PLoS ONE: Rivelare il meccanismo molecolare del cancro gastrico Marker annessina A4 in Cancer Cell Proliferation Utilizzando Exon Arrays

Estratto

cancro gastrico è una malattia maligna che nasce dal dell'epitelio gastrico. Un biomarcatore potenziale per il cancro gastrico è la proteina annessina A4 (ANXA4), un Ca intracellulare ^{2 + sensore. ANXA4 si trova principalmente nelle cellule epiteliali, ed è noto per essere coinvolto in vari processi biologici, tra cui l'apoptosi, ciclo cellulare e la terapia anticoagulante. Per quanto riguarda il cancro, ANXA4-sovraespressione è stata osservata nei tumori di varia origine, tra cui i tumori gastrici associati a Helicobacter pylori
infezione. H. pylori
induce l'espressione ANXA4 e intracellulare [Ca 2 +] _{i elevazione, ed è un importante fattore di rischio per la carcinogenesi che si traduce in cancro gastrico. Nonostante questa correlazione, il ruolo del ANXA4 nella progressione dei tumori gastrici ancora chiaro. In questo studio, abbiamo esaminato se ANXA4 può mediare il tasso di crescita delle cellule e se i segnali a valle ANXA4 sono coinvolti nella tumorigenesi. Dopo aver osservato il tasso di crescita delle cellule in tempo reale, abbiamo stabilito che ANXA4 promuove la proliferazione cellulare. Il profilo trascrizione genica di cellule ANXA4-iperespressione è stato misurato e analizzato da array esone umani. Da questi dati gene trascrizionali, abbiamo dimostrato che l'iperespressione di ANXA4 regola geni che sono noti per essere correlati al cancro, ad esempio, l'attivazione di acido ialuronico mediata dai recettori motilità (RHAMM), AKT, e ciclina-dipendente chinasi 1 (CDK1), così come la soppressione di p21. La regolazione di questi geni induce ulteriore proliferazione delle cellule tumorali. Abbiamo anche trovato Ca 2 + potrebbe regolare la trasmissione di segnali a valle da ANXA4. Suggeriamo che ANXA4 innesca una cascata di segnali, che porta ad un aumento della proliferazione delle cellule epiteliali, in ultima analisi, promuovere la carcinogenesi. Questi risultati potrebbero quindi fornire una nuova prospettiva per la terapia del cancro gastrico, in particolare attraverso la modifica di attività ANXA4}}

Visto:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Rivelare il meccanismo molecolare del cancro gastrico Marker Annessina A4 in Cancer Cell Proliferation Utilizzando Exon array. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

Editor: Eric Y. Chuang, Università Nazionale di Taiwan, Taiwan

Ricevuto: 6 Giugno 2012; Accettato: 6 agosto 2012; Pubblicato: 7 settembre 2012

Copyright: © Lin et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Council di Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), la National Taiwan University Cutting-Edge Project Steering Research (10R70602C3) e l'Istituto di ricerca sanitario nazionale, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è la seconda causa di decessi per cancro in tutto il mondo e mostra un'alta prevalenza nelle popolazioni asiatiche. Sebbene l'incidenza di cancro gastrico è in declino, il tasso complessivo di sopravvivenza a 5 anni rimane basso [1]. Determinazione delle più efficaci terapie contro il cancro gastrico e lo sviluppo di early-stage strumenti diagnostici sono strategie importanti che interessano gli esiti clinici. L'indagine completa dei meccanismi molecolari che sono alla base carcinogenesi gastrica potrebbe fornire assistenza nello sviluppo di strategie terapeutiche utili per questa malattia.

Helicobacter pylori
è un patogeno gastrica ed è il fattore eziologico predominante per carcinogenesi gastrica . Circa la metà della popolazione mondiale è infettato con H. pylori
, e più del 60% dei pazienti affetti da cancro gastrico hanno una storia di H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Recenti studi hanno dimostrato che H. pylori
può indurre sia la proliferazione delle cellule di cancro gastrico e risposte infiammatorie della mucosa [5], [6]. Così, al fine di studiare i meccanismi molecolari alla base carcinogenesi gastrica, è necessario indagare il ruolo e meccanismi di H. pylori
nella carcinogenesi gastrica.

Annexins sono ubiquitariamente espressi in molti organismi, tra animali, piante, funghi e protisti. Si è associato con una varietà di funzioni fisiologiche [7]. Sulla base della struttura del loro dominio nucleo conservato, annexins sono considerati intracellulare Ca ^{2+ sensori e proteine ​​leganti fosfolipidi. Sono stati osservati per stimolare traffico di membrana e l'aggregazione delle vescicole in risposta all'aumento intracellulare [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Negli esseri umani, annexins sono stati osservati per avere una gamma di funzioni cellulari che sono state implicato nell'organizzazione del citoscheletro, esocitosi, endocitosi, la regolazione dei canali ionici, infiammazione, l'apoptosi, la fibrinolisi e coagulazione [8]. Annexins sono considerati di essere coinvolti nel cancro, il diabete e l'infiammazione [10]. Recentemente, sempre più studi sono emerse che implicano il coinvolgimento di annexins nella carcinogenesi, oltre a promuovere la proliferazione [11], [12], l'invasione [13] e le metastasi [14], [15]. Tuttavia, la relazione tra tutti i membri della famiglia annexins con cancro non è stata caratterizzata.}}

annessina A4 (ANXA4) è un membro della famiglia annexins associato al sistema digestivo. E 'ben visibile espresso in cellule epiteliali [16]. Recenti studi hanno dimostrato che ANXA4 è considerato un potenziale biomarker gastrica base alla sua identificazione nei tessuti di pazienti affetti da cancro gastrico in studi di proteomica. Up-regolazione di ANXA4 è specificamente si trovano in H. pylori
tessuti tumorali -infected [17], [18]. Inoltre, molti studi hanno riportato una relazione tra espressione ANXA4 e il cancro. Questo rapporto è stato segnalato in adenocarcinoma pancreatico [19], il carcinoma a cellule chiare dell'ovaio [20], [21], il carcinoma renale [22], carcinoma del colon [23] e il cancro alla prostata [24]. Nel carcinoma a cellule renali, up-regolazione di ANXA4 è coinvolta nella diffusione delle cellule tumorali, promuovendo la migrazione delle cellule [22]. In pazienti affetti da cancro del colon-retto, alta espressione di ANXA4 è stato associato ad un basso tasso di sopravvivenza ed è stato segnalato come un potenziale biomarker per la diagnosi del tumore [23]. Nella misura in cui la funzione come cellulari, ANXA4 potrebbe indurre la segnalazione di calcio, anticoagulante e resistenza all'apoptosi [25], [26]. Questi eventi indicano che ANXA4 ha una funzione tumorigenico regolando il tasso di crescita delle cellule.

In questo studio, abbiamo voluto chiarire il meccanismo molecolare con cui ANXA4 induce carcinogenesi. Per fare questo, abbiamo monitorato il tasso di crescita delle cellule di cancro gastrico con diversi livelli di espressione di ANXA4. Abbiamo anche valutato il profilo di espressione trascrizionale di cellule ANXA4-overexpressing e utilizzato array esone per analizzare la segnalazione a valle di ANXA4. Da questi studi, abbiamo identificato 9 geni correlati al cancro da segnali a valle ANXA4 utilizzando il database Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Inoltre, abbiamo dimostrato che ANXA4 regola l'attivazione di RHAMM, AKT, CDK1 e la soppressione di p21, e quindi proposto un percorso di proliferazione cellulare ANXA4-regolato.

Risultati

L'attivazione di ANXA4 Promuove Cell Proliferation

Abbiamo già riferito che ANXA4 è sovraespresso in H. pylori
infetto tessuto tumorale gastrica [17]. Per studiare ulteriormente il rapporto tra ANXA4 e carcinogenesi, abbiamo cercato di determinare se ANXA4 promuove la proliferazione cellulare. Le cellule sono state trasfettate sia con full-length ANXA4
cDNA per aumentare l'espressione ANXA4 o siRNA specifico volto a tacere espressione ANXA4. Dopo trasfezione, abbiamo monitorato il tasso di crescita delle cellule di cancro gastrico AGS utilizzando un sistema di analisi di cellule in tempo reale (RTCA). il numero di cellule sono stati registrati come un valore indice di cella (CI). Le curve di crescita delle cellule AGS sono stati modificati seguente trasfezione. La sovraespressione di ANXA4 aumentato in modo significativo il tasso di crescita delle cellule in cellule AGS rispetto alle cellule di controllo ( P
< 0,001; Figura 1A), mentre ANXA4 atterramento diminuito in modo significativo il tasso di crescita ( P
<0,001; Figura 1B). Questi risultati suggeriscono che ANXA4 ha il potenziale per promuovere la proliferazione cellulare.

ANXA4 aumenta l'espressione delle proteine ​​di membrana, RHAMM e LAMP2

Abbiamo anche esaminato la differenza di espressione genica tra ANXA4-iperespressione cellule e cellule di controllo che esprimono un vettore vuoto. Abbiamo esaminato questo usando analisi serie esone, che offre una visione più precisa di espressione a livello del gene utilizzando quattro sonde per esone, rispetto ai tradizionali 3 'array [27]. Nella Figura S1, il X
-axis del grafico a dispersione mostra le intensità di espressione sonda misurata in un esperimento e il Y
asse visualizza le intensità di espressione sonda misurati in un altro esperimento . Questi risultati indicano una correlazione tra i risultati di entrambi gli esperimenti e quindi indicano una coerenza tra i nostri microarrays duplicati. I livelli di espressione genica sono stati calcolati dalle intensità misurate tramite set di sonde. Nel complesso, l'espressione di 1.052 geni sono risultati essere significativamente differenti ( P
< 0,05). Tra le cellule ANXA4-overexpressing e cellule di controllo

ANXA4 è una membrana plasmatica proteina legante, quindi abbiamo propongono che altre proteine ​​di membrana plasmatica potrebbero essere regolate da ANXA4 e lavorare insieme per trasdurre la sua segnalazione a valle. Per esplorare la trasduzione del segnale regolata da ANXA4, abbiamo studiato le proteine ​​della membrana plasmatica da analisi serie esone. sono stati osservati Quarantasette proteine ​​di membrana plasmatica di avere un cambiamento ≥1.5 volte nelle cellule ANXA4-iperespressione (Tabella S1). Tra questi, il recettore motilità acido ialuronico-mediata ( HMMR
) ha mostrato il maggiore incremento di espressione (2,4 volte; Tabella S1). Inoltre, il nostro studio precedente ha mostrato che l'espressione di superficie cellulare lisosomiale associata proteina di membrana 2 ( LAMP2
), un marker lisosomiale, è up-regolato dalla ANXA4 e si occupa di esocitosi (Figura S2 e S1 file) . Qui, l'espressione trascrizionale del LAMP2
ha anche mostrato un aumento di espressione (1,8 volte; Tabella S1) quando misurata mediante analisi serie esone. In questo studio, è stato ANXA4 sovraespresso o tacere (Figura 2A) e poi analizzato mediante immunoblotting per controllare l'espressione della proteina di RHAMM e LAMP2. ANXA4 sovraespressione ha aumentato l'espressione di RHAMM (Figura 2B) e LAMP2 (Figura 2C) e, in linea con questo, l'atterramento di espressione ANXA4 diminuito i loro livelli di espressione (Figura 2b e 2c).

Cancro ANXA4 sovraespressione Regola -related gene Expression

Abbiamo usato il database Ingenuity Pathway Analysis (IPA) per eseguire un'analisi funzione genica dei dati di matrice esone e abbiamo scoperto che il 25 dei 42 geni erano idonei per l'analisi funzione di rete (≥2 volte espressione differenziale, t
test, P
< 0,05) (Tabella 1). Tre reti funzionali sono risultati significativamente associati con i geni ANXA4-regolati. La rete più fortemente associato è stato il cancro, ciclo cellulare, e il sistema riproduttivo malattia
( P
< 0,05; figura 3A), ed il top-ranked malattie o problemi di stato cancro
( P
< 0,05; Figura 3B). Ci sono stati 9 geni classificati come i geni correlati al cancro nelle cellule ANXA4-sovraespressione di cui 7 geni che sono stati up-regolati nei nostri esperimenti. Questi geni sono traduzione eucariotica iniziazione fattore 4E ( eIF4E
), complesso succinato deidrogenasi, subunità C, proteina integrale di membrana, 15 kDa ( SDHC
), ciclina-dipendente chinasi 1 ( CDK1
), eliminato nella leucemia linfocitica 2 ( DLEU2
), cromatina modifica la proteina 5 ( CHMP5
), SENZA TEMPO proteine ​​che interagiscono ( TIPIN
), PDZ- chinasi legame (
PBK). Corionica somatomammotropin ormone 1 (placentare lattogeno) ( CSH1
) e interferone alfa 2 ( IFNA2
) sono stati down-regolati da ANXA4. Sulla base dei nostri risultati, proponiamo che ANXA4 ha una funzione di indurre la proliferazione cellulare. Inoltre, CDK1
e PBK
(Figura 3B e Tabella 1) sono stati considerati di essere coinvolti nel modello di proliferazione che inducono ANXA4. Poiché l'attivazione CDK1 è associata alla proliferazione cellulare nello sviluppo gastrico MALT linfoma [28]. L'attivazione reciproca delle CDK1 e PBK è stato riportato in precedenza [29]. In questo studio, l'up-regolazione di CDK1
e PBK
osservato in cellule ANXA4-iperespressione è stato convalidato da tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa (qRT-PCR) (figura S3) .

ANXA4 Regola l'attivazione di AKT, CDK1 e la soppressione di p21

attivazione CDK1, che è regolata da p21, inibisce G2 /M fase di arresto, promuovendo così la mitosi e la proliferazione delle cellule [30 ]. Inoltre è stato riportato che i blocchi AKT l'attivazione di p21, causando l'accumulo nel citoplasma e promuovere di conseguenza la proliferazione cellulare [31]. Usando l'analisi immunoblot, abbiamo osservato che l'iperespressione di ANXA4 aumentato la fosforilazione della serina 473 su AKT e treonina 161 su CDK1 e diminuito l'espressione di p21 (Figura 4A). In aggiunta a questo, il colpo di espressione ANXA4 diminuita fosfo-AKT e fosfo-CDK1 e aumentato l'espressione di p21 (Figura 4B). Questi dati suggeriscono che fosfo-AKT, fosfo-CDK1 e p21 sono regolati da ANXA4 e sono segnali a valle di ANXA4.

Ca 2 + Mediazione di ANXA4 Downstream trasduzione del segnale

In carcinogenesi, Ca ^{2+ è coinvolto nel causare trasduzione del segnale di mediare una varietà di processi biologici che comprendono invasione, la proliferazione, angiogenesi e metastasi [32]. E 'stato riportato che annexins possono mediare alcuni meccanismi fisiologici in una Ca 2 + -dipendente modo [9]. In studi precedenti, intracellulare [Ca 2 +] _{i elevazione è stata indotta da H. pylori
infezione, che, a sua volta, up-regola l'espressione ANXA4 [17], [33]. Per determinare se un aumento intracellulare [Ca 2 +] i media la trasmissione di segnali a valle da ANXA4, le cellule sono state trattate con AGS ionomicina. Ionomicina è una Ca 2 + ionoforo ed è stato aggiunto al terreno di coltura nel nostro modello cellulare AGS per indurre un aumento prolungato di intracellulare [Ca 2 +] i [34]. Le espressioni proteiche del ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT e fosfo-CDK1 sono stati misurati mediante analisi immunoblot (Figura 5A). Simile alle nostre osservazioni con ANXA4 sovraespressione, aumento della [Ca 2 +] i livelli significativamente up-regolati l'espressione di RHAMM ( P
< 0,01) e fosfo-AKT (Ser 473) ( P
< 0,05) e significativamente down-regolato l'espressione di p21 ( P
< 0,01) (Figura 5B). attivazione CDK1 era leggermente aumentata di [Ca 2 +] i elevazione. Tuttavia, elevata [Ca 2 +] i livelli non ha avuto effetti sull'espressione di ANXA4 e LAMP2. Nel nostro precedente studio, ANXA4 e LAMP2 possono localizzare a membrana plasmatica dopo H. pylori
infezione da intracellulare [Ca 2 +] i elevazione (figura S4 e file S1). Questi risultati suggeriscono che Ca 2 + cambia solo posizione intracellulare di ANXA4 e LAMPADA2, ma non regola la loro espressione.}}

Discussione

nella ricerca sul cancro, l'identificazione di biomarcatori e la successiva precisazione dei loro rapporti meccanicistiche con tumorigenesi può contribuire allo sviluppo di strumenti diagnostici utili e determinare strategie terapeutiche ottimali. Recentemente, sempre più studi hanno dimostrato che le proteine ​​biomarcatori candidati famiglia annexins sono potenzialmente determinante per la progressione di vari tipi di cancro; ad esempio, ANXA1 per il carcinoma a cellule renali chiare, ANXA2 per cancro gastrico e il cancro colorettale, ANXA4 per il tumore del colon-retto, ANXA8 per il cancro al seno, il cancro epatocellulare ANXA10 per, ANXA11 per il cancro ovarico e tumore del colon retto [35]. ANXA4, un membro della famiglia annexins, è stato osservato per essere sovraespresso nei tessuti tumorali gastrici ed è anche associato con il H correlate al cancro gastrico. pylori
infezione [17]. Inoltre, un altro membro della famiglia annexins, ANXA2, è stato anche osservato per essere sovraespresso nel cancro gastrico ed è relativa a poveri risultati clinici, che lo rende un potenziale fattore prognostico [36]. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono il coinvolgimento di ANXA4 nella tumorigenesi; Tuttavia, il suo meccanismo esatto nel processo rimane poco chiaro. Al fine di valutare ulteriormente la funzione cellulare della ANXA4 nella progressione del cancro gastrico, abbiamo esplorato il legame tra i due e, successivamente dimostrato che ANXA4 può regolare i geni legati al cancro e propagare il percorso di proliferazione cellulare.

il presente studio, abbiamo scoperto che le proteine ​​di carcinogenesi associate quali RHAMM, AKT, p21, PBK, e CDK1 sono regolati dalla sovraespressione di ANXA4. Una rappresentazione schematica di segnali a valle ANXA4 indotte legate alla proliferazione cellulare è mostrato in Figura 6. HMMR
(RHAMM) è un oncogene che è sovraespresso in molti tumori, tra cui il cancro gastrico, ed è stato implicato in molti cellulari processi, come la segnalazione cellulare, la proliferazione cellulare e tumorigenesi [37], [38].

e 'stato riportato che RHAMM induce la cascata di segnali RAS e attiva AKT [39]. La cascata di segnalazione RAS transduces segnali a valle attivando fosfo-AKT attraverso phosphoinositide 3-chinasi. Questa attivazione di AKT è stato anche segnalato come un indicatore per la progressione del cancro gastrico [40]. Abbiamo già riferito che H. pylori
infezione è associata con sovraespressione ANXA4 [17]. H. pylori
in grado di fornire la citotossina associato gene A (CagA) nelle cellule ospiti, con conseguente attivazione di AKT, e favorendo così la proliferazione cellulare [41]. In termini di sopravvivenza delle cellule, AKT sopprime l'apoptosi stimolando NF-kB [42]. Recenti studi hanno anche dimostrato che ANXA4 interagisce con p105 (la proteina p50 precursore NF-kB) e sopprime l'attività trascrizionale di NF-kB per indurre un effetto anti-apoptotico [25]. Nel loro insieme, queste osservazioni indicano che ANXA4 svolge un ruolo importante nella sopravvivenza delle cellule e la crescita delle cellule.

CDK1-ciclina B1 complessi regolano l'/fase M del ciclo cellulare G2 e sono stati anche coinvolti nella promozione della tumorigenesi [43]. Un recente studio ha rivelato che aumentata espressione di CDK1 è associata con la progressione da H. pylori
gastrite -associated di linfoma malt [28]. In questo studio, l'attivazione CDK1 era up-regolati da ANXA4. Questi eventi indicano che ANXA4 potrebbe mediare il percorso del segnale a valle, con conseguente tumorigenesi nei pazienti affetti da cancro gastrico con una H. pylori
infezione.

In aggiunta al suo coinvolgimento nella progressione del cancro, ANXA4 è stata anche legata alla chemioresistenza acquisita ai farmaci antitumorali [44], [45], [46]. In una linea di cellule paclitaxel-resistente (H460 /T800), espressione ANXA4 è aumentata e localizzata nel nucleo [44]. Nel carcinoma a cellule chiare delle cellule ovariche e mesotelioma, espressione ANXA4 è elevata e associata con la resistenza al trattamento con carboplatino, ed è considerato un biomarker per la suscettibilità alla cisplatino [45], [46]. Inoltre, ANXA4 è 2+ sensore intracellulare Ca ^{e Ca 2+ svolge un ruolo importante nella neurotossicità e scompenso cardiaco [47], [48]. Recenti studi hanno dimostrato che la maggiore quantità di ANXA4 non solo è associato con il cancro, ma anche la malattia di Alzheimer, insufficienza cardiaca e lesioni delle cellule causate da etanolo [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ sistema di messaggistica è necessario anche per il processo di proliferazione cellulare e può regolare il ciclo cellulare [52], [53]. E 'stato riportato che Ca 2 + può attivare via AKT per promuovere la sopravvivenza delle cellule [54]. In questo studio, abbiamo scoperto che l'espressione di RHAMM, fosfo-AKT e la soppressione di p21 sono aumentate significativamente del [Ca 2 +] _{i elevazione (figura 5). H. pylori
infezione è associata a ANXA4 sovraespressione e intracellulare [Ca 2 +] i elevazione (figura S4 e File S1) [17], [33]. Questi risultati indicano che H. pylori
infezione potrebbe indurre qualche segnalazione a valle di ANXA4 stimolando intracellulare [Ca 2 +] i elevazione. Tuttavia il meccanismo dettaglio nel processo potrebbe essere complessa e rimane poco chiaro. Questi potrebbero fornire delucidazione del processo di tumorigenesi gastrico sottostante H. pylori
stimolazione. Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che Ca 2 + potrebbe assistere ANXA4 di trasdurre segnalazione e promuovere la tumorigenesi nei pazienti gastrici con H. pylori
infezione.}}

In conclusione, i nostri risultati mostrano che il silenziamento di ANXA4 riduce la proliferazione delle cellule epiteliali, mentre la sua sovraespressione aumenta la proliferazione. Inoltre, ANXA4 induce segnali a valle che promuovono la crescita delle cellule. Ipotizziamo che questi segnali a valle e l'attivazione della divisione della cellula ospite possono essere eventi patogeni in H. pylori
carcinogenesi indotta. Nella terapia clinica corrente, AKT, p21 e CDK1 sono stati utilizzati come un bersaglio di farmaci antitumorali. inibitore AKT, Perifosine, è un agente anti-cancro orale e ha attività anti-proliferazione in diversi modelli tumorali [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) e vincristina può indurre e aumentare l'espressione di p21 per ridurre G2 /M arresto e la proliferazione delle cellule blocco [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol è un inibitore di diversi CDK tra cui CDK1 di indurre apoptosi e anti-angiogenesi [62]. Questi studi indicano che l'elevazione ANXA4 in pazienti potrebbe essere considerato come un bersaglio di farmaci per la terapia del cancro gastrico. L'utilizzo di più farmaci in combinazione potrebbe fornire un trattamento più efficace per bloccare segnali nel percorso. Nel loro insieme, questo studio potrebbe fornire nuove intuizioni nello sviluppo di strategie terapeutiche per il cancro gastrico.

Materiali e Metodi

Cell Lines e Cultura condizioni

adenocarcinoma dello stomaco umano cellule AGS (CRL-1739, ATCC) sono state coltivate in 90% RPMI 1640 medium (Industrie biologici, Bet-Haemek, Israele) che è stato integrato con 1% di penicillina /streptomicina e 10% di siero fetale bovino (Industrie biologici, Bet-Haemek, Israele) . Le cellule sono state coltivate a 37 ° C in atmosfera umidificata controllata in un incubatore contenente il 5% di CO _2.

Plasmidi e trasfezioni

a tutta lunghezza ANXA4
Was amplificato mediante PCR utilizzando la coppia di primer ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') e ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), e l'amplificazione del prodotto è stato inserito nel HindIII /siti EcoRI di pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
SPECIFICI siRNA e controllo negativo Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) sono stati acquistati da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Le cellule sono state coltivate in sei pozzetti o rivestite coprioggetto per 24 h. Le cellule sono state poi trasfettate con pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 mcg per un piatto a sei bene; 0,4 mg /ml per un E-piastra a 96 pozzetti) o ANXA4
siRNA (100 pmol per un piatto a sei bene, 10 pmol di 96 pozzetti E-plate) utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. L'efficienza del vettore di espressione e siRNA trasfezione è stata analizzata mediante immunoblot. Dopo trasfezione per 48 ore, è stata rilevata l'espressione differenziale delle proteine ​​e geni

Anticorpi

Gli anticorpi monoclonali di topo utilizzati in questo studio sono stati i seguenti:. CDK1 p34 (SC-51578) da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) e RHAMM (ab67003) da Abcam (Cambridge, UK); e α-tubulina (T5168) da Sigma (Dorset, Regno Unito). Il coniglio anticorpi policlonali sono stati i seguenti: ANXA4 (SC-28827), p21 (SC-397), e pCDK1 p34 (Thr 161; sc-101654) da Santa Cruz Biotechnology; e AKT (9272) e pAKT (ser473; 9271S). da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA):

immunocolorazione

I lisati cellulari sono stati preparati dalle cellule AGS che sono state transitoriamente trasfettate con il vettori di espressione pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 mcg) o ANXA4
siRNA (100 pmol). Per determinare le differenze di espressione della proteina in condizioni di elevata intracellulare [Ca ^{2 +] _{i, ionomicina (5 micron) è stato aggiunto alle cellule per 1 h. Per studiare gli effetti di inibizione della fosforilazione Akt, le cellule sono state lasciate morire per 1,5 ore a 48 h trasfezione e sono stati trattati con 5 mM dell'inibitore AKT VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) per 1 h. I campioni sono stati separati da 10% SDS-PAGE e poi trasferite su polivinilidene (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, USA). anti-ANXA4 (: Dopo aver bloccato nel latte magro 5% e soluzione salina (TBS) contenente 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) per 1 ora a temperatura ambiente con dolce dondolio, sono state applicate le seguenti anticorpi primari Tris-buffered 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pAKT (ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500), e l'anticorpo anti-RHAMM (1:400). Le membrane sono state incubate con anticorpi di capra secondario anti-topo coniugata IgG (Sigma) o di capra anti-coniglio coniugato IgG (Rockland, Gilbertsville, PA), rispettivamente. anticorpo alfa-tubulina (1:4000) è stato utilizzato come controllo interno. Immunoblot sono stati sviluppati utilizzando kit di rilevamento avanzato chemiluminiscence (ECL) (Millipore) e visualizzati su pellicole radiografiche. L'intensità delle bande osservate era normalizzata all'intensità della banda α-tubulina. L'analisi densitometrica è stata effettuata utilizzando Kodak 1-D software Image Analysis versione 3.6 (Eastman Kodak, Londra, Regno Unito).}}

Exon Array ibridazione e analisi

Per studiare i geni a valle di ANXA4, abbiamo confrontato i profili di espressione genica tra le cellule trasfettate con pcDNA3.1 (+) / ANXA4
e cellule di controllo trasfettate con un vettore vuoto utilizzando una matrice esone. RNA cellulare totale è stato estratto utilizzando TRIzol® reagente (Invitrogen), e l'RNA la purezza è stata confermata mediante spettrofotometria (rapporto A260 /A280), nonché mediante elettroforesi capillare (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNA processing e l'ibridazione sono state eseguite utilizzando le Affymetrix Exon umana 1.0 array ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. Ogni array ha 28.869 geni ben annotati-con 764,885 diverse sonde. L'array contiene circa 26 sonde per ogni gene. Informazioni sonda Affymetrix set vengono visualizzati sul sito Web NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. analisi microarray (n = 2 per gruppo) è stata eseguita utilizzando il Partek Genomica Suite versione 6.5 (Partek Inc., St Louis, MO, USA). I dati grezzi (file CEL) sono stati normalizzati utilizzando l'algoritmo robusto multichip media (RMA) e analizzati utilizzando t
test. Analisi della funzione e meccanismo biologico dei geni differenzialmente espressi è stata effettuata utilizzando il software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) versione 7.5; un punteggio di 3 o superiore è stato considerato statisticamente significativo ( P
< 0,01) per annotare le informazioni. Abbiamo presentato i dati di matrice al database GEO, e il numero record di serie è GSE33620.

quantitativa Real-time PCR (qRT-PCR)

I dati dell'array esone ottenuti utilizzando il software Partek e il database IPA è stata confermata da qRT-PCR. RNA è stato isolato da cellule AGS utilizzando TRIzol® Reagent (Invitrogen) e il kit RNeasy® Mini (Qiagen, Hilden, Germania) secondo le istruzioni del produttore. cDNA First-strand è stato sintetizzato da mRNA totale utilizzando un kit di trascrizione inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primer (Tabella S2) sono stati progettati utilizzando il software DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) e PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Espressione genica è stata misurata utilizzando un real-time PCR sistema di rilevazione Bio-Rad iQ5 con una SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), ed è stato normalizzato a espressione GAPDH.

Cell Proliferation Assay

cellule AGS sono stati caricati in ciascun pozzetto di una 16-ben microtitolo E-plate. Ogni array di sensori microelettronici e contenuti alla base per rilevare l'indice di cella (CI). Per gli esperimenti di trasfezione, dopo incubazione per 24 ore, le cellule AGS sono state trasfettate con vettori di espressione o siRNA per 6 ore e monitorati per un totale di 84 h. L'E-piastra è stata posta nel sistema Real-Time Cell Analyzer (RTCA) e incubate in un incubatore contenente 5% di CO _{2 a 37 ° C. Il livello di proliferazione delle cellule è stato rappresentato come CI, che si basava sulla impedenza elettrica misurata utilizzando il sistema xCELLigence (Roche, Mannheim, Germania).}

Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± la deviazione standard (SD). Differenza tra gruppi indipendenti è stato analizzato utilizzando t
test di Student a due code. I dati ottenuti dal saggio di proliferazione cellulare sono stati analizzati con i due-campione Kolmogorov-Smirnov. A Valore P
inferiore a 0,05 indicato significatività statistica.

Informazioni di supporto
Figura S1.
grafico a dispersione delle intensità delle sonde in esperimenti di matrice esone ripetuti. Le intensità della sonda di due esperimenti ripetuti sono stati presentati separatamente in un X
-axis e Y
-axis. Ogni sonda è stata rappresentata da un singolo punto nel diagramma a dispersione. Questi risultati hanno mostrato la consistenza nei nostri esperimenti di array duplicato esone
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Figura S2.
ANXA4 partecipa nella riparazione della membrana plasmatica con l'assunzione di membrana esocitotico. Rappresentante di citometria di flusso analisi hanno dimostrato la presenza di LAMPADA2 in H. pylori
cellule -infected. (A), le cellule ANXA4-overexpressing sono stati confrontati con (B) ANXA4
-silenced cellule. I risultati indicano che ANXA4 promuove l'espressione LAMPADA2 sulla superficie H. pylori
cellule -infected. ANXA4 sovraespressione, Over-ANXA4; Controllo siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Figura S3.
ANXA4 induce a valle trasduzione del segnale. Un test qRT-PCR di ANXA4-overexpressing cellule AGS (scatole nere) è stato eseguito per confermare i dati ottenuti da matrici esone (caselle grigie). I livelli relativi di mRNA di CDK1
e PBK
sono stati misurati e normalizzati per GAPDH
livelli di mRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
Figura S4.
intracellulare Ca 2 + elevazione, ANXA4 e LAMP2 localizzazione su H. pylori
infezione. (A) H. pylori
cellule AGS -infected sono stati caricati con Fluo-3 /AM per monitorare i livelli intracellulari Ca 2 + mediante citometria di flusso. (B) la localizzazione dinamica del ANXA4 nella cellula vivente. immagini di fluorescenza in tempo reale che mostra la localizzazione di EGFP-ANXA4 in H. pylori
AGS -infected e le cellule SC-M1 (freccia gialla) colorati con Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescenza sulla superficie del H.

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