buvo patvirtinta, inkubuojant antikūną su immunisieren blokuoja peptidą.

imunoblotingu

Baltymų lizatai gautas inkubacijai žmogaus skrandžio audinių ir kultūringas skrandžio ląsteles ProteoJET ™ žinduolių ląstelių lizės reagentas (Fermentas, St. Leon-Rot, Vokietija) ir proteazės inhibitorius kokteilis (Visas EDTA be Roche). Baltymų mėginiai buvo denatūruotą į Laeminli buferiniu tirpalu (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% natrio dodecil-sulfatas, 10% glicerolis, 5% β-merkaptoetanolio ir 0,01% bromfenolio mėlyna) kaitinant 95 ° C temperatūroje dešimt minučių ir vėliau buvo pakrauta nuo 4% iki 16,5% SDS poliakrilamido geliai ir regimos dažant Coomassie mėlyna. Po atskyrimo, baltymai on Grynas poliakrilamido geliai buvo perkeltas į nitroceliuliozinio membranos (Amersham, Freiburg, Vokietija), immunoblotted su anti-LGR5-antikūnų (skiedimo 1:20,000) ir anti-beta-aktino-antikūnų (1:10,000; klonuoti AC-15, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV) siekiant užtikrinti vienodas pakrovimo sumas. Membrana privalo HRP paženklinti antriniai antikūnai (DakoCytomation, Glostrup, Danija) buvo aptikta glaudesnio cheminės liuminescencijos naudojant ECL sistemą (Amersham). Praleidimas pirminio antikūno tarnavo kaip neigiama kontrolė, o anti-LGR5-antikūnų dažymo specifiškumas buvo patvirtinta, inkubuojant antikūną su immunisieren blokuoja peptidą.

Histologija

histologinis analizuoja, audinių mėginiai buvo fiksuoti 10% neutralizuotas formalinu ir įdėta į parafiną. Deparaffinized skyriai buvo dažomi hematoksilinu ir eozino (H & E). Skrandžio vėžys buvo klasifikuojami pagal klasifikacijos PSO [9]. PTNM etapas buvo nustatytas pagal 7 ^{-asis leidimas Tarptautinės Sąjungos kovos su vėžiu [10].}

Audinių mikro masyvo statyba

formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų audinio mėginiai buvo naudojamas generuoti audinių mikro matricas, kaip aprašyta anksčiau [11]. Keturi mikrometrą skyriai gauto naviko audinio mikro masyvo blokas buvo sumažinti tolesnei analizei. Sėkmingas perdavimas naviko audinyje buvo patvirtinta mikroskopiškai naudojant H &. El tamsintas

imunohistocheminis

skyriai imunohistocheminiu, buvo naudojami formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų skyriai. Imunodažymu buvo atliktas su anti-LGR5-antikūnų (skiedimo 1:1000), yra monokloninis antikūnas, nukreiptas prieš CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd., Niukaslio, GB) ir komercinės polikloniniai antikūnai nukreipti prieš LGR5 (LGR5 ^{lt , 1:400; Abcam, Inc, Cambridge, MA, JAV), ADAM17 (skiedimo 01:50; Sigma-Aldrich) ir Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc, Temecula, Kalifornija, JAV). Taip 20 minučių blokavimo su vandenilio peroksidas blokas (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV), 5 minučių gydymo Ultra V blokas (Thermo Scientific) ir inkubacijos su pirminio antikūno buvo padaryta drėgna kameroje kambario temperatūroje 30 minučių. Skaidrės buvo plaunami tarp etapų su tri-buferio druskų tirpalu (TBS). Immunoreactions buvo ryškinamos su n-Histofine Paprasta Stain MAX PO sistemos (Nichirei biologijos mokslų, Tokijas, Japonija) ir DAB substrato (LINARIS, Wertheim-Betingenas, Vokietija). Dvigubo dažymo LGR5 su CD44, ADAM17 ir Musashi-1, laisvieji privalomi svetainėse buvo blokuotos pelės IgG ir triušio IgG kontrolė (Abcam) atskiesti antikūnų skiedikliu (ZYTOMED Systems, Berlynas, Vokietija), po DAB-gydymo. Egzemplioriai buvo counterstained hematoksilinu. Neveikimas pirminio antikūno tarnavo kaip neigiamos kontrolės. Ne neoplazminė žmogaus skrandis (CD44) ir smegenų audinio (LGR5 com LGR5 ir Musashi-1) tarnavo kaip teigiamą kontrolę.}

vertinimas imunodažymu

imunodažymu ne neoplastiniu epitelio ir naviko ląstelės buvo įmušė taikant reaktyvumas vertinimo sistemą (IRS). Trumpai tariant, A kategorijos dokumentais apie imunodažymu intensyvumą kaip 0 (imunodažymu), 1 (silpnai), 2 (vidutinio) ir 3 (stiprus). B kategorija dokumentais apie imunoreaktyviųjų ląstelių procentą kaip 0 (neigiamas), 1 (išsibarsčiusios teigiamų ląstelių; ≤1%), 2 (2-10% teigiamų ląstelių), 3 (11-50%), 4 (51-80%) ir 5 (> 80%). A ir B kategorijos papildomas lėmė IRS nuo 0 iki 8 kiekvienu atskiru atveju. Distribucijos pokyčiai LGR5 ^{+ ląstelių iš 100 visas kalnas skyriuose žarnyno tipo skrandžio vėžio pelnytas taip: iš imunoreaktyviųjų ląstelių skaičius buvo priskiriamos 0 (neigiamas), 1 (< 10 teigiamų ląstelių), 2 (10 -50 teigiamų ląstelių) ir 3 (> 50 teigiamų ląstelių) atskirai ertmės paviršiaus, naviko centro ir invazijos prieš}

statistines analizes

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant PASW Statistika 18. statistiniu paketu (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). Palyginimai tarp grupių buvo išbandytas naudojant Fisher'io testą. Koreliacija LGR5 išraiška per vienerius grupei buvo įkurta Kendall anketa Tau rangas eilės koreliacijos. Išgyvenimo kreivės buvo sumontuotas Kaplan-Meier metodu ir skirtumų išlikimas įvertino žurnalo rangas testą. Iš Koreliacija LGR5 raiškos pirminių navikų ir atitinkamu nepiktybinis audinio reikšmė buvo įvertintas pagal Wilcoxon testą. Realaus laiko PGR duomenys, kurie buvo vertinami, suporuotas dvipusio t-testą, gavo logarithmized gauti maždaug paprastai platinami duomenis. P-vertės. ≪ 0,05, buvo laikomi statistiškai reikšmingas

Rezultatai

LGR5-iRNR yra skirtingai išreikšta kepenų ir virškinimo trakto karcinoma

LGR5 buvo pranešta, išreikštų pelių kamieninių ląstelių žarnyno kriptos [12] ir dažnai buvo ekspresija į gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų [13]. Ištirti išreikštas ne neoplastiniu ir neoplastiniu žmogaus audinių, mes įvertino transkripcijos išraišką LGR5 žmogaus klinikinių mėginių, sudarytą iš įvairių Kepenų ir virškinimo karcinoma. Realaus laiko AT-PGR analizė buvo atlikta nuo 105 pacientams, apimantis piktybinis ir atitinkamą ne piktybinis audinį, gauta iš tų pačių pacientų, iš aštuonių skirtingų auglių tipų ir žiurkių serijos: stemplės [Barrett'o adenokarcinomos (9 pacientai) ir suragėjusių ląstelių karcinomos ( 7)], skrandžio [žarnyno (19) ir difuzinis tipas (21) skrandžio karcinomos], kepenų [HCC (4), KC (6)], gaubtinės žarnos (19) ir tiesiosios žarnos (20; 1 lentelė)
<. p> LGR5-mRNR buvo žymiai skirtingai išreikštas adenokarcinomų stemplės (p = 0,007), skrandžio [žarnyno tipo (p = 0,006) ir difuzinio tipo (p = 0,013)], kepenų [KC (p = 0,022)], gaubtinės žarnos (p < 0,001), taip pat tiesiosios žarnos (p = 0,002), lyginant su suderintos ne-neoplastinės audinio. Tačiau nė skirtumas išraiška buvo rasta plokščiųjų ląstelių karcinoma stemplę (p = 0,503) ir HCC palyginti su atitinkamu ne navikinių audinių (p = 0,545; 1 pav.)

polikloniniu kovos su LGR5- antikūno aptinka žmogaus LGR5 transfekuotos į HEK293 ir MKN45 ląstelių

Jei toliau tirti histoanatomical paskirstymą LGR5 žmogaus audinių ir ištirti savo CLINICO-patologinės reikšmės, LGR5 specifinius antikūnus buvo iškeltas, nes komercine antikūnai padarė neatitinka mūsų reikalavimų (2a pav.) Norėdami pašalinti kryžminio reaktyvumo naujai susidariusių antikūnų su labiausiai panašios struktūros LGRs, LGR4 ir LGR6, mes atliekame sekos derinimą su Nacionalinės centro biotechnologijos informacijos
lygiavimo priemonė iš anksto (duomenys neparodyti). Ne Homologija buvo nustatyta, su LGR4 arba LGR6 atsižvelgiant į LGR5 peptido mes naudojami imunizacijos regione. Dėl labai specifinių antikūnų prieš LGR5 atrankos klonuoti visą ilgį kDNR buvo pernešta į HEK293 EBNA ląsteles ir naudojamas kaip teigiama tikslinės scenos imr.rnofluorescencija. LGR5 kDNR buvo tiesiogiai pažymėti tam tikra myc-epitopo, ir tai leidžia sukurti transfekcija įvertinimą su anti-myc žyma antikūno. Naudojant IMUNOFLUORESCENCIJOS, privalomas anti-myc žyma antikūnų buvo nustatyta po inkubacijos su LGR5 /HEK293 ląstelių, bet ne tušti užkrato perkeltų ląstelių (vektorius /HEK293), untransfected HEK293 ląstelių arba neigiamos kontrolės LGR5 /HEK293 ląstelių inkubuojami su antikūnų skiedikliu, o ne pirminio antikūno. Tas pats rezultatas buvo gautas, kai mes naudojamas anti-LGR5-antikūnų (3 paveikslas), o tai rodo specifinį ženklinimą LGR5.

iš LGR5-immunolabelling specifiškumas buvo toliau patvirtintas naudojant formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų MKN45 skrandžio vėžio ląstelės. Ląstelės buvo paruošti ir nudažomi tokiu būdu, kad Parallels klinikinių žmogaus audinių pavyzdžių apdorojimą. Imunocitocheminiam analizę parafino skyriai atskleidė teigiamą dažymo anti-LGR5-antikūnų nuo MKN45 ląstelių stabiliai transfektuotose LGR5 kDNR (LGR5 /MKN45). Vietoj to, tuščios vektoriaus-transfekuota MKN45 ląstelės (vektorius /MKN45), taip pat Neigiama kontrolė (praleidimas pirminio antikūno) ir peptidas kontrolė (iš anksto inkubacinis antikūno su savo immunisieren blokavimo peptido) iš LGR5 /MKN45 ląstelių parodė, ne antikūno (S1 pav.) privalomas

LGR5 baltymas yra specialiai aptikti anti-LGR5-antikūnų žmogaus perkeltų MKN74 ląstelių

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN74, žinoma posses vidutinio LGR5-iRNR raiška (duomenys neparodyti) ir žmogaus ne neoplazminė skrandžio, eksponuojamos labai mažai LGR5 išraiška (1 paveikslas) buvo pasirinktas apibūdinti reaktyvumą ir specifiškumą anti-LGR5-antikūno baltymų lygį.

į Vakarų dėmė analizė, LGR5 baltymas buvo pripažintas specialiai pagal monospecifiniais anti-LGR5-antikūno esant 1:20,000 praskiedimo. Ji nustatė vieną grupę su tariamasis molekulinė masė 100 kDa į MKN74 ląstelių fragmentai (4 paveikslas), kuri atitinka molekulinę masę, apskaičiuotą LGR5 baltymų. Priešingai, ne juosta buvo aptiktas lizatuose žmogaus ne neoplastiniu skrandžio audinio, kuris draudžia kryžminio reaktyvumo anti-LGR5-antikūno su korinio baltymų. Laikantis iRNR raiškos duomenimis, stipresnis išraiška LGR5 baltymų buvo pastebėtas MKN74 ląstelių stabiliai transfektuotose LGR5 kDNR, palyginti su MKN74 kontrolinių ląstelių perkeltų su tuščiu vektorių. LGR5 baltymų ekspresija žmogaus ne neoplastiniu skrandžio gleivinės buvo už aptikimo ribą Imunoblotingo, rodyti jokios grupės. Nepateikimas anti-LGR5-antikūno arba ankstesnio inkubacijos antikūno su imunitetui blokuoja peptidas Rodo jokių baltymų juostas, atitinkamai. Aptikta beta-aktino baltymų (apie 43 kDa, 4 pav) tarnavo kaip pakrovimo kontrolę ir patvirtino tolygiai pakrauta baltymų kiekius visų juostų

LGR5 išreiškiamas ne neoplastiniu ir neoplastiniu audinio kepenų ir virškinimo trakto. takų

išraiška ir histoanatomical platinimas LGR5 vėliau buvo tiriamas imunohistocheminiu į 127 audinių skaidres serijos, gauta iš, atitinkantis ne neoplastinį ir neoplastinį audinių kepenų ir virškinimo trakto, apimanti stemplę (14 pacientų) skrandžio (32), kepenų (24), kasos dalis (17), storosios žarnos (20), ir tiesiosios žarnos (20; 1 lentelė). Iš šio kohortos vėžinės atitinkančių ne navikinių audinių mėginių 105 pacientų taip pat buvo tiriamas transkripcijos lygyje (žiūrėti aukščiau).

LGR5 išraiška bendro kohortos buvo teigiamas 65 atvejų (51%) visų nepiktybinių audiniai ir 103 bylos (81%) visų vėžio audiniuose. Lokalizacija LGR5 išraiška buvo pastebėta, kaip daugiausia citoplazminis, o taip pat yra atsitiktinis membrana arba branduolys membrana paryškina išraiška įvyko. LGR5-reaktyvumas buvo rasti visų audinių komponentais, t.y. stromos ląstelių, endotelio ląstelių, ląstelių ne neoplastiniu epitelio ir vėžinių ląstelių (5 paveikslas). LGR5-reaktyvumas į stromos ląstelių buvo pastebėtas 49 (39%) visų nepiktybinių audinių ir 80 atvejų (63%) visų vėžio audiniuose. Endotelio reaktyvumas iš LGR5 buvo stebimas 42 atvejų (33%) visų audinių.

nepiktybinis epitelio, LGR5 buvo paprastai rasti keletą išsibarsčiusios ląstelių artimų pamatinės membranos skrandžio gleivinės vieneto, kasos latakus, ir kolorektalinio kriptos. LGR5 nebuvo rasti suragėjusių epitelio stemplės, tulžies latakų, ir hepatocitų (6 pav). Dėl visų audinių tipų bet ne iš stemplės audinių vidutinė vertė IRS buvo žymiai didesnis navikų audiniuose, palyginti su suderintos nepiktybinis audinio, patvirtindamas mūsų išvados dėl transkripcijos lygio (1 lentelė).

LGR5 būna išsibarsčiusios ląstelių normaliam skrandžio gleivinės

iš multipotent kamieninių ląstelių viduje pelių skrandžio egzistavimas buvo įrodytas kloninių ženklinimo studijas. Galutinis nustatymas šių ląstelių nepavyko iki šiol dėl konkrečių endogeninių žymenų [14] nebuvimu. Naudojant serijos skyrius gautus iš rankovės rezekcijos pavyzdį, kuris paprastai gautų už antsvorį gydymo ir neparodė histologiniai įrodymų skrandžio vėžio ar lėtiniu gastritu, mes ieškoma LGR5 ^{+ epitelio ląstelių. Įdomu tai, kad išsibarstę LGR5 + ląstelių buvo rasta gleivinės kaklo srityje tarp foveolae ir liaukų (7 pav.)}

LGR5 yra persipynusių su kitais potencialiais skrandžio kamieninių ląstelių arba kamieninių ląstelių žymenų

kamieninių ląstelių ne-neoplastinės audinių ir CSCS yra paprastai identifikuoti ir patvirtinti pagal daugiau nei vieną kamieninių ląstelių persekiotoją [15] išraiška. Naudojant imunohistocheminis, kitą kartą analizavo LGR5 coexpression su kitais tariamų CSC žymekliai, t.y. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 buvo pasirinktas, nes ankstesni tyrimai nustatė ADAM17 kaip spėjamą kamieninių ląstelių persekiotoją skrandžio [8]. Imunodažymu (arba dvigubo dažymo ar dažymo serijos skyrius) buvo atliktas skrandžio vėžio pavyzdį ir sveikos uninflammed skrandžio gleivinės gauto rankovių pašalintas skrandis. Apskritai yra tik keletas išsibarsčiusios ląstelės parodė teigiamą imunodažymu už vieną ir /arba kitos spėjamame kamieninių ląstelių žymeklį. Įdomu tai, kad ne neoplazminė skrandžio gleivinė uostų sekcijas, kurios kiekvienas ADAM17 ^{+ /LGR5 + "(atstovaujanti maždaug trečdalį visų imunoreaktyviųjų ląstelių) ir ADAM17 + /LGR5 - (du trečdaliai) ir ADAM17 - /LGR5 + (kelios išsibarsčiusios ląstelės; pav 2C-E)}

Musashi-1 (MSH-1) buvo aprašyti kaip spėjamą kamieninių ląstelių žymeklio pelės žarnyne. ir žmogaus skrandžio [18], [22] ir kaip CSC persekiotoją navikuose [23]. Be navikinių ir ne navikinių skrandžio audinių teigiamų tamsintas ląstelių, daugiausia sudarytų iš MSH-1 ^{+ /LGR5 - (maždaug du trečdaliai visų imunoreaktyviųjų ląstelių), kiek mažiau iš MSH-1 + /LGR5 + (vienas trečdalis), ir tik nedaugelis MSH-1 - /LGR5 + ląstelių (pav 2F-H). Pagaliau paviršius žymuo gaubtinės ir tiesiosios žarnos ir skrandžio vėžio kamieninių ląstelių CD44 [21], [24] parodė, kad paskirstymą panašią su MSH-1 (pav 2I, J). Apibendrinant, šios išvados patvirtina hipotezę, kad mūsų kovos su LGR5-antikūno aptinka ląsteles kamieninių ląstelių ekspresijos modelių žmogaus skrandžio gleivinę.}

geografinį pasiskirstymą LGR5 + ląstelių pokyčiai tumorogenezės metu

nuoseklius pokyčius skrandžio gleivinės, kad prieš invazinės vėžio vystymąsi yra žinomas kaip "ikivėžinių kaskados", pirmasis aprašė 1975 m, kur normalus skrandžio gleivinė transformuojama lėtinio atrofinį gastritas ir plėtoja daugiažidininės atrofijos ir žarninės Metaplasia, po apie displazija ir pagaliau invazinės karcinomos [25] išvaizdą. Kitas mes patikrinome hipotezę, kad minėti histopatologiniai pokyčiai skrandžio gleivinės yra susietas su į LGR5 ^{+ tariamų kamieninių ląstelių perskirstymo. Mes sistemingai tyrinėjo histoanatomical paskirstymą LGR5 + ląstelių iš 100 pacientų, sergančių žarnyno tipo skrandžio vėžio. Visas kalnas audinio dalys buvo naudojamos talpyklos, kurios uždara ne neoplastinį, metaplastic ir neoplastinį vėžio audinio. Tai buvo aiškiai matyti, kad histoanatomical platinimas LGR5 + ląstelių pasikeitė (žr 7 paveikslą): ne neoplazminė ir ne metaplastic skrandžio gleivinę, keletą išsibarsčiusios LGR5 + ląstelių buvo rasta gleivinės kaklo srityje (Pav 7A, E). Žarnyno metaplazijos, šiek tiek padidėjo skaičius LGR5 + ląstelių buvo lokalizuota ties metaplastic kriptos (pav 7B, F) apačioje. Tačiau žarnyno tipo skrandžio vėžio lokalizacija ir kiekis LGR5 + ląstelių buvo stulbinamai pasikeitė. Skrandžio vėžio, LGR5 + ląstelės buvo dalyvauti luminal paviršiaus (pav 7C, G), į naviko centro (tarp luminal paviršiaus ir invazijos priekyje) ir tuo invazijos priešais (7d pav). Įdomiausia, kad LGR5 + skrandžio vėžio ląstelių pasiskirstymas parodė išskirtinius modelius: The LGR5 + ląstelių įvyko darnią pleistrai iš nevienodo skaičiaus naviko ląstelių nuo < 10, 10-50 ir net > 50 vėžinių ląstelių, dažnai formuojant nuolydžius mažėjančio dažymo intensyvumas. Bendras paskirstymas šių LGR5 + vėžinių ląstelių lopai buvo netolygus ir Inhomogeneous. Apibendrinant, mes stebėjo numerį ir intensyvumo LGR5 + ląstelių iš ne neoplastiniu epitelyje skrandžio vėžiu paremti mūsų realaus laiko PGR ir imunohistocheminis duomenis atitiko (ne neoplazminė palyginti neoplazminė) pacientų atvejais padidėjimas (žr 1 lentelė). Mūsų išvados pakitusiu paskirstymo modelio LGR5 + ląstelių yra suderinamas su aprašyta Takeda et al. Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžį [26].}

Iš LGR5 išraiška žarnyno tipo skrandžio vėžio yra susijęs su vietos naviko augimui ir mazgų plitimo

Teigiama, kad "CSC įtaka pacientų prognozei pagal jų sugebėjimą suformuoti auglį Mobilaus ryšio kolonijos, būtina išankstinė metastazuojantys ir ligų pasikartojimo. Siekiant dar labiau ištirti LGR5 reikšmę skrandžio vėžio, mes koreliuoja su LGR5 išraišką žarnyno tipo skrandžio vėžio su įvairiomis Klinikos-patologinis paciento būklę.

• PLoS ONE: sumažėjęs Active SMAD2 koreliuoja su blogos prognozės skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Glyoxalase-I romano prognozė veiksnys, susijęs su skrandžio vėžiu Progression