PLoS ONE: Aufdecken des molekularen Mechanismus der Magenkrebs Marker Annexin A4 in Proliferation Cancer Cell Mit Exon Arrays

Abstrakt

Magenkrebs ist eine bösartige Erkrankung, die aus dem Magen-Epithel entsteht. Ein potentieller Biomarker für Magenkrebs ist das Protein Annexin A4 (ANXA4), ein intrazellulärer Ca ^{2 + Sensor. ANXA4 wird hauptsächlich in den Epithelzellen gefunden, und ist bekannt, in verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Apoptose, Zellzyklus und Antikoagulation. In Bezug auf Krebs, wurde in Krebserkrankungen unterschiedlicher Genese, einschließlich Magentumoren assoziiert mit Helicobacter pylori Infektion
ANXA4-Überexpression beobachtet. H. pylori
ANXA4 Expression und intrazellulären [Ca 2 +] _{induziert Elevations i, und ist ein wichtiger Risikofaktor für die Karzinogenese, die bei Magenkrebs führt. Trotz dieser Korrelation, bleibt die Rolle der ANXA4 in der Progression von Tumoren des Magens unklar. In dieser Studie haben wir untersucht, ob ANXA4 die Rate des Zellwachstums vermitteln kann und ob ANXA4 Downstream-Signale in Tumorigenese beteiligt sind. die Rate des Zellwachstums in Echtzeit nach der Feststellung haben wir festgestellt, dass ANXA4 Zellproliferation fördert. Die Transkription Gen-Profil von ANXA4-überexprimierenden Zellen wurde durch menschliche Exon Arrays gemessen und analysiert. Aus dieser transcriptional gene Daten zeigen wir, dass die Überexpression von ANXA4 Gene reguliert, die im Zusammenhang mit Krebs sind bekannt, beispielsweise die Aktivierung von Hyaluronan vermittelte Motilität receptor (RHAMM), AKT, und Cyclin-abhängige Kinase 1 (CDK1) sowie die Unterdrückung von p21. Die Regulation dieser Gene induziert weitere Krebszellproliferation. Wir fanden auch, Ca 2 + könnte die Übertragung von Downstream-Signale durch ANXA4 regulieren. Wir schlagen vor, dass ANXA4 eine Signalkaskade auslöst, was zu einer erhöhten epithelialen Zellproliferation, letztlich die Förderung der Karzinogenese. Diese Ergebnisse könnten daher einen neuen Einblick für Magenkrebs-Therapie bieten, insbesondere durch die Änderung der ANXA4 Aktivität}}

Citation:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Aufdecken des molekularen Mechanismus der Magenkrebs Marker Annexin A4 in Cancer Cell Proliferation mit Exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

Herausgeber: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

Empfangen: 6. Juni 2012; Akzeptiert: 6. August 2012; Veröffentlicht: 7. September 2012

Copyright: © Lin et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von der National Science Council von Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3) unterstützt wurde, der National Taiwan University Cutting-Edge Steering Research Project (10R70602C3) und der National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen weltweit und zeigt eine hohe Prävalenz in der asiatischen Bevölkerung. Obwohl die Häufigkeit von Magenkrebs ist rückläufig, die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate niedrig bleibt [1]. Die Bestimmung der effizientesten Magenkrebstherapien und Frühphasen-Diagnose-Tools zu entwickeln sind wichtige Strategien in der klinischen Ergebnisse zu beeinflussen. Die umfassende Untersuchung der molekularen Mechanismen, die Magen-Krebsentstehung zu Grunde liegen könnte Unterstützung bei der Entwicklung von nützlichen therapeutischen Strategien für diese Krankheit.

Helicobacter pylori
ist ein Magen-Erreger und ist die vorherrschende ursächliche Faktor für Magen-Krebsentstehung . Etwa die Hälfte der Weltbevölkerung ist mit H infiziert. pylori
, und mehr als 60% der Patienten mit Magenkrebs haben eine Geschichte von H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass H. pylori
kann sowohl die Proliferation von Magenkrebszellen und Schleimhautentzündungsreaktionen induzieren [5], [6]. Somit wird, um die molekularen Mechanismen, die Magen-Krebsentstehung zu untersuchen, ist es notwendig, die Rolle und die Mechanismen von H zu untersuchen. pylori
im Magen-Karzinogenese.

Annexine sind in den meisten Organismen, einschließlich der Tiere, Pflanzen, Pilze und Protozoen ubiquitär exprimiert. Es ist mit einer Vielzahl von physiologischen Funktionen assoziiert [7]. Basierend auf der Struktur ihrer konservierten Kerndomäne sind Annexine als intrazelluläres Ca ^{2+ Sensoren und Phospholipid-bindende Proteine ​​sein. Sie haben beobachtet, Membrantransport und Vesikelaggregation in Reaktion auf einen erhöhten intrazellulären [Ca 2 +] _{i [8], [9] zu stimulieren. Beim Menschen wurden Annexine beobachtet eine Reihe von zellulären Funktionen zu haben, die in Organisation des Zytoskeletts, Exocytose, Endocytose, Ionenkanalregulierung, Entzündung, Apoptose, Fibrinolyse und Koagulation impliziert worden [8]. Annexine sind auch beteiligt, bei Krebs, Diabetes und Entzündungen [10] betrachtet. In jüngster Zeit entstanden immer mehr Studien, dass die Beteiligung von Annexine in der Karzinogenese, sowie die Förderung der Proliferation [11], [12], Invasion [13] und die Metastasierung [14], [15] verwickeln. Allerdings hat sich die Beziehung zwischen allen Mitgliedern der Annexine Familie mit Krebs nicht charakterisiert.}}

Annexin A4 (ANXA4) ist ein Mitglied der Familie Annexine mit dem Verdauungssystem verbunden. Es ist prominent in Epithelzellen exprimiert [16]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass ANXA4 wird als ein potentielles Magen biomarker auf seine Identifizierung in Geweben von Patienten mit Magenkrebs in proteomische Untersuchungen basieren. Hochregulation von ANXA4 ist speziell in H gefunden. pylori
infizierten Tumorgewebe [17], [18]. Darüber hinaus viele Studien haben einen Zusammenhang zwischen ANXA4 Ausdruck und Krebs berichtet. Diese Beziehung wurde in Adenokarzinom des Pankreas [19], klarzelligen Karzinoms von Ovar [20], [21], Nierenkarzinom [22], kolorektales Karzinom [23] und Prostatakrebs [24] berichtet. In Nierenzellkarzinom, Hochregulierung von ANXA4 wird in die Verbreitung von Tumorzellen beteiligt sind, Zellmigration zu fördern [22]. Bei Patienten mit Darmkrebs, hohe Expression von ANXA4 wurde mit einer geringen Überlebensrate verbunden und wurde als potenzieller Biomarker für die Tumordiagnostik berichtet [23]. Soweit die Zellfunktion, ANXA4 könnte Calcium-Signalisierung, Antikoagulation und Resistenz gegen Apoptose [25], [26] zu induzieren. Diese Ereignisse zeigen an, dass eine ANXA4 tumorigenen Funktion hat durch die Zellwachstumsrate zu regulieren.

In dieser Studie haben wir bestimmt, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den ANXA4 Karzinogenese induziert. Um dies zu erreichen, überwacht man die Wachstumsrate von Magenkrebszellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus von ANXA4. Wir untersuchten auch die Transkriptionsexpressionsprofil von ANXA4-überexprimierenden Zellen und verwendete Exon Arrays die nachgeschalteten Signal von ANXA4 zu analysieren. Aus diesen Untersuchungen haben wir festgestellt 9 krebsbezogenen Genen aus ANXA4 Downstream-Signale durch die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Datenbank. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass ANXA4 die Aktivierung von RHAMM, AKT, CDK1 und die Unterdrückung von p21 reguliert und somit eine ANXA4 regulierte Zellproliferation Weg vorgeschlagen.

Ergebnisse

Die Aktivierung von ANXA4 Fördert Zellproliferation

Wir haben bereits berichtet, dass ANXA4 in überexprimiert H. pylori
infizierten Magentumorgewebe [17]. Um die Beziehung zwischen ANXA4 und Karzinogenese zu untersuchen, war es unser Ziel, um zu bestimmen, ob ANXA4 fördert die Zellproliferation. Die Zellen wurden entweder mit voller Länge transfiziert ANXA4
cDNA ANXA4 Expression oder spezifische siRNA erhöhen soll ANXA4 Ausdruck zum Schweigen zu bringen. Nach der Transfektion überwacht wir Magenkrebszellen AGS unter Verwendung eines Echtzeit-Zellanalyse (RTCA) -Systems die Wachstumsrate. Zellzahlen wurden als Zellindex (CI) Wert aufgezeichnet. Die Wachstumskurven von AGS-Zellen wurden nach der Transfektion geändert. Die Überexpression von ANXA4 erhöhte signifikant die Zellwachstumsrate in AGS-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen ( P
< 0,001; 1A), während ANXA4 Zuschlags signifikant die Wachstumsrate verringert ( P
< 0,001; 1B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ANXA4 das Potenzial hat, die Zellproliferation zu fördern.

ANXA4 erhöht die Expression der Membranproteine, RHAMM und LAMP2

Wir untersuchten auch den Unterschied in der Genexpression zwischen ANXA4-überexprimierenden Zellen und Kontrollzellen einen leeren Vektor exprimieren. Wir untersuchten diese unter Verwendung von Exon-Array-Analyse, die unter Verwendung von vier Sonden pro Exon eine genauere Ansicht der Gen-Expression bietet, im Vergleich zu den herkömmlichen 3 'Anordnungen [27]. In S1, die X
-Achse des Streudiagramm zeigt die Intensitäten der Sonde Ausdruck in einem Experiment gemessen und die Y-
Achse zeigt die Intensitäten der Sonde Ausdruck in dem anderen Experiment gemessen . Diese Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen den Ergebnissen der beiden Experimenten und zeigen daher eine Konsistenz zwischen unseren doppelten Mikroarrays. Die Genexpressionsniveaus wurden aus den Intensitäten über Sondensätze gemessen berechnet. Insgesamt wurden die Expression von 1052 Genen signifikant unterschiedlich ( P
< 0,05) zu sein. Zwischen ANXA4-überexprimierenden Zellen und Kontrollzellen

ANXA4 ist eine Plasmamembran-Protein binden, so dass wir schlagen vor, dass andere Plasmamembranproteine ​​könnten durch ANXA4 reguliert werden und zusammenarbeiten, ihre nachgeschalteten Signal zu transduzieren. Um die Signalübertragung durch ANXA4 geregelt erforschen, untersuchten wir Plasmamembranproteinen von Exon Array-Analyse. Siebenundvierzig Plasmamembranproteine ​​beobachtet eine ≥1.5-fache Veränderung der ANXA4-überexprimierenden Zellen (Tabelle S1) zu haben. Unter diesen Hyaluron-vermittelte Motilität Rezeptor ( HMMR
) zeigte die größte Steigerung der Expression (2,4-fach; Tabelle S1). Darüber hinaus zeigten unsere früheren Studie, dass die Zelloberflächenexpression von lysosomalen-assoziiertes Membranprotein 2 ( LAMP2
), einem lysosomalen Marker, hochreguliert durch ANXA4 ist und in Exozytose (Abbildung S2 und Datei S1) einbezogen . Hier Transkriptions Ausdruck des LAMP2
zeigte auch eine Erhöhung der Expression (1,8-fach; Tabelle S1), wenn sie von Exon-Array-Analyse gemessen. In dieser Studie wurde ANXA4 überexprimiert wird, oder zum Schweigen gebracht (2A) und dann analysiert durch Immunoblotting die Proteinexpression von RHAMM und LAMP2 zu überprüfen. ANXA4 Überexpression die Expression von RHAMM (2B) und LAMP2 (2C) und im Einklang damit stieg, sank der Zuschlag von ANXA4 Ausdruck ihre Expressionsniveaus (2B und 2C).

ANXA4 Überexpression Reguliert Krebs -related Gene Expression

Wir haben das Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Datenbank verwendet, um eine Genfunktion Analyse der Exon-Array-Daten durchzuführen und festgestellt, dass 25 der 42 Gene, die für Netzwerkfunktionsanalyse geeignet waren (≥2-fach Differentialausdruck, t
Test, P
< 0,05) (Tabelle 1). Drei funktionale Netzwerke waren signifikant mit ANXA4-regulierten Genen assoziiert. Die am stärksten zugehörige Netzwerk war Krebs, Zellzyklus und das Fortpflanzungssystem Krankheit
( P
< 0,05; 3A) und die Top-Rankings von Krankheiten oder Störungen wurde Krebs
( P
< 0,05; 3B). Es gab neun Gene als Krebs-verwandte Gene in ANXA4-überexprimierenden Zellen einschließlich 7 Gene klassifiziert, die in unseren Experimenten hochreguliert wurden. Diese Gene sind eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E ( EIF4E
), Succinat-Dehydrogenase-Komplexes, Untereinheit C, integrales Membranprotein, 15 kDa ( SDHC
), Cyclin-abhängige Kinase 1 ( CDK1
), gelöscht in lymphatischer Leukämie 2 ( dLEU2
), Chromatin-modifizierende Protein 5 ( CHMP5
), zEITLOS interacting protein ( TIPIN
), PDZ Bindung Kinase ( PBK
). Chorion somatomammotropin Hormon 1 (Placentalactogen) ( CSH1
) und Interferon alpha 2 ( IFNA2
) wurden herunterreguliert durch ANXA4. Basierend auf unseren Ergebnissen, schlagen wir vor, dass ANXA4 eine Funktion bei der Induktion der Zellproliferation hat. Außerdem CDK1
und PBK
(3B und Tabelle 1) wurden als in der ANXA4 Proliferation induzierende Modell einbezogen werden. Da CDK1 Aktivierung wird bei der Entwicklung von Magen MALT Lymphom mit der Zellproliferation assoziiert [28]. Die wechselseitige Aktivierung von CDK1 und PBK wurde zuvor berichtet [29]. In dieser Studie wurde die Hochregulation von CDK1
und PBK
beobachtet ANXA4-überexprimierenden Zellen validiert wurde durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse (Abbildung S3) Regelt die Aktivierung von AKT, CDK1 und der Unterdrückung.

ANXA4 von p21

CDK1-Aktivierung, die durch p21 reguliert wird, hemmt G2 /M-Phase Arrest, damit die Förderung der Mitose und Zellproliferation [30 ]. Es hat sich auch, dass AKT blockiert die Aktivierung von p21, wodurch die Ansammlung des Gases im Cytoplasma und damit die Förderung der Zellproliferation [31] berichtet. Verwendung Immunoblot-Analyse beobachteten wir, dass die Überexpression von ANXA4 die Phosphorylierung von Serin 473 und Threonin an AKT 161 auf CDK1 erhöht und verringert, die Expression von p21 (4A). Zusätzlich dazu verringerte sich die Zuschlags von ANXA4 Expression phospho-AKT und phospho-CDK1 und erhöht die Expression von p21 (4B). Diese Daten legen nahe, dass Phospho-AKT, Phospho-CDK1 und p21 durch ANXA4 geregelt sind und Downstream-Signale von ANXA4.

Ca 2 + Vermittelt ANXA4 nachgeschalteten Signal Transduction

In der Karzinogenese, Ca ^{2+ beteiligt ist bei der Verursachung der Signaltransduktion eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich Invasion, Proliferation, Angiogenese und Metastasierung [32] zu vermitteln. Es wurde berichtet, dass Annexine können einige physiologische Mechanismen in einem Ca vermitteln 2 + -abhängigen Weise [9]. In früheren Studien intrazellulären [Ca 2 +] _{i Erhebung wurde von H induziert. pylori
Infektion, die sich wiederum hochreguliert ANXA4 Ausdruck [17], [33]. Um festzustellen, ob eine Erhöhung der intrazellulären [Ca 2 +] i die Übertragung von Downstream-Signale von ANXA4 vermittelt wurden AGS Zellen mit Ionomycin behandelt. Ionomycin ist ein Ca 2+ Ionophor und wurde in unserem AGS Zellmodell zu dem Kulturmedium gegeben, um eine anhaltende Erhöhung von intrazellulärem [Ca 2 +] i [34] zu induzieren. Die Proteinexpression von ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, phospho-AKT und phospho-CDK1 wurden durch Immunoblot-Analyse (5A) gemessen. Ähnlich wie unsere Beobachtungen mit ANXA4 Überexpression erhöhte [Ca 2 +] i-Spiegel signifikant hochreguliert die Expression von RHAMM ( P
< 0,01) und Phospho-AKT (Ser 473) ( P
< 0,05) und deutlich nach unten reguliert die Expression von p21 ( P
< 0,01) (5B). CDK1 Aktivierung leicht um erhöht wurde [Ca 2 +] i Erhebung. Allerdings erhöhte [Ca 2 +] i Ebenen hatte keinen Einfluss auf die Expression von ANXA4 und LAMP2. In unserer früheren Studie kann ANXA4 und LAMP2 zu Plasmamembran nach H lokalisieren. pylori
Infektion mit intrazellulären [Ca 2 +] i Erhebung (Abbildung S4 und Datei-S1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ca 2 + ändert sich nur intrazelluläre Lokalisation von ANXA4 und LAMP2, aber nicht reguliert ihren Ausdruck.}}

Diskussion

In der Krebsforschung, die Identifizierung von Biomarkern und die anschließende Klärung ihrer mechanistischen Beziehungen tumorigenesis kann zur Entwicklung von nützlichen diagnostischen Werkzeuge und führen zu optimalen therapeutischen Strategien beitragen. Vor kurzem haben sich mehr und mehr Studien gezeigt, dass die Biomarker Kandidatenproteine ​​in der Annexine Familie in der Progression von verschiedenen Krebsarten potentiell instrumental sind; z.B. ANXA1 für klarzelligen Nierenkrebs, ANXA2 für Magenkrebs und Darmkrebs, ANXA4 für Darmkrebs, ANXA8 für Brustkrebs, ANXA10 für hepatozellulären Krebs, ANXA11 für Eierstockkrebs und Darmkrebs [35]. ANXA4, ein Mitglied der Familie Annexine, ist beobachtet worden, in Magentumorgewebe überexprimiert werden, und ist auch mit der Magenkrebs-bezogenen H verbunden. pylori
Infektion [17]. Darüber hinaus hat eine andere Annexine Familienmitglied, ANXA2, auch beobachtet worden, bei Magenkrebs werden überexprimiert und wird zu einer schlechten klinischen Ergebnis im Zusammenhang, es ist ein Potenzial Prognosefaktor zu machen [36]. Zusammengenommen legen diese Befunde legen nahe, die Beteiligung von ANXA4 in tumorigenesis; jedoch bleibt seine genaue Mechanismus im Prozess unklar. Um die zelluläre Funktion von ANXA4 in der Progression von Magenkrebs weiter zu bewerten, erkundeten wir die Verbindung zwischen den beiden und zeigten in der Folge, dass ANXA4 kann Krebs im Zusammenhang mit Genen und propagieren den Weg zur Zellproliferation regulieren.

In der vorliegenden Studie fanden wir, dass die Karzinogenese-assoziierte Proteine ​​wie RHAMM, AKT, p21, PBK und CDK1 durch die Überexpression von ANXA4 reguliert werden. Eine schematische Darstellung ANXA4 induzierten Downstream-Signale auf die Zellproliferation im Zusammenhang ist in Abbildung 6 gezeigt HMMR
(RHAMM) ein Onkogen, das in mehreren Krebsarten überexprimiert wird, Magenkrebs einschließlich, und hat in vielen zellulären verwickelt Verfahren, wie Zellsignalisierung, Zellproliferation und tumorigenesis [37], [38].

Es wurde berichtet, dass RHAMM die RAS-Signalkaskade und aktiviert AKT [39] induziert. Die RAS-Signalkaskade transduziert Downstream-Signale durch die Aktivierung Phospho-AKT durch Phosphoinositid 3-Kinasen. Diese Aktivierung von AKT auch als Marker für Magenkrebsprogression [40] berichtet. Wir haben bereits berichtet, dass H. pylori
Infektion mit ANXA4 Überexpression assoziiert [17]. H. pylori
kann das Cytotoxin assoziierten Gens A (CagA) in Wirtszellen zu liefern, in AKT-Aktivierung führt, und somit die Zellproliferation zu fördern [41]. In Bezug auf das Überleben von Zellen, unterdrückt AKT die Apoptose durch die Stimulierung von NF-kappaB [42]. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass ANXA4 interagiert mit p105 (NF &kgr; B p50-Vorläuferprotein), und unterdrückt die Transkriptionsaktivität von NF &kgr; B eine anti-apoptotische Wirkung [25] zu induzieren. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen zeigen, dass ANXA4 spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Überleben und das Zellwachstum.

CDK1-Cyclin B1-Komplexe regulieren den Zellzyklus G2 /M Phase und auch in der Förderung tumorigenesis [43] in Verbindung gebracht. Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass eine erhöhte Expression von CDK1 mit dem Fortschreiten von H zugeordnet ist. pylori -assoziierten
Gastritis Lymphgewebe-Lymphom mucosa-associated [28]. In dieser Studie war CDK1 Aktivierung hochreguliert durch ANXA4. Diese Ereignisse deuten darauf hin, dass ANXA4 das nachgeschaltete Signalweges vermitteln könnte, was zu tumorigenesis in Magenkrebs-Patienten mit einem H. pylori
Infektion.

Zusätzlich zu seiner Beteiligung an der Progression von Krebs, hat ANXA4 auch erworben Chemoresistenz in Verbindung gebracht worden Medikamente gegen Krebs [44], [45], [46]. In einer Paclitaxel-resistenten Zelllinie (H460 /T800) wird ANXA4 Expression erhöht und im Zellkern lokalisiert [44]. In klarzelligen Ovarialkarzinom und Mesotheliomzellen wird ANXA4 Ausdruck erhöht und mit einer Resistenz gegen die Behandlung mit Carboplatin verbunden sind, und wird als Biomarker für die Anfälligkeit gegenüber Cisplatin zu sein [45], [46]. Außerdem ist ANXA4 ein intrazelluläres Ca ^{2+ Sensor und Ca 2+ eine wichtige Rolle bei der Neurotoxizität und Herzversagen spielt [47], [48]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die erhöhte Menge an ANXA4 ist nicht nur im Zusammenhang mit Krebs, sondern auch die Alzheimer-Krankheit, Herzversagen und Zell Läsion durch Ethanol verursacht [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ Messenger-System ist auch für die Zellproliferation Prozess erforderlich und kann Zellzyklus [52], [53] regeln. Es wurde berichtet, dass Ca 2 + kann AKT Signalweg aktivieren das Überleben der Zellen [54] zu fördern. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Expression von RHAMM, phospho-AKT und die Unterdrückung von p21 deutlich erhöht wurden von [Ca 2 +] _{i Erhebung (Abbildung 5). H. pylori
Infektion mit ANXA4 Überexpression und intrazellulären [Ca 2 +] assoziiert i Erhebung (Abbildung S4 und Datei-S1) [17], [33]. Diese Ergebnisse zeigen, dass H. pylori
Infektion könnte einige nachgeschalteten Signal von ANXA4 induzieren durch intrazelluläre Stimulierung [Ca 2 +] i Erhebung. Dennoch ist die Detail-Mechanismus in dem Prozess kann sehr komplex sein und bleibt unklar. Diese könnten Aufklärung von Magen tumorigenesis Prozess liefern zugrunde liegenden H. pylori
Stimulation. Insgesamt deutet dies Anzeichen dafür, dass Ca 2+ könnte ANXA4 Signalisierung zu transduzieren unterstützen und fördern tumorigenesis bei Magen Patienten mit H. pylori
Infektion.}}

Abschließend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Silencing ANXA4 Epithelzellproliferation abnimmt, während die Überexpression Proliferation erhöht. Darüber hinaus induziert ANXA4 Downstream-Signale, die das Zellwachstum fördern. Wir vermuten, dass diese Downstream-Signale und Aktivierung von Wirts Zellteilung pathogene Ereignisse sein kann in H. pylori
-induzierten Karzinogenese. In der gegenwärtigen klinischen Therapie, AKT, p21 und CDK1 wurden als Anti-Krebs-Wirkstoff-Target verwendet. AKT-Inhibitor, Perifosine, ist ein oral einzunehmendes Mittel gegen Krebs und hat Anti-Proliferationsaktivität in verschiedenen Tumormodellen [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) und Vincristin kann induzieren und p21-Expression erhöhen G2 /M Arrest und blockieren die Zellproliferation [58], [59], [60], [61] zu verringern. Flavopiridol ist ein Inhibitor von mehreren CDKs einschließlich CDK1 Apoptose und Anti-Angiogenese zu induzieren [62]. Diese Studien zeigen, daß die Erhöhung der ANXA4 bei Patienten als Medikament Ziel für Magenkrebstherapie betrachtet werden. mehrere Medikamente in Kombination verwenden könnte eine effektivere Behandlung für Signale im Stoffwechselweg blockieren. Zusammengenommen könnten diese Studie neue Einblicke in die Entwicklung von therapeutischen Strategien für Magenkrebs.

Materialien und Methoden

Zelllinien und Kulturbedingungen

Menschlicher Magen-Adenokarzinom AGS-Zellen (CRL-1739, ATCC) wurden in 90% RPMI-1640-Medium gezüchtet (Biological Industries, Beth-Haemek, Israel), das mit 1% Penicillin /Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (Biological Industries, Beth-Haemek, Israel) ergänzt wurde . Die Zellen wurden bei 37 ° C in einer kontrollierten befeuchteten Atmosphäre in einem Inkubator mit 5% CO kultiviert _2.

Plasmide und Transfektionen

in voller Länge ANXA4
WAS durch PCR das Primerpaar mit ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') und ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3') und das Amplifikationsprodukt wurde in die HindIII eingeführt /EcoRI-Stellen von pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
-spezifische siRNA und negative Kontrolle Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) erworben. Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen oder auf beschichteten Deckgläser für 24 h. Zellen wurden dann mit pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 &mgr; g für einen Sechs-Well-Platte; 0,4 &mgr; g /ml für eine 96-Well-Platte E) transient transfiziert oder ANXA4
siRNA (100 pmol für eine sechs-Well-Platte; 10 pmol für eine 96-well-plate E) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Effizienz der Expressionsvektor und siRNA-Transfektion wurde durch Immunoblot analysiert. Nach der Transfektion für 48 h wurde die differentielle Expression von Proteinen und Genen nachgewiesen

Antibodies

Die monoklonalen Maus in dieser Untersuchung verwendeten Antikörper waren wie folgt:. CDK1 p34 (SC-51578) von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) und RHAMM (ab67003) von Abcam (Cambridge, UK); und α-Tubulin (T5168) von Sigma (Dorset, UK). Das Kaninchen polyklonalen Antikörper waren wie folgt: ANXA4 (sc-28827), p21 (sc-397) und pCDK1 p34 (Thr 161; sc-101654) von Santa Cruz Biotechnology; und AKT (9272) und PAKT (Ser473; 9271S). von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)

Immunoblotting

Die Zelllysate wurden von AGS-Zellen hergestellt, die transient mit dem transfiziert Expressionsvektoren pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug) oder ANXA4
siRNA (100 pmol). Um die Unterschiede in der Proteinexpression unter Bedingungen hoher intrazellulärer bestimmen [Ca ^{2 +] _{i, Ionomycin (5 uM) wurde 1 h zu den Zellen gegeben. Um die Wirkungen der Hemmung von Akt-Phosphorylierung zu untersuchen, wurden die Zellen für 1,5 h nach einer 48-h-Transfektion ausgehungert und wurden mit 5 uM des AKT-Inhibitor VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) für 1 h behandelt. Proben wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und dann auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen (Millipore, Billerica, MA, USA) überführt. in 5% Magermilch und Tris-Kochsalzlösung (TBS), die 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 1 h bei RT unter leichtem Schütteln, werden die folgenden primären Antikörper angewendet wurden Nach dem Blockieren: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), Anti-AKT (1:500), anti-pAkt (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500) und Anti-RHAMM-Antikörpers (1:400). Membranen wurden mit sekundärem Ziegen-anti-Maus-IgG konjugierte Antikörper (Sigma) oder Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, konjugiert (Rockland, Gilberts, PA) verbunden sind, inkubiert. alpha-Tubulin-Antikörper (1:4000) wurde als interne Kontrolle verwendet. Immunoblots wurden mit verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Nachweis-Kit (Millipore) und visualisiert auf Röntgenfilmen entwickelt. Die Intensität der beobachteten Banden wurde zu der Intensität des α-Tubulin-Band normalisiert. Densitometrische Analyse wurde Kodak unter Verwendung von 1-D-Bildanalyse-Software Version 3.6 (Eastman Kodak, London, UK).}}

Exon Array Hybridisierung und Analyse

die nachgeschalteten Gene von ANXA4 zu untersuchen, verglichen wir die Genexpressionsprofile zwischen den mit pcDNA3.1 transfizierten Zellen (+) / ANXA4
und mit einem leeren Vektor transfizierten Kontrollzellen ein Exon Arrays verwenden. Zelluläre Gesamt-RNA wurde extrahiert unter Verwendung von Trizol ® Reagent (Invitrogen) und RNA Reinheit wurde durch Spektrophotometrie (A260 /A280-Verhältnis) sowie durch Kapillarelektrophorese (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) bestätigt. RNA-Prozessierung und Hybridisierung wurden unter Verwendung der Affymetrix menschlichen Exon 1.0 ST-Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) gemß dem Protokoll des Herstellers. Jedes Array hat 28.869 gut kommentierte Gene mit 764.885 verschiedenen Sonden. Das Array enthält etwa 26 Sonden für jedes Gen. Affymetrix Sonde setzt Informationen werden auf NetAffx Website angezeigt (http://www.affymetrix.com) [63]. Microarray-Analyse (n = 2 pro Gruppe) wurde durchgeführt unter Verwendung der Partek Genomics Suite Version 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Die Rohdaten (CEL-Dateien) wurden unter Verwendung der robusten Multi-Chip-Mittelung (RMA) Algorithmus normalisiert und analysiert unter Verwendung von t
Tests. Analyse der Funktion und biologischen Mechanismus der differentiell exprimierten Gene wurde unter Verwendung der Erfindungsgabe Pathway Analysis (IPA) Software Version 7.5 durchgeführt; eine Punktzahl von 3 oder höher wurde als statistisch signifikant betrachtet ( P
< 0,01), um die Informationen zu annotieren. Wir haben die Array-Daten an die GEO-Datenbank übermittelt, und die Serie Rekordzahl ist GSE33620.

Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)

Die Daten Exon Arrays unter Verwendung Partek Software und die IPA-Datenbank wurde durch qRT-PCR bestätigt. RNA wurde aus AGS-Zellen unter Verwendung von Trizol® Reagenz (Invitrogen) und dem RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert nach den Anweisungen des Herstellers. Erststrang-cDNA wurde aus Gesamt-mRNA synthetisiert, um eine reverse Transkription-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primer (Tabelle S2) wurden unter Verwendung entworfen DNAStar Software (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) und PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Die Genexpression wurde unter Verwendung eines Bio-Rad iQ5 real-time PCR-Detektionssystem gemessen mit einem SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), und war normiert auf GAPDH-Expression.

Cell Proliferation Assay

AGS-Zellen wurden in jede Vertiefung einer 16-Well-Mikrotiter-E-Platte geladen. Jede Vertiefung enthielt Mikroelektronik-Sensorarrays an der Basis der Zellenindex (CI) zu erkennen. Für Transfektionsexperimente nach Inkubation für 24 h wurden AGS-Zellen für 6 h mit Expressionsvektoren oder siRNAs transfiziert und für insgesamt 84 h überwacht. Die E-Platte wurde in der Echtzeit-Zell Analyzer (RTCA) -System und inkubiert in einem Inkubator mit 5% CO _{2 bei 37 ° C gestellt. Das Niveau der Zellproliferation wurde wie CI dargestellt wird, die auf der elektrischen Impedanz basiert wurde unter Verwendung des Systems gemessen xCELLigence (Roche, Mannheim, Deutschland).}

Statistical Analysis

Daten als Mittelwert ± exprimiert wurden Standardabweichung (SD). Der Unterschied zwischen unabhängigen Gruppen wurde mit einem Zwei-tailed Student analysiert t
Test. Daten aus dem Zellproliferations-Assay erhalten wurden unter Verwendung des Test zwei Stichproben Kolmogorov-Smirnov analysiert. A P
Wert von weniger als 0,05 statistische Signifikanz angezeigt.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Streudiagramm der Sondenintensitäten in den wiederholten Exon Array-Experimente. Die Sondenintensitäten von zwei wiederholten Versuche wurden getrennt auf eine präsentierte X
-Achse und Y-Achse. Jede Sonde wurde von einem einzigen Punkt in der Streudiagramm dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten, die Konsistenz in unserem doppelten Exon Array Experimente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Abbildung S2.
ANXA4 nimmt an Reparatur Plasmamembran von exozytotische Membran rekrutieren. Repräsentative Durchflusszytometrie-Analysen das Vorhandensein von LAMP2 in H demonstriert. pylori
infiziertem Zellen. (A) ANXA4-überexprimierenden Zellen wurden mit (B) im Vergleich ANXA4
-silenced Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass ANXA4 LAMP2 Expression auf der Oberfläche von H fördert. pylori
infiziertem Zellen. ANXA4 Überexpression, Über ANXA4; Kontrolle siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Abbildung S3.
ANXA4 induziert Downstream-Signaltransduktion. Ein qRT-PCR-Test von ANXA4-überexprimierenden AGS-Zellen (schwarze Kästchen) wurde durchgeführt, um die Daten aus dem Exon Arrays (graue Kästen) bestätigen zu können. Die relativen mRNA-Spiegel von CDK1
und PBK
wurden gemessen und normalisiert auf GAPDH
mRNA-Spiegel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
Abbildung S4.
intrazellulärer Ca 2 + Erhebung, ANXA4 und LAMP2 Lokalisierung auf H. pylori
Infektion. (A) H. pylori
infiziertem AGS-Zellen wurden mit Fluo-3 /AM beladen mittels Durchflusszytometrie intrazellulären Ca 2 + Ebenen zu überwachen. (B) Dynamische Lokalisierung von ANXA4 in der lebenden Zelle. Echtzeit-Bilder Fluoreszenz zeigt Lokalisation von EGFP-ANXA4 in H. pylori
infiziertem AGS und SC-M1-Zellen (gelber Pfeil), gefärbt mit Hoechst 33258. (C) LAMP2 Fluoreszenz auf der Oberfläche von H.

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