PLoS ONE: Nicotine Remt cisplatine-geïnduceerde apoptose via Reguleren α5-nAChR /AKT Signalering in Human MaagKanker Cells

Abstract

Maagkanker incidentie toont een sterke etiologische associatie met roken. Nicotine, de belangrijkste component in tabak, is een survival agonist die apoptose geïnduceerd door bepaalde chemotherapeutische middelen remt, maar de precieze mechanismen blijven grotendeels onbekend. Recent studies hebben aangetoond dat α5-nicotine acetylcholine receptor (α5-nAChR) sterk wordt geassocieerd met het risico op longkanker en nicotine afhankelijkheid. Toch is geen informatie beschikbaar over de vraag of nicotine heeft ook invloed op de proliferatie van menselijke maagkanker cellen door regulatie van α5-nAChR geweest. Om de hypothese dat α5-nAChR een rol kunnen spelen maagkanker evalueren onderzochten we de expressie ervan in maagkanker weefsels en cellijnen. De expressie van α5-nAChR verhoogd maagkanker weefsel tegen para-carcinoom weefsels. Gezien de resultaten, gingen we onderzoeken of nicotine remt cisplatine geïnduceerde apoptose reguleren via α5-nAChR bij maagkanker cel. De resultaten toonden aan dat nicotine aanzienlijk bevorderd celproliferatie op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze met α5-nAChR activatie in humane gastrische cellen. Bovendien nicotine remde apoptose geïnduceerd door cisplatine. Silence of α5-nAChR ablatie de beschermende effecten van nicotine. Echter, als mede-toedienen van LY294002, een remmer van de PI3K /AKT-route, werd een verhoogde apoptose waargenomen. Dit effect gecorreleerd met de inductie van Bcl-2, Bax, survivine en caspase-3 door nicotine in de maag cellijnen. Deze resultaten suggereren dat blootstelling aan nicotine koste zou gaan van de apoptotische potentie van chemotherapeutische geneesmiddelen en α5-nAChR /AKT signalering speelt een belangrijke rol in de anti-apoptotische activiteit van nicotine geïnduceerd door cisplatine

Citation:. Jia Y Het Sun H, H Wu, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) Nicotine Remt cisplatine-geïnduceerde apoptose via Reguleren α5-nAChR /AKT Signalering in Human Gastric kankercellen. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10.1371 /journal.pone.0149120

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Verenigde Staten

Ontvangen: 1 juni 2015; Aanvaard: 15 januari 2016; Gepubliceerd: 24 februari 2016

Copyright: © 2016 Jia et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. Wegens beperkingen opgelegd door Jinan Central Hospital, data zijn beschikbaar op aanvraag. Geïnteresseerde onderzoekers kunnen contact opnemen met dr Xiaoli Ma ([email protected]) om toegang tot de gegevens te vragen

Financiering:. Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81272588) en Shandong Provinciale Natuurwetenschappen Foundation of China (nr ZR2012HM061and ZR2013CM010)

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken. kanker sterfgevallen in de wereld. Blijkbaar zijn zowel genetische en omgevingsfactoren die betrokken zijn bij de maag carcinogenese. Eerdere bevindingen hebben de sterke associatie tussen sigarettenrook en maagkanker incidentie [1-3] ontrafeld echter de bijzonderheden van het mechanisme niet volledig onderzocht.

Nicotine, een belangrijke component van sigarettenrook, is aangetoond betrokken bij de initiatie, promotie en progressie van zelfs verschillende tumoren waaronder maagkanker. Verschillende lijnen van bewijs suggereren dat nicotine oefent zijn cellulaire functies door middel van nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs). Verschillende epitheelcellen, niet alleen neuron cellen, express nAChRs en de structuur van nAChRs een homo- (α7or α9) of heteropentamer (α2-α10, b2-b4). Studies hebben aangetoond dat nicotine stimuleerde de proliferatie van menselijke maagkanker cellen via de interactie met α7-nAChR [4, 5]. Terwijl de verschillende leden van nAChR familie kunnen regelen convergerende signaalwegen, ze hebben vaak uiteenlopende en zelfs tegengestelde acties. Onlangs hebben genoomwijde associatiestudies aangegeven dat α5-nAChR sterk wordt geassocieerd met het risico op longkanker en nicotine afhankelijkheid [6, 7]. Toch is geen informatie beschikbaar over de vraag of nicotine heeft ook invloed op de proliferatie van menselijke maagkanker cellen door regulatie van α5-nAChR geweest.

De levering van chemotherapeuticum cisplatine na chirurgische resectie bepaalt momenteel de standaard behandeling van maagkanker [8 -10]. Helaas, verworven resistentie tegen cisplatina is gebruikelijk en ontwijken van celapoptose wordt erkend als een van de belangrijkste mechanismen die cisplatine resistentie [11, 12]. In het bijzonder zou nicotine geïnduceerde apoptose door cisplatine in longkankercellen [13-15] en orale kankers [16] te remmen. Het remmende effect van nicotine op apoptose is toegeschreven aan zijn vermogen om anti-apoptotische eiwitten activeren zoals Bcl-2 en survivine, alsook inactivering van pro-apoptotische eiwitten zoals Bax en caspase-3 door de activatie van zowel PI3K /AKT en PKC /ERK signaalroutes in kankercellen [13-15]. Dit effect van nicotine op apoptose wordt ook gemedieerd door nAChRs, maar naast α5-nAChR, andere subeenheden lijken betrokken te zijn [17, 18].

Hoewel veel van deze mechanismen zijn waargenomen bij longkanker [19-21], is er geen bewijs van het anti-apoptotisch effect en het mechanisme nicotine uitgeoefend op maagkanker cellen. Het doel van deze studie was om te onderzoeken nicotine remt cisplatine geïnduceerde apoptose reguleren via α5-nAChR bij maagkanker cel. Bovendien stellen wij de betrokkenheid van de pro-survival factoren, zoals Bcl-2 en survivine, geactiveerd door AKT paden, respectievelijk.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

de studie protocol werd goedgekeurd door de medisch ethische and Human Clinical Trial Comité van de Jinan Central Hospital. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten.

weefselmonsters, Celkweek en behandeling met geneesmiddelen

Fifty-formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters die 40 specimens van maagkanker en 10 para-carcinoomweefsel werden retrospectief en willekeurig geselecteerd uit de dossiers van de Jinan Central Hospital nadat het protocol door de lokale ethische commissie werd goedgekeurd. Volgens het verslag van het roken (of niet) in de anamnese van de patiënten, 32 gevallen had geen roken intake geschiedenis, 8 had roken inname geschiedenis. Alle monsters werden geëvalueerd voor de diagnose door twee ervaren pathologen voor de diagnose.

De menselijke maagkanker cellijnen MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 en MKN45 werden verkregen uit de Cell Bank of Shanghai, Institute Biochemie en Celbiologie, de Chinese Academie van Wetenschappen. Cellen werden gekweekt in DMEM (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Invitrogen), 1% antibiotica bij 37 ° C in 5% CO2 bevochtigde lucht. In alle experimenten, 60-70% van confluente cellen gewassen en geïncubeerd in serumvrij medium gedurende 24 uur vóór de behandeling met nicotine, cisplatine en LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) gedurende de aangegeven tijd.

Immunohistochemie

immunohistochemische kleuring met het streptavidine peroxidase methode (SP methode) werd uitgevoerd op 4 urn secties van in paraffine ingebedde specimens α5-nAChR expressie te detecteren in maagkanker en para-carcinoom weefsels. Kortom, na deparaffinisatie en hydratatie werden de glaasjes behandeld met endogeen peroxidase in 0,3% H _{2O 2 voor 30 min en geblokkeerd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met 1,5% blokkerende serum in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS ). De coupes werden vervolgens geïncubeerd met anti-α5-nAChR antilichaam (Abcam, Inc. Cambridge, MA) (1: 100 verdunning) bij 4 ° C geïncubeerd, gewassen met PBS en geïncubeerd met secundair anti-muis gebiotinyleerd antilichaam (KIT-5010 Max Vision, Maixin.Bio, China) (1: 2000) in PBS gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De antilichaambinding werd gedetecteerd met de streptavidine-biotine-peroxidase complex /HRP (Code K0377, Dako) met 3, 3- diaminobenzidine gedurende 3 min als chromogeen substraat. De objectglaasjes werden vervolgens licht tegengekleurd met hematoxyline. Als negatieve controle werden duplo secties gekleurd zonder blootstelling aan de primaire antilichamen. De resultaten werden waargenomen onder een microscoop.}

Kwantitatieve Real-time RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van het Trizol reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Vijfentwintig nanogram totaal RNA per monster werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van de reverse transcriptiereactie Kit (Takara Code: DRR061S) volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd geanalyseerd op de Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System om de relatieve hoeveelheden van α5-nAChR en β-actine (interne controle) mRNA expressie te bepalen. De SYBR Green Supermix werd gebruikt voor real-time PCR reacties. PCR-primers die in deze studie zijn als volgt: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) voorwaarts, 5'- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'en reverse 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. De kwantitatieve real-time PCR parameters waren 95 ° C gedurende 10s als een pre-gedenatureerd stap gevolgd door 40 PCR cycli van 95 ° C gedurende 5 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 10 minuten. Alle monsters werden in triplo in elk experiment. De relatieve hoeveelheid mRNA werd berekend volgens de vergelijking CT methode in normaal aan P-actine mRNA.

Western vlekanalyse

De celpellets werden gehomogeniseerd in extractiebuffer (50 mmol /L Tris-HCl , pH 6,8, 0,1% SDS, 150 umol /L NaCl, 100 mg /l fenylmethylsulfonylfluoride, 1 mg /l aprotinine, 1% NP-40 en 0,5% natriumorthovanadaat), geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 30 minuten en gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 12.000 g /min. Totaal eiwit in het cellysaat is gemeten met gebruik van de Bio-Rad colorimetrische kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Voor Western blotanalyse werd totaal eiwit gescheiden op 10% SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), die werden geïncubeerd gedurende 24 uur bij 4 ° C met antilichamen voor α5-nAChR (1: 500, ab41173 of ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), caspase-3 (1: 500, Epitomics Cat no: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivine (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) en GAPDH (1: 1000; ab37168), vervolgens mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis /konijn-IgG-antilichaam (Santa Cruz Biotechnology) na een laatste wasbeurt. Signalen werden gedetecteerd met gebruik van een versterkte chemiluminescentie (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). GAPDH level was een interne standaard

RNA interferentie

Een dubbele streng siRNA oligonucleotide gericht CHRNA5, dat codeert α5-nAChR, (betekenis:. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', antisense: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') gesynthetiseerd door Shanghai Genepharma Co. Ltd. (China). Een paar negatieve controle siRNA werd gemaakt met sequenties verschillend van siRNA-CHRNA5 en niet homoloog met enige sequenties in genenbank (sense: 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', antisens: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). De cellen werden uitgeplaat in platen met zes putjes. Wanneer cellen 30-50% confluentie bereikten, werden de siRNAs toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 50 nM met Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant.

levensvatbaarheid van de cellen Assay

cellevensvatbaarheid was bepaald door de CCK8 assay (DOJINDO, Tokyo, Japan). In het kort cellen uitgeplaat in 96-putjes (1500 cellen /putje) werden behandeld met nicotine bij de aangegeven doses. De celproliferatie assay werd uitgevoerd door de toevoeging van 10 ul CCK8 oplossing in elk putje, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 2 uur. De absorptie werd gemeten bij een golflengte van 450 nm met een microplaat reader (Synergy 2 Meervoudig Microplate Reader, BioTek, Winooski, VT, USA).

Annexine V /7-AAD kleuring

BGC823 cellen werden gekweekt bij confluentie in 6-putjes weefselkweekplaten (Falcon, Becton Dickinson Labware) in een volledig medium. Vervolgens werd het medium vervangen door vers compleet medium of door serumvrij medium; de cellen werden vervolgens gestimuleerd met alleen of in combinatie met 20 mM cisplatine gedurende 24 uur op basis van onze eerdere gegevens 100 uM nicotine, getrypsiniseerd en tweemaal gewassen met PBS. De cellen werden gekleurd met PE gemerkt annexine V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) volgens de instructies van de fabrikant (annexine V /7-AAD kit, Becton, Dickinson and Company). In het kort werd een gewassen celpellet geresuspendeerd in 500 ul bindingsbuffer. Vervolgens werd 5 ui Annexine-V-PE en 5 gl 7-AAD toegevoegd. Flow cytometrische analyse werd onmiddellijk na supravital kleuring. Data acquisitie en analyse werd uitgevoerd op een Becton Dickinson FACS Calibur stromingscytometer behulp CellQuest software. De cellen in de vroege stadia van apoptose AnnexinV waren positief en 7-AAD negatief, terwijl de cellen in de late stadia van apoptose waren beide AnnexinV en 7-AAD positieve.

33.342 Hoechst kleuring

Cellen werden gezaaid in 12-well weefselkweekplaten en behandeld met de aangegeven concentraties van nicotine en cisplatine. Aan het einde van elke incubatie werden cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten, gewassen met PBS en vervolgens geïncubeerd met Hoechst 33342 (1 ug /ml) gedurende 10 min. Na wassen met PBS werden cellen waargenomen met een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Japan). Tenminste 400 cellen van 12 willekeurig gekozen velden per schaal geteld, en elke behandeling werd in drievoud uitgevoerd.

Statistieken analyse

De resultaten van immunohistochemie werd geanalyseerd met de χ ^{2 proef. Alle resultaten werden weergegeven als het gemiddelde ± S.D. van experimenten in drievoud uitgevoerd op een parallelle wijze, tenzij anders aangegeven. De significantie van verschillen tussen de controlegroepen en behandelingsgroepen nicotine werd bepaald door t-test een tweezijdige Student's. Verschillen werden significant beschouwd bij P < 0,05 of P < 0.01.}

Resultaten

α5-nAChR uitdrukkingen bij maagkanker weefselmonsters en cellijnen

De expressie van α5-nAChR werden gedetecteerd en gelokaliseerd in paraffine ingebedde menselijke maag weefsel secties. α5-nAChR werd hoofdzakelijk gelokaliseerd op het membraan van de tumorcellen, hoewel sommige cytoplasma kleuring werd ook waargenomen (Figuur 1A). Expressie van α5-nAChR hoger bij maagkanker weefsels (77,5%, 31/40) dan in para-carcinoomweefsel (20%, 2/10). De resultaten toonden een trend dat de positieve snelheid van α5-nAChR expressie verhoogd bij patiënten met nicotine-inname geschiedenis (87,5%, 08/07) in vergelijking met patiënten zonder nicotine-inname geschiedenis (75,0%, 24/32).

α5 nAChR-mRNA en eiwit detecteerbaar in een panel van maagkanker cellijnen. De cellijnen tot expressie verschillende α5 nAChR-eiwit, waarbij cellijnen met een hogere expressie waren BGC823, AGS en SGC7901 genormaliseerd aan die van GAPDH (figuur 1B). De niveaus van α5-nAChR mRNA expressie gedetecteerd met RT-PCR gecorreleerd met de niveaus van eiwitexpressie (figuur 1C). BGC823 drukt hogere α5-nAChR dan andere cellijnen. Voor verdere functionele experimenten werd BGC823 cellijn gekozen vanwege de hogere expressie (geschikt voor inductie door nicotine of silencing door siRNA).

Nicotine bevorderd maag-proliferatie van kankercellen door middel van α5-nAChR

Om bepalen of nicotine de proliferatie van maag cellen reguleren, het effect van nicotine met verschillende concentraties op cellevensvatbaarheid in BGC823 onderzocht door een CCK8 analyse (figuur 2A). BGC823 werden blootgesteld aan nicotine (0, 1, 10, 100, 500, 1000 pM) gedurende 24, 48 en 72 uur, respectievelijk. Zoals getoond in figuur 2A, nicotine bevorderd celproliferatie in een tijdsafhankelijke en concentratie-afhankelijke relatie. Nicotine gestimuleerde celproliferatie aanzienlijk lagere concentratie (1, 10, 100, 500 pM) en tijd (24-72 uur), maar een merkbare afname in celaantal werd waargenomen in nicotine behandelde kweken bij hogere concentratie (1000 uM) en tijd (72 h). Studies toonden niveaus van nicotine in het lichaam variëren sterk tussen individuen, zelfs bij het roken hetzelfde aantal identieke sigaretten [22-24] .De concentratie van nicotine (100 uM) van de onderhavige studie nagebootst de dagelijkse inname van sigaretten bij matige rokers [ ,,,0],25, 26]. De concentratie van nicotine (100 uM) is gelijk aan de concentratie in het speeksel roker die inlaat 25 sigaretten /dag [27]. Voor verdere functionele experimenten werd de concentratie van nicotine (100 uM) werd gekozen om gastrische cellen gedurende 24 uur te behandelen.

te bepalen of de nicotine-gemedieerde stimulering van celproliferatie in gastrische cellen wordt gemedieerd door α5-nAChR signalering, we het effect van nicotine op de expressie van nAChR α5-eiwit geanalyseerd BGC823 cellen door Western blot. Zoals getoond in figuur 2B, de behandeling van nicotine in een dosis van nicotine (0, 1, 10, 100, 500, 1000 pM) gedurende 24 uur bevorderde de expressie van nAChR α5-eiwit in een dosis-afhankelijke wijze. Om de betrokkenheid van α5-nAChR signaalweg in de nicotine-gemedieerde promotie van maag- kankercelproliferatie verder te bevestigen, we geblokkeerd α5-nAChR eiwitexpressie door transfecteren BC823 cellen met een α5-nAChR-specifieke siRNA (si-α5-nAChR) ( figuur 2C) en onderzocht de effecten ervan op nicotine-gemedieerde stimulering van celproliferatie door CCK assay (figuur 2D). In vergelijking met de gecodeerde niet-specifieke controle siRNA (si-NC), transfectie met si-α5-nAChR remden celproliferatie. Bovendien, si-α5-nAChR transfectie significante daling van de nicotine-gemedieerde bevordering van celproliferatie in BGC823 cellen (figuur 2D).

Nicotine remming van cisplatine geïnduceerde apoptose

Om verder te karakteriseren de apoptose effecten van nicotine in combinatie met cisplatine op BGC823, cisplatine werd gebruikt om apoptose in de cellen BGC823. De cellen werden behandeld met 20 mM cisplatine [28]. Zoals getoond in figuur 3A, werd de apoptotische cellen ronde vorm en hun kernen vertoonden een gefragmenteerd morfologie, vormen apoptotische lichamen. In tegenstelling, de cellen die gelijktijdig behandeld met nicotine en cisplatine kleine nucleaire fragmentatie en weinig apoptotische lichamen.

cisplatine geïnduceerde apoptose werd verder getest door AnnexinV /7-AAD kleuring. Flowcytometrie plots bleek dat de verhoudingen van totale apoptotische cellen (AnnexinV + /7-AAD-) met from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, bij blootstelling aan cisplatina gecombineerd met 100 uM nicotine (Figuur 3B). Deze resultaten suggereren dat nicotine geïnduceerde apoptose door cisplatine kan onderdrukken.

α5-nAChR /AKT signaalweg betrokken bij anti-apoptotische effecten van nicotine in cisplatine geïnduceerde apoptose van BGC823 cellen

Om het bepalen AKT rol in het mediëren de effecten van nicotine in deze cellen, bepaalden we of nicotine induceert activatie van AKT in BGC823 cellen. In figuur 4A, 20 mM cisplatine sterk onderdrukt activiteit van AKT (laan 2), maar nicotine verhoogde expressie AKT (laan 3) in aanwezigheid van cisplatin. Voorgesteld dat AKT werd geactiveerd na blootstelling aan 100 uM nicotine in BGC823 cellen zoals in verschillende documenten [29, 30]. De down-regulatie van α5-nAChR expressie daalde P-AKT-expressie (baan 4). Behandeling met 10 mM LY294002, een fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT remmer, verlaagde de anti-apoptotische effecten van nicotine in BGC823 cellen (laan 5). Bovendien, behandeling met LY294002 combinatie met si-CHRNA5 transfectie significant onderdrukt de nicotine geïnduceerde P-AKT eiwitniveaus (laan 6). Deze gegevens suggereren dat α5-nAChR /AKT routes spelen een cruciale rol in het mediëren van de effecten van nicotine en chemotherapie bij maagkanker cellen.

Verder hebben we onderzocht de effecten van nicotine op cisplatine geïnduceerde caspase-3 activatie in BGC823 cellen door Western blot assay. Zoals getoond in figuur 4B, cisplatine veroorzaakte een toename van caspase-3 activatie, terwijl nicotine geblokkeerd cisplatine geïnduceerde caspase-3 activatie in BGC823 cellen. Bovendien BGC823 blootstelling van cellen aan cisplatine veroorzaakte de expressie van apoptotische eiwit Bax verhoogd terwijl de prosurvival eiwit Bcl-2 en survivine verminderd, wat geremd door behandeling met nicotine.

De tussentijd, zoals getoond in figuur 4C, de anti-apoptotische effect van nicotine werd duidelijk geblokkeerd door si-α5-nAChR in BGC823 cellen. Flowcytometrie plots blijkt dat het aandeel van de apoptotische cellen (AnnexinV + /7-AAD-) steeg van 18,5 ± 0,92% naar 34,9 ± 1,74% na 5 si-behandeling in vergelijking met Si-NC-groep. Toevoeging van AKT inhibitor LY294002 met si-α5-nAChR aanzienlijk bevorderde de apoptotische effect van cisplatine van 31,5 ± 1,57% tot 61,2 ± 3,06% ten opzichte van LY294002 groep. Deze resultaten geven aan dat nicotine een belangrijke rol bij het voorkomen van cisplatine geïnduceerde apoptose via α5-nAChR /AKT signaling pathway speelt.

Discussie

Deze studie is de eerste die een cruciale rol aantonen α5-nAChR nicotine anti-apoptose van cisplatine in menselijke maagkanker cellen. De analyse van klinische monsters gaf aan dat α5-nAChR expressie algemeen hoger in tumorcellen in vergelijking met para-carcinoomcellen. De resultaten toonden een trend dat de positieve verhouding van α5-nAChR expressie was hoger bij patiënten met nicotine geschiedenis dan patiënten zonder nicotine geschiedenis. De in vitro resultaten tonen aan dat nicotine opwaarts gereguleerd de expressie van nAChR α5-eiwit en remde door cisplatine geïnduceerde apoptose door controle α5-nAChR /AKT signaling pathway in maagkanker cellen. Nicotine verhinderd cisplatine geïnduceerde activatie van caspase-3 en Bax en opwaarts gereguleerd de expressie van anti-apoptotische eiwitten Bcl-2 en survivine. Bovendien activering van AKT bleek een rol als mediator cisplatine geïnduceerde apoptose, alsook anti-apoptotische effecten van nicotine spelen BGC823 cellen. Het kan interessant zijn om aandacht te besteden aan de relatie tussen sigarettenrook (tweede roken) en maagkanker incidentie.

Vorige bevindingen hebben de sterke associatie tussen sigarettenrook en maagkanker [31, 32] ontrafeld. Nicotine werd aangetoond dat de proliferatie en migratie van maagkanker cellen te verhogen door het induceren cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandine E2, VEGF, β-adrenoceptoren, proteïnekinase C [26, 33, 34]. Deze effecten te worden gemedieerd door de homopentameric α7-nAChRs [35]. Echter, recente studies een onverwacht effect van de heteropentamere α5-nAChRs van nicotine-inname [36-38] aangetoond. Onze vorige werken meldden dat de nicotine /α5-nAChR route is van cruciaal belang voor longkanker levensvatbaarheid van de cellen [21, 39]. Toch is geen informatie beschikbaar over de vraag of nicotine heeft ook invloed op de proliferatie van menselijke maagkanker cellen door regulatie van α5-nAChR geweest. Hier hebben we de rol van α5-nAChR in menselijke maagkanker. Onze resultaten toonden dat expressie van α5-nAChR hoger bij maagkanker weefsels vergeleken met para-carcinoom weefsel, dat suggereerde dat α5-nAChR een rol kunnen spelen maagkanker. Bovendien nicotine bevorderd α5-nAChR eiwitexpressie en blokkeren van de activatie van α5-nAChR door siRNA verzwakt door nicotine geïnduceerde gastrische kankercelproliferatie. Voorgesteld dat α5-nAChR is een van de belangrijkste moleculen celproliferatie gestimuleerd door nicotine in maagkanker cellen mediëren.

De huidige standaard chemotherapie voor maagkanker cisplatina, maar het succes van deze behandeling is slecht. De werkzaamheid van cisplatina afhankelijk van het vermogen om DNA-schade [40, 41] induceren. Dus hoe kankercellen reageren op cisplatine geïnduceerde apoptose speelt een cruciale rol in cisplatine gevoeligheid. Recente rapporten tonen aan dat nicotine remt cisplatine geïnduceerde apoptose in longkankercellen, mondkanker, RAW264.7 en EL4 cellen [13, 16, 18], hetgeen erop kan wijzen dat nicotine het vermogen niet alleen voor de ontwikkeling van kanker te bevorderen door activering celgroei trajecten , maar ook om de werkzaamheid van chemotherapeutische middelen verminderen door het stimuleren overleving routes. In overeenstemming met de eerdere bevindingen, de resultaten van de onderhavige studie toonde aan dat co-behandeling van de cellen met cisplatine en nicotine, een significante activatie van caspase-3 werd waargenomen, wat aangeeft dat nicotine kan een remming van de apoptotische potentie van het bepalen cisplatine bij maagkanker.

De signaalwegen die cel processen, waaronder celproliferatie, voortgang van de celcyclus en apoptose reguleren, hebben aanzienlijke invloed op de beslissing cellulaire reactie op cisplatine. Eerdere studies hebben aangetoond dat activatie van AKT pathway kan leiden tot resistentie tegen cisplatina [42, 43]. Een overexpressie van serine gefosforyleerd AKT is aangetroffen in een groot aantal menselijke kankers, waaronder maagkanker [44, 45]. Zoals in verschillende documenten, nicotine door binding aan nAChR leidt tot stroomafwaartse activering van tumorbevorderende eiwitten waaronder activering van AKT paden [46-48]. Blootstelling aan nicotine mogelijk een negatieve invloed op de apoptotische potentie van cisplatine in humane orale kankercellen, en AKT pad nodig was voor nicotine functie [16]. Echter, AKT pad nicotinezuur stroomafwaartse signalering en de anti-apoptotische effecten van nicotine bij maagkanker cellen onbekend. Daarom onderzochten we of P-AKT kan verantwoordelijk zijn voor het antagoniserende effect van nicotine op de cytotoxiciteit van cisplatine. We vonden dat gelijktijdig behandeld met siRNA-α5-nAChR en LY294002, een PI3K /AKT remmer, verhoogde cisplatine geïnduceerde apoptose en verzwakt de effecten van nicotine in BGC823 cellen. Verschillende studies gemarkeerde nicotine geactiveerd AKT signaalwegen is bij het moduleren van celproliferatie en overleving door stimulatie van prosurvival eiwit Bcl-2 en survivine [15, 49, 50]. Ons onderzoek toonde ook aan dat de rol van nicotine op apoptose geïnduceerd door cisplatine door middel α5-nAChR /AKT wordt bevestigd door inductie van Survivin en Bcl-2, als definitief effectoren van de paden te kiezen.

Kortom, we aangetoond dat nicotine geactiveerd α5-nAChR /AKT signalering en is betrokken bij de resistentie van cisplatina bij maagkanker. Deze bevindingen geven nieuwe inzichten in de mogelijke moleculaire mechanismen van remming van nicotine cisplatine geïnduceerde apoptose in menselijke maagkanker cellen (figuur 5). Nicotine aanwezig in sigarettenrook kunnen interfereren met maagkanker farmacologische behandeling door het remmen van chemotherapeutische drug-geïnduceerde apoptose. Strategieën gericht op het begrijpen nicotine-gemedieerde signalering kan de ontwikkeling van verbeterde therapieën bij maagkanker te vergemakkelijken.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Expressie van α5-nAChR en α7-nAChR zonder of met α5-siRNA behandeling
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s001
(TIF)
S2 Afb. Down-regulatie van α5-nAChR expressie daalde het niveau van P-AKT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s002
(TIF)
S3 Fig. Expressie van α5-nAChR in BGC823 cellen zonder of met si-α5-nAChR behandeling
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s003
(TIF)
S4 Fig. Nicotine bevorderd BGC823 celproliferatie door middel van α5-nAChR en α7-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s004
(TIF)
S5 Fig. Nicotine bevorderd SGC7901 celproliferatie door middel van α5-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s005
(TIF)
S6 Fig. Nicotine remming van cisplatine geïnduceerde apoptose van SCG7901
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s006
(TIF)

• PLoS ONE: Een lymfkliertest Staging System voor maagkanker: een hybride Type Op basis van Topografische en Numeriek Systems
• PLoS ONE: N-Terminal polypeptide van annexine A2 Vermindert Infectie van Mycoplasma hyorhinis aan maagkanker Cells