PLoS ONE: demaskuojant molekulinio mechanizmo skrandžio vėžio Marker aneksino A4 Vėžys ląstelių proliferaciją Naudojant Exon masyvai

Anotacija

Skrandžio vėžys yra piktybinis liga, kuri kyla iš skrandžio epitelį. Potencialus biologinis skrandžio vėžys yra baltymas aneksinas A4 (ANXA4), ląstelėje Ca ^{2 + jutiklis. ANXA4 pirmiausia rasti epitelio ląstelių, ir yra žinoma, kad dalyvauja įvairių biologinių procesų, įskaitant apoptozės, ląstelių dviračių ir antikoaguliantais. Atsižvelgiant į vėžio, ANXA4-raiška buvo pastebėta vėžio įvairios kilmės, įskaitant skrandžio navikų, susijusių su Helicobacter pylori
infekcijos. h. pylori
skatina ANXA4 išraišką ir Intraląstelinė [Ca 2 +] _{i aukštį, ir yra svarbus rizikos veiksnys kancerogenezėje kad susidaro skrandžio vėžio. Nepaisant šios koreliacijos, kad ANXA4 vaidmuo skrandžio navikų progresavimo lieka neaiškus. Šiame tyrime mes tyrė, ar ANXA4 gali tarpininkauti ląstelių augimo greitį ir ar ANXA4 pasroviui signalai dalyvauja Tumorigenesis. Po stebint ląstelių augimą realiu laiku norma, mes nustatėme, kad ANXA4 skatina ląstelių proliferaciją. Transkripcijos genas profilis ANXA4 ekspresija ląstelių buvo matuojamas ir analizuojami žmogaus Exon matricos. Nuo šios transkripcijos genų duomenimis, mes parodome, kad padidėjusią ANXA4 reguliuoja genus, kurie yra žinomi, yra susiję su vėžio, pavyzdžiui, kad hialuronano tarpininkaujant judrumui receptorių (RHAMM), AKT ir cikloniniai priklausomas kinazės 1 (CDK1) aktyvaciją, taip pat apie p21 slopinimas. Šių genų Be to, jis skatina vėžinių ląstelių proliferaciją. Mes taip pat nustatė, Ca 2 + gali reguliuoti tolesniems signalų perdavimą atliko ANXA4. Mes rekomenduojame, kad ANXA4 sukelia signalizacijos kaskados, todėl padidėja epitelio ląstelių proliferaciją, galiausiai skatinti kancerogenezės. Todėl šie rezultatai gali suteikti naujų įžvalgų skrandžio vėžio gydymo, ypač per ANXA4 veiklos pakeitimo}}

nurodomoji dalis:. Lin LL Huang HC Juan HF (2012) Atskleidžiant molekulinio mechanizmo skrandžio vėžio Marker aneksino A4 vėžiu ląstelių proliferaciją naudojimas Exon matricos. PLoS vieną iš 7 (9): e44615. Doi: 10,1371 /journal.pone.0044615

Redaktorius Eric J. Chuang, Taivano nacionalinis universitetas, Taivanis

Įstojo: birželio 6, 2012; Priimtas rugpjūčio 6, 2012 m Paskelbta rugsėjo 7, 2012

Visos teisės saugomos: © Lin et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės mokslo tarybos Taivanas (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), Nacionalinis Taivano universitetas pažangiausiomis stiprintuvas tyrimų projektas (10R70602C3) ir nacionalinio sveikatos tyrimų institutas, Taivanas (NHRIEX100-9819PI). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl mirčių nuo vėžio visame pasaulyje ir rodo didelį paplitimą Azijos gyventojų. Nors skrandžio vėžio atvejų mažėja, bendras 5 metų išgyvenamumas išlieka žemas [1]. Nustatyti efektyviausius skrandžio vėžio gydymo ir plėtoti Jaunesniųjų diagnostikos įrankiai yra svarbūs strategijos įtakos klinikinius rezultatus. Išsamus tyrimas molekulinius mechanizmus, kuriais pagrįsta skrandžio kancerogenezės gali teikti pagalbą kuriant naudingus gydymo strategijas, šios ligos.

Helicobacter pylori
yra skrandžio sukėlėjas yra dominuojantis etiologiniu veiksnys skrandžio kancerogenezėje , Maždaug pusė pasaulio gyventojų yra užsikrėtę H. pylori
, ir daugiau nei 60% skrandžio vėžio pacientai turėtų H istoriją. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Naujausi tyrimai parodė, kad H. pylori
gali sudaryti tiek skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir gleivinės uždegiminių atsakymus [5], [6]. Taigi, siekiant ištirti molekulinius mechanizmus pagrindinės skrandžio Kancerogeninis ir būtina ištirti, kokį vaidmenį ir mechanizmų H. pylori
skrandžio kancerogenezėje.

Annexins yra ubiquitously išreikšta daugumos organizmų, įskaitant gyvūnų, augalų, grybų ir Pirmuonys. Jis yra susijęs su fiziologinių funkcijų [7] įvairovė. Remiantis jų konservatyvią pagrindinę domeno struktūros, annexins laikomi ląstelėje Ca ^{2 + Jutikliai ir Fosfolipiduose privalomas baltymai. Jie buvo pastebėta, kad skatinti prekybą membranos ir pūslelės agregaciją atsižvelgiant į didesnes ląstelėje [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Žmonėms, annexins pastebėtos turėti mobiliojo ryšio funkcijų spektrą, kad buvo numanoma Citoskeletas organizacijos, egzocitozės būdu, Endocitozė, jonų kanalo reguliavimas, uždegimo, apoptozės, fibrinolize ir krešėjimo [8]. Annexins taip pat laikomas dalyvauja vėžys, diabetas ir uždegimas [10]. Pastaruoju metu vis daugiau ir daugiau tyrimų paaiškėjo, kad įpainioti į annexins į kancerogenezėje dalyvavimą, taip pat skatinti platinimu [11], [12], invazija [13], ir metastazės [14], [15]. Tačiau tarp visų annexins šeimos nariams santykiai su vėžiu nebuvo būdinga.}}

aneksinas A4 (ANXA4) yra iš annexins šeimos susijęs su virškinimo sistemos narys. Jis aiškiai išreikštas epitelio ląstelių [16]. Naujausi tyrimai parodė, kad ANXA4 laikomas potencialus skrandžio biologinis remiantis jo nustatymo audiniuose skrandžio vėžio pacientų proteominius studijas. Iki-reguliavimo ANXA4 specialiai rastas H. pylori
-infected navikų audiniuose [17], [18]. Be to, daug tyrimų, pranešė, santykius tarp ANXA4 saviraiškos ir vėžio. Šie santykiai buvo pranešta kasos adenokarcinoma [19] aiškiai ląstelių karcinoma kiaušidžių [20], [21], inkstų karcinoma [22], gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu [23] ir prostatos vėžio [24]. Inkstų ląstelių karcinoma, iki-reguliavimas ANXA4 dalyvauja skleidžiant vėžinių ląstelių, skatinti ląstelių migraciją [22]. Gaubtinės ir tiesiosios žarnų vėžiu sergantiems pacientams, aukštos raiškos ANXA4 buvo susijęs su mažu išgyvenamumas ir buvo pranešta, kaip potencialus biologinis žymuo naviko diagnozę [23]. Tiek, kiek ląstelių funkciją, ANXA4 gali sukelti kalcio signalizacijos, antikoaguliantais ir atsparumą apoptozės [25], [26]. Šie įvykiai rodo, kad ANXA4 turi tumorogeniškas funkcija reguliuojant ląstelių augimo greitį.

Šiame tyrime mes skirti išsiaiškinti molekulinį mechanizmą, pagal kurį ANXA4 skatinantis kancerogenezės. Norėdami atlikti šį, mes stebėjo augimo tempą skrandžio vėžio ląstelių su įvairių raiškos lygių ANXA4. Mes taip pat įvertino transkripcijos išraiška profilį ANXA4-ekspresija ląsteles ir naudojamas Exon masyvus analizuoti pasroviui signalizavimo ANXA4. Iš šių tyrimų, mes nustatyti 9 vėžio susijusių genų ANXA4 tolesniems signalus naudojant Išradingumas Kelias analizė (IPA) duomenų bazę. Be to, mes parodė, kad ANXA4 reguliuoja RHAMM, AKT, CDK1 aktyvavimo ir p21 slopinimas, todėl pasiūlė ANXA4 reguliuojama ląstelių proliferacija kelią.

Rezultatai

Iš ANXA4 aktyvinimas skatina ląstelių proliferaciją

Mes jau anksčiau pranešė, kad ANXA4 ekspresija yra H. pylori
užkrėstų skrandžio naviko audinio [17]. Toliau tirti tarp ANXA4 ir kancerogeninio poveikio santykį, mes siekta nustatyti, ar ANXA4 skatina ląstelių proliferaciją. Ląstelės buvo pernešta su bet pilnametražis ANXA4
kDNR padidinti ANXA4 išraiškos arba konkrečios siRNA ketinama nutildyti ANXA4 išraiška. Po transfekciją, mes stebėjo augimo tempą AGS skrandžio vėžio ląsteles naudojant realaus laiko ląstelių analizė (RTCA) sistemą. Mobilaus ryšio numeriai buvo užregistruoti kaip ląstelių indeksas (PI) vertės. Augimo kreivės AGS ląstelių buvo pakeistos šių transfekcijq. Iš ANXA4 raiška žymiai padidino ląstelių augimą normą AGS ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių ( P
< 0,001; 1A pav), o ANXA4 nokdaunas gerokai sumažėjo augimo tempą ( P
< 0,001; 1B pav.) Šie rezultatai rodo, kad ANXA4 turi potencialą skatinti ląstelių proliferaciją.

ANXA4 Padidina išraiška membranos baltymai, RHAMM ir LAMP2

Mes taip pat išnagrinėjo genų ekspresijos skirtumą tarp ANXA4 ekspresija ląsteles ir kontrolinių ląstelių išreiškiantys tuščią vektorius. Mes išnagrinėjome šį naudojant Exon masyvo analizę, kuri siūlo tikslesnį vaizdą apie genų lygio išraiškos naudojant keturis zondai per egzono, palyginti su įprastais 3 "matricos [27]. S1 paveiksle, X
ašies iš sklaida sklypas Rodo zondo raiškos intensyvumas matuojamas vieną eksperimentą ir Y
ašis parodo zondo raiškos intensyvumo reikšmes, išmatuotas kitoje eksperimente , Šie rezultatai rodo koreliaciją tarp abiejų eksperimentų rezultatais ir todėl rodo nuoseklumą tarp mūsų pasikartojančių mikrogardelių. Geno ekspresijos lygis buvo apskaičiuotos iš stiprumus išmatuotus per zondas rinkinių. Apskritai, buvo nustatyta, kad 1052 genų išraiška žymiai skiriasi ( P
< 0,05). Tarp ANXA4 ekspresija ląstelių ir kontrolinėse duobutėse

ANXA4 yra plazmos membranos baltymų, todėl mes siūlyti, kad kiti plazminės membranos baltymai gali būti reguliuojamas ANXA4 ir dirbti kartu transduce savo pasroviui signalizacijos. Tirti signalizacijos transdukavimo reglamentuoja ANXA4, mes ištirti citoplazmos membrana baltymus nuo Exon masyvo analizę. Keturiasdešimt septynerių plazminės membranos baltymai buvo pastebėta, kad turi ≥ 1,5 kartų kaita ANXA4 ekspresija ląstelių (lentelė S1). Tarp jų, hialuronano tarpininkaujant judrumas receptorių ( HMMR
) parodė Didžiausias padidėjimas išraiškos (2,4 karto; lentelė S1). Be to, mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad ląstelės paviršiaus išraiška lizosominio susijęs membranos baltymų 2 ( LAMP2
), lizosomų žymeklis, yra iki-reguliuojami ANXA4 ir dalyvauja egzocitozės būdu (S2 pav ir failų S1) , Čia transkripcijos išraiška LAMP2
taip pat parodė išraiška padidėjo (1,8 karto; lentelė S1), kai matuojama pagal Exon masyvo analizę. Šiame tyrime ANXA4 buvo ekspresija arba nutildyti (2A pav) ir tada analizuojama munoblotingu patikrinti baltymų ekspresiją RHAMM ir LAMP2. ANXA4 raiška padidėjo RHAMM (2b pav) ir LAMP2 (2c pav) ir, laikantis šio išraišką, iš ANXA4 išraiškos nokdaunas sumažėjo jų lygius išraiškos (2b pav ir 2c).

ANXA4 Padidėjusi Reguliuoja vėžio AMŽIAUS genų ekspresijos

Mes naudojome Išradingumas Kelias analizė (IPA) duomenų bazę, atlikti genų funkcijai analizę Exon masyvo duomenis ir nustatė, kad 25 iš 42 genų buvo gauti tinklo funkcionavimui analizė (≥2 kartus skirtumas išraiška T
testus, P
< 0,05) (1 lentelė). Trys funkciniai tinklai buvo reikšmingai susijęs su ANXA4 reguliuojamų genų. Patys stipriai susijęs tinklas buvo , vėžys, ląstelės ciklo, ir reprodukcinės sistemos liga
( P
< 0,05; 3A pav), o viršuje-užėmė ligų ar sutrikimų buvo Vėžys
( P
< 0,05; 3B pav.) Nebuvo 9 genai klasifikuojami kaip vėžio susijusių genų ANXA4 ekspresija ląstelių, įskaitant 7 genų, kurie buvo iki reguliuojamų mūsų eksperimentams. Šie genai yra eukariotinių vertimas inicijavimas faktoriaus 4E ( EIF4E
) sukcinato dehidrogenazės sudėtinga, subvieneto C neatsiejama membranos baltymo, 15 kDa (, SDHC
), cikloniniai priklausoma kinazės 1 ( CDK1
), išbrauktas limfocitų leukemija 2 ( DLEU2
), chromatino pakeisti baltymų 5 ( CHMP5
), nesenstanti bendrauja baltymų ( TIPIN
), PDZ- privalomas kinazės (, PBK
). Chorioninis somatomammotropin hormonas 1 (placentos lactogen) ( CSH1
) ir interferono alfa 2 ( IFNA2
) buvo žemyn reguliuoja ANXA4. Remiantis mūsų rezultatus, mes siūlome, kad ANXA4 turi funkciją skatinančius ląstelių proliferaciją. Be to, , buvo laikomi CDK1 parsisiųsti ir , PBK
(3B pav ir 1 lentelė) turi būti įtrauktas į ANXA4 platinimo skatinančius modelį. Nuo CDK1 aktyvavimo yra susijęs su ląstelių proliferaciją kuriant skrandžio salyklo limfoma [28]. Abipusis aktyvavimo CDK1 ir PBK buvo pranešta anksčiau [29]. Šiame tyrime, up-reguliavimas CDK1
ir , PBK
pastebėtas ANXA4 ekspresija ląstelių buvo patvirtintas kiekybinio realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (KRL-PGR) analizė (S3 paveikslas) .

ANXA4 reguliuoja AKT, CDK1 aktyvinimas ir p21

CDK1 aktyvavimo, kurią reglamentuoja p21 slopinimas, slopina G2 /M fazių suėmimą, taip skatinant mitozė ir ląstelių proliferaciją [30 ]. Taip pat buvo pranešta, kad AKT blokuoja p21 aktyvavimo, todėl jo kaupimąsi citoplazmą ir todėl skatinti ląstelių proliferaciją [31]. Naudojant Imunoblotingas, mes nustatėme, kad padidėjusią ANXA4 padidino serino 473 fosforilinimo ant AKT ir treonino 161 CDK1 ir sumažino p21 (4a pav) išraiška. Be to, iš ANXA4 išraiškos parbloškimo sumažėjo PHOSPHO-AKT ir fosfo-CDK1 ir padidėjo p21 išraiška (4b paveikslas). Šie duomenys rodo, kad PHOSPHO-AKT, PHOSPHO-CDK1 ir P21 reglamentuoja ANXA4 ir tolesniems signalai ANXA4.

Ca 2 + tarpininkauja ANXA4 Pasroviui Signalizacijos perdavime

kancerogenezėje, ca ^{2 + dalyvauja sukelia perduoti signalo tarpininkauti platų biologinių procesų, įskaitant invazija, platinimo, angiogenezę ir metastazių [32]. Buvo pranešta, kad annexins gali tarpininkauti kai fiziologinius mechanizmus Ca 2 + -dependent būdas [9]. Ankstesniais tyrimais, ląstelėje [Ca 2 +] _{i aukštis buvo sukeltas H. pylori
infekcija, kuri, savo ruožtu, iki-reguliuoja ANXA4 išraišką [17], [33]. Norėdami nustatyti, ar į ląstelėje padidėjimas [Ca 2 +] i tarpininkauja paskesnio signalus iš ANXA4 perdavimo, AGS ląstelės buvo gydomi ionomycin. Ionomycin yra Ca 2 + jonoforai ir buvo įtraukta į kultūros žiniasklaidos mūsų AGS ląstelių modelio sukelti ilgalaikį aukštis intraceliulinės [Ca 2 +] i [34]. Baltymų išraiškos ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT ir fosfo-CDK1 buvo matuojamas Imunoblotingas (5a pav.) Panašus į mūsų pastabas su ANXA4 raiškos, padidėjo [Ca 2 +] i lygiai gerokai iki reguliuojama iš RHAMM išraiška ( P
< 0,01) ir PHOSPHO-AKT (Ser 473) ( P
< 0,05) ir reikšmingai mažina sureguliavo p21 išraišką ( P
< 0,01) (5b pav.) CDK1 aktyvacija šiek tiek padidėjo [Ca 2 +] i aukščio. Tačiau padidėjusi [Ca 2 +] i lygiai neturėjo dėl ANXA4 ir LAMP2 raiškos poveikį. Mūsų ankstesniame tyrime, ANXA4 ir LAMP2 gali lokalizuoti prie plazminės membranos po H. pylori
infekcija ląstelėje [Ca 2 +] i Elevation (S4 pav ir failų S1). Šie rezultatai rodo, kad Ca 2 + tiesiog keičia ląstelėje vietą ANXA4 ir LAMP2, bet ne reguliuoja jų išraiška.}}

Diskusijos

vėžio mokslinių tyrimų, biožymeklių identifikavimas ir vėlesnis paaiškinimas jų mechanistinių santykius su tumorigenesis gali prisidėti prie naudingų diagnostikos įrankius ir sukelti optimalių gydymo strategijas. Pastaruoju metu vis daugiau ir daugiau tyrimų parodė, kad biologinis kandidatės baltymų, annexins šeimos yra potencialiai instrumentinė įvairių vėžio progresavimo; pvz, ANXA1 aiškias ląstelių inkstų vėžio, ANXA2 skrandžio vėžio ir storosios žarnos vėžiu, ANXA4 už gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio, ANXA8 krūties vėžiu, ANXA10 už kepenų vėžio, ANXA11 kiaušidžių vėžio ir storosios žarnos vėžio [35]. ANXA4, priklausantis annexins šeimos narys, buvo pastebėta, kad būti aktyvuojami skrandžio navikų audiniuose, ir taip pat yra susijęs su skrandžio vėžio, susijusių su H. pylori
infekcija [17]. Be to, dar annexins šeimos narys, ANXA2, taip pat buvo pastebėta, kad ekspresija skrandžio vėžio ir yra susijęs su prasta klinikinių rezultatų, todėl potencialus prognostinis faktorius [36]. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad ANXA4 į Tumorigenesis dalyvavimą; Tačiau, jo tikslus mechanizmas procese lieka neaiškus. Siekiant dar labiau įvertinti ląstelių funkciją ANXA4 į skrandžio vėžio progresavimą, mes ištirti ryšį tarp šių dviejų, o vėliau paaiškėjo, kad ANXA4 gali reguliuoti vėžio susijusių genų ir skleisti kelią į ląstelių proliferaciją.

Šis tyrimas, mes nustatėme, kad Kancerogeninis susijusių baltymų, pvz RHAMM, AKT, p21, PBK, ir CDK1 yra reglamentuoja ANXA4 raiškos. Schematiškai pavaizduoti iš ANXA4-sukeltų vartotojų signalų, susijusių su ląstelių proliferacijos yra parodyta 6 pav HMMR
(RHAMM) yra onkogeno, kad yra aktyvuojami kelių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio, ir buvo susijęs daug korinio procesai, pavyzdžiui, ląstelių signalizacijos, ląstelių proliferacija ir tumorigenesis [37], [38].

buvo pranešta, kad RHAMM skatina RAS signalizacijos kaskados ir aktyvina AKT [39]. RAS signalizacijos kaskados transduces pasroviui signalus aktyvuojant fosfo-AKT per phosphoinositide 3-kinazes. Šis AKT aktyvacijos taip pat buvo pranešta, kaip skrandžio vėžio progresavimą [40] persekiotoją. Mes jau anksčiau pranešė, kad H. pylori
infekcija yra susijusi su ANXA4 raiškos [17]. h. pylori
gali pristatyti citotoksinas susijęs genas A (CagA) į šeimininko ląsteles, todėl AKT aktyvavimo, ir taip skatinti ląstelių proliferaciją [41]. Kalbant apie ląstelių išlikimas, AKT slopina apoptozę skatinant NF-κB [42]. Naujausi tyrimai taip pat parodė, kad ANXA4 sąveikauja su P105 (NF-κB P50 baltymo pirmtake) ir slopina transkripcijos veiklą NF-κB sukelti anti-Apoptozė poveikį [25]. Kartu šie stebėjimai rodo, kad ANXA4 vaidina svarbų vaidmenį ląstelių išlikimo ir ląstelių augimo.

CDK1-cikloniniai B1 kompleksai reguliuoti ląstelės ciklo G2 /M etapą ir taip pat buvo susijęs skatinant tumorigenezei [43]. Neseniai atliktas tyrimas atskleidė, kad padidėjo išraiška CDK1 yra susijęs su progresavimo nuo H. pylori
-associated gastritas su gleivine susijęs limfoidinio audinio limfoma [28]. Šiame tyrime CDK1 aktyvacijos buvo-reguliuojami ANXA4. Šie įvykiai rodo, kad ANXA4 gali tarpininkauti pasroviui signalo kelią, todėl tumorigenezei skrandžio vėžiu pacientams, kuriems H. pylori
infekcija.

Be jo dalyvavimo vėžio progresavimą, ANXA4 taip pat buvo susijęs su įgyta Atsparumas cheminėms į priešvėžinių vaistų [44], [45], [46]. Be paklitakselio atsparus ląstelių linijos (H460 /T800), ANXA4 išraiška padidėjo ir lokalizuotas branduolio [44]. Be aiškaus ląstelių kiaušidžių karcinomai ir mezoteliomą ląstelių, ANXA4 išraiška yra padidėjusi ir susijęs su atsparumu gydymo karboplatina, ir laikomas biologinis už jautrumą cisplatina [45], [46]. Be to, ANXA4 yra viduląstelinis Ca ^{2 + jutiklis, bei Ca 2 + vaidina svarbų vaidmenį neurotoksinis poveikis ir širdies nepakankamumo [47], [48]. Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad suma padidėjo ANXA4 yra ne tik susijęs su vėžio bet taip pat Alzheimerio liga, širdies nepakankamumas ir ląstelių pažeidimas, kurį sukelia etanolio [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ pasiuntinys sistema taip pat yra reikalingas ląstelių proliferaciją procesą ir gali reguliuoti ląstelių ciklą [52], [53]. Buvo pranešta, kad Ca 2 + galite įjungti AKT kelyje skatinti ląstelių išgyvenimą [54]. Šiame tyrime, mes nustatėme, kad RHAMM, fosfo-AKT ir p21 slopinimo išraiška buvo žymiai padidėjo [Ca 2 +] _{i Elevation (5 paveikslas). h. pylori
infekcija yra susijusi su ANXA4 raiškos ir ląstelėje [Ca 2 +] i Elevation (S4 pav ir failo S1) [17], [33]. Šie rezultatai rodo, kad H. pylori
infekcija gali sukelti šiek tiek pasroviui signalizavimo ANXA4 skatinant Intraląstelinė [Ca 2 +] i aukščio. Vis dėlto detalė mechanizmas procese gali būti sudėtinga ir lieka neaišku. Tai galėtų suteikti išaiškinimas skrandžio Tumorigenesis proceso pagrindinės H. pylori
stimuliacija. Kartu paėmus, tai rodo, kad Ca 2 + gali padėti ANXA4 į transduce signalizacijos ir skatinti tumorigenezei skrandžio pacientams, sergantiems H. pylori
infekcija.}}

Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad ANXA4 triukšmo slopinimo sumažėja epitelio ląstelių proliferaciją, o jo raiška padidina platinimu. Be to, ANXA4 skatina tolesnius signalus, kurie skatina ląstelių augimą. Mes iškėlė hipotezę, kad šie pasroviui signalai ir aktyvacijos priimančios ląstelės dalijimosi gali būti patogeninių įvykiai H. pylori
indukuotų kancerogenezės. Dabar medicinos terapijos, AKT, p21 ir CDK1 buvo naudojamas kaip priešvėžinis vaistais objektas. AKT inhibitorius, Perifosine, yra geriamasis priešvėžinis agentas ir turi anti-platinimo veiklą keliose navikų modelių [55], [56], [57]. Paklitakselis (Taxol) ir vinkristino gali sukelti ir padidinti P21 išraišką sumažinti G2 /M suėmimą ir blokuoti ląstelių proliferaciją [58], [59], [60], [61]. Flavopiridolio yra keletas CDKs įskaitant CDK1 sukelti apoptozę ir anti-angiogenezę [62] inhibitorius. Šie tyrimai rodo, kad ANXA4 aukštis pacientams, gali būti laikomas narkotikų tikslo skrandžio vėžio gydymo. Naudojant kelis narkotikus kartu gali suteikti daugiau veiksmingų gydymo blokuoti signalus keliu. Kartu paėmus, šis tyrimas galėtų suteikti naujų įžvalgų į terapiniais strategijas skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos ir auginimo sąlygos

Žmogaus skrandžio adenokarcinoma AGS ląsteles (CRL-1739, ATCC) buvo auginami 90% RPMI 1640 terpė (Biologiniai Industries, Bet-HaEmek, Izraelis), kuris buvo papildytas 1% penicilinui /streptomicino ir 10% vaisiaus galvijų serumo (Biologiniai Industries, Bet-HaEmek, Izraelis) , Ląstelės buvo auginamos 37 ° C kontroliuojamą drėkinamame atmosferą inkubatoriuje sudėtyje yra 5% CO _2.

plazmidės ir transfekcija

Visas ilgis ANXA4
buvo amplifikuotas naudojant pradmenų pora, ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') ir ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), ir amplifikacijos produktas buvo įterptas į Hind III /EcoRI svetainėse pcDNR 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
specifinę siRNR ir neigiamos kontrolės Stealth siRNR (Stealth RNRi ™) buvo nupirkta iš Invitrogen (Carlsbad, CA, JAV). Ląstelės buvo auginamos šešių duobučių lėkštelėse arba dengto viršelis lapelių už 24 h. Ląstelės buvo tada laikinai perkeltų su pcDNR 3.1 (+) / ANXA4
(8 mikrogramai šešerių šulinėlių plokštelės; 0,4 /ml 96 šulinėlių E plokštės mikrogramų) arba ANXA4
siRNR (100 pmol dėl šešių šulinėlių plokštelės; 10 pmol už 96 šulinėlių E-plokštelės), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Ekspresijos vektorių ir siRNA transfekcijos efektyvumas buvo analizuojami immunoblot. Po transfekciją 48 h, buvo aptiktas skirtumas išraiška baltymų ir genų

Antikūnai

Pelės monokloniniai antikūnai, naudojami šiame tyrime, buvo taip:. CDK1 P34 (SC-51578) iš Santa cruz biotechnologijos (Santa Krusas, Kalifornija, JAV); LAMP2 (ab25631) ir RHAMM (ab67003) nuo Abcam (Cambridge, Jungtinė Karalystė); ir α-tubulino (T5168) Sigma (Dorset, Jungtinė Karalystė). Triušis polikloniniai antikūnai buvo taip: ANXA4 (SC-28.827), P21 (SC-397) ir pCDK1 P34 (Kt 161; SC-101.654) iš Santa Cruz biotechnologijos; ir AKT (9272) ir Pakt (Ser473; 9271S). iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos (Beverly, MA, JAV)

imunoblotas

Mobilaus ryšio Lizatai paruošti iš AGS ląstelių, kurios buvo laikinai perkeltų su ekspresijos vektorius pcDNR 3,1 (+) / ANXA4
(8 mikrogramai) arba ANXA4
siRNA (100 pmol). Norėdami nustatyti baltymų raiškos skirtumus esant dideliam ląstelėje [Ca ^{2 +] _{i ionomycin (5 mkm) buvo įtraukta į 1 h ląsteles. Mokytis inhibavimo AKT fosforilinimo poveikį, ląstelės buvo alkanas 1,5 h Po 48-h transfekciją ir buvo gydomi 5 mikronų į VIII AKT inhibitoriaus (Merck KGaA, Darmstadt, Vokietija) už 1 h. Mėginiai buvo atskirtas nuo 10% SDS-PAGE ir tada perkelti ant polivinilideno difluoridą (PVDF) membranas (MILLIPORE, BILLERICA, MA, JAV). Po blokavimo 5% Nonfat pieno ir Tris-buferinis tirpalas (TBS), kuriame yra 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, JAV) 1 val kambario temperatūroje su švelniu supime, buvo taikomi šie pirminiai antikūnai: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-P21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-Pakt (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Kt 161; 1:500), ir anti-RHAMM antikūnas (1:400). Membranos buvo inkubuojami su vidurinio ožkos anti-pelės konjuguoto IgG antikūnų (sigma), ar ožkos anti-triušis konjuguota IgG (Rockland, Gilbertsville, MA), atitinkamai. alfa-tubulino antikūnas (1:4000) buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Immunoblots buvo sukurtas naudojant sustiprintas chemiluminiscence (ECL) aptikimo rinkinį (MILLIPORE) ir vizualizuota rentgeno filmų. Stebėtų juostų intensyvumas buvo normalizuotas į α-tubulino juostos intensyvumo. Densitometric analizė atlikta naudojant "Kodak" 1-D Vaizdo analizės programinė įranga versiją 3.6 ( "Eastman Kodak, Londonas, Jungtinė Karalystė).}}

Exon masyvas Hibridizacija ir analizė

Jei studijuoti pasroviui genus ANXA4, mes palyginti geno ekspresijos profilius tarp ląstelių transfektuotose pcDNA3.1 (+) / ANXA4 parsisiųsti ir kontrolinėse duobutėse perkeltų su tuščiu vektorių, naudojant Exon masyvo. Bendras korinio RNR buvo išskirta naudojant TRIzol® reagentas (Invitrogen), ir RNR grynumas buvo patvirtinta spektrofotometriškai (A260 /A280 santykis), taip pat kapiliarine elektroforeze (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNR apdorojimas ir hibridizacija buvo atliekami naudojant Affymetrix Žmogaus Exon 1,0 ST matricos (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Kiekvienas masyvas turi 28,869 gerai komentuojami genus su 764,885 skirtingų zondų. Masyvas yra maždaug 26 zondai kiekvieno geno. Affymetrix zondas rinkiniai informacija rodomi NetAffx svetainėje (http://www.affymetrix.com) [63]. Mikrogardeliq analizė (N = 2 kiekvienai grupei) buvo atliktas naudojant Partek genomika Suite 6.5 versiją (Partek Inc., St Louis, MO, JAV). Pirminiai duomenys (LEL failai) buvo normalizuotas naudojant patikimas daugialustė vidurkio (RMA) algoritmą ir analizuojami naudojant T
bandymus. Analizė funkcijos ir biologinis mechanizmas iš diferencijuotai išreikštų genų buvo atliktas naudojant Išradingumas Kelias analizė (PNPP) programinės įrangos versiją 7.5; 3 ar aukščiau rezultatas buvo laikomas statistiškai reikšmingas ( P
< 0,01) anotuoti informaciją. Mes pateikėme masyvo duomenis GEO duomenų bazėje, o serijos rekordinis skaičius yra GSE33620.

Kiekybiniai Realaus laiko PGR (KRL-PGR)

Exon masyvo duomenys, gauti naudojant Partek programinę įrangą ir PNPP duomenų buvo patvirtinta KRL-PGR. RNR buvo išskirta iš AGS ląstelių naudojant TRIzol® reagentas (Invitrogen) ir RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Pirmosios krypties kDNR buvo sintetinamas iš viso mRNR naudojant atvirkštinę transkripciją komplektas (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija). Gruntai (lentelė S2) buvo sukurta, naudojant DNAStar programinė įranga (DNAStar, Inc, Madison, WI, JAV) ir PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Genų ekspresija buvo matuojamas naudojant Bio-Rad iQ5 realaus laiko PGR aptikimo sistema su SYBR Žalioji SUPERMIX (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV), ir buvo normalizuotas GAPDH išraiška.

ląstelių proliferaciją Analizės

AGS ląstelės buvo pakrautas į kiekvieną 16 šulinėlių mikrotitravimo E-plokštelės duobutę. Kiekvienas gerai esančius mikroelektronikos jutiklis masyvų prie pagrindo aptikti ląstelių indeksas (PI). Už transfekcijos eksperimentų, po inkubacijos 24 h, AGS ląstelės buvo transfekuota ekspresijos vektoriai arba siRNAs už 6 h ir stebima, ar 84 h iš viso. E-plokštelė buvo įtrauktas į realiu laiku Mobilusis Analizatorius (RTCA) sistemos ir inkubuojami inkubatoriuje sudėtyje yra 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje. Iš ląstelių proliferaciją lygis atstovavo KI, kuris buvo grindžiamas impedansas matuojami xCELLigence sistemą (Roche, Manheimas, Vokietija).}

Statistinė analizė

Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis standartinis nuokrypis (SD). Skirtumas tarp nepriklausomų grupių buvo analizuojami naudojant dviejų-tailed Stjudento T
testą. gauti iš ląstelių proliferacijos tyrimu duomenys buvo analizuojami naudojant dviejų imties Kolmogorovo-Smirnovo testą. P
vertė mažesnė negu 0,05 nurodyta statistinį reikšmingumą.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Taškinė sklypas zondo intensyvumo pakartotinių Exon masyvo eksperimentams. Zondo intensyvumas dviejų pakartotinių eksperimentų buvo pateikiami atskirai ant , X
ašies ir Y
ašies. Kiekvienas zondas atstovavo vieną tašką į sklaida sklypas. Šie rezultatai parodė, nuoseklumą mūsų dublikatas Exon masyvo eksperimentų
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
S2 pav.
ANXA4 dalyvauja plazmos membranos remonto įdarbinant exocytotic membraną. Atstovas tėkmės citometrijos analizė parodė LAMP2 buvimą H. pylori
-infected ląsteles. (A) ANXA4 ekspresija ląstelės buvo palyginti su (B) ANXA4
-silenced ląstelės. Rezultatai rodo, kad ANXA4 skatina LAMP2 išraiška remiantis H paviršiaus. pylori
-infected ląsteles. ANXA4 raiška, per ANXA4; Valdymo siRNR, siControl; . ANXA4
siRNA, SI, ANXA4
Doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
S3 pav.
ANXA4 skatina pasroviui signalo perdavime. KRL-PGR ir ANXA4 ekspresija AGS ląstelių (juodosios dėžės) buvo atliekama siekiant patvirtinti gautus Exon matricos (pilka dėžės) duomenis. Į santykinis iRNR lygiai CDK1
ir , PBK
buvo matuojamas ir normalizuojama iki GAPDH
iRNR lygiai
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
S4 pav.
Ląstelės viduje Ca 2 + pakilimas, ANXA4 ir LAMP2 lokalizacija ant H. pylori
infekcija. (A) H. pylori
-infected AGS ląstelės buvo pakrautas su Fluo-3 /val stebėti vidines ląstelių Ca 2 + lygius tėkmės citometrijos. (B), dinaminis lokalizacija ANXA4 gyvenamasis langelį. Realaus laiko fluorescencijos vaizdai, rodantys lokalizacijos EGFP-ANXA4 į H. pylori
-infected AGS ir SC-M1 ląstelių (geltona rodyklė) tamsintas su Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescencijos dėl H paviršiaus.

• PLoS ONE: iš XPD /ERCC2 polimorfizmas poveikį skrandžio vėžio riziką tarp skirtingų etninių grupių: sisteminė apžvalga ir meta-Analysis
• PLoS ONE: baltymas rūgštus ir Turtingas cisteinas (SPARC) Stabdo angiogenezę Down reguliavimas VEGF ir MMP-7 raišką Skrandžio Cancer