PLoS ONE: N-Terminal polypeptide van annexine A2 Vermindert Infectie van Mycoplasma hyorhinis aan maagkanker Cells

Abstract

Mycoplasma infectie bij de mens en de besmetting in celkweken zijn wereldwijde problemen. De thans beschikbare middelen voor het voorkomen of behandelen van mycoplasma infectie lijden aan een lage gevoeligheid, sterke weerstand en hoge toxiciteit. Onze eerdere werk is gebleken dat Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) infectie werd bemiddeld door de interactie tussen de P37 van de M
. hyorhinis Kopen en annexine A2 (ANXA2) van gastheercellen, maar de translationele waarde van dit mechanisme was onbekend. Hierin synthetiseerden we het N-terminale polypeptide van ANXA2 (A2PP) en vonden dat A2PP de infectie van M
kon afnemen. hyorhinis
aan maagkanker cellen en blokkeren M
. hyorhinis
-infectie geïnduceerde cel migratie. Verder vonden we dat A2PP kunnen verminderen M
. hyorhinis
besmetting van passage cellen. Bovendien, vergeleken met de commerciële antibiotica vaak gebruikt in celkweek te voorkomen M
. hyorhinis
infectie, A2PP blijk gegeven van een meer effectiviteit, maar een lage toxiciteit op de celgroei. Zo, onze studie voor het eerst onthuld potentieel A2PP voor de behandeling en preventie van M
. hyorhinis
infectie

Visum:. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-Terminal polypeptide van annexine A2 Vermindert Infectie van Mycoplasma hyorhinis
aan maagkanker Cellen . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10.1371 /journal.pone.0147776

Editor: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Duitsland

Ontvangen: 16 oktober 2015; Aanvaard: 7 januari 2016; Gepubliceerd: 26 januari 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. Alle relevante gegevens binnen het papier. Microarray data is gedeponeerd in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (toetreding no.GSE73777)

Financiering:. Gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81.572.532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC ontving de financiering. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de bereiding van manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

pathogene mycoplasma, met inbegrip van Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), mycoplasma hyorhinis ( M
. hyorhinis
), orale mycoplasma ( M
. orale
) en Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), behoren tot klasse mollicuten, dat is de kleinste micro-organisme living aard en kunnen onafhankelijk dupliceren [1-2]. Veel studies hebben aangetoond dat infectie met deze mycoplasma's geassocieerd met tumorontwikkeling [3-8]. M
. orale
veroorzaakt chromosoomafwijking in menselijke diploïde cellen en induceert celtransformatie [6]. Infectie met M
. hyorhinis golfreizen of M
. genitalium
kon de migratie en de invasiviteit van de prostaat epitheelcellen te verhogen [3]. M
. hyorhinis
infectie is in verband gebracht met artritis, serositis, onvruchtbaarheid en kanker van de menselijke [9-12].

Daarnaast mycoplasma besmetting in celkweek is een ernstig probleem en de snelheid van de passage cellen besmet met mycoplasma hoog. Celkweek wordt veel gebruikt in de life sciences, zoals in het fundamenteel onderzoek, klinische onderzoek, ontwikkeling en productie van biologische producten, alsmede op het gebied van biofarmaceutische en vaccinproductie. Voorkomen dat de cellen van microbiële besmetting is cruciaal voor de kwaliteit van het onderzoek te verzekeren. De mycoplasmabesmetting is de meest voorkomende probleem in celkweek met een incidentie van 30% -60% [1]. Er werd aangetoond dat vier soorten mycoplasma's zijn goed voor meer dan 95% van de infectie in celkweek, met inbegrip van M
. orale
, arginine mycoplasma ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
en Levin geen Acholeplasma ( A
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Vanwege de geringe omvang, mycoplasma is nauwelijks te vinden onder de lichtmicroscoop en is gemakkelijk genegeerd door de onderzoekers. De laatste jaren talrijke antibiotica met mycoplasma behandeling herhaald resulteerde in het ontstaan ​​van resistentie mycoplasma. Om deze redenen, is het noodzakelijk om nieuwe middelen voor het voorkomen of verminderen van mycoplasma-infectie.

Onze eerdere werk is gebleken dat M
. hyorhinis
infectie hangt af van de interactie van P37 (grote membraaneiwit van M
. hyorhinis
) en gastheer ANXA2 door hun N-terminale domeinen. We vonden ook polyklonaal antilichaam aan P37 kon de infectie van M
blokkeren. hyorhinis Kopen en afname M
. hyorhinis
-promoted migratie van maagkanker cel [17]. Op basis van deze ontdekkingen hebben we stak een hypothese dat het peptide gesynthetiseerd volgens de aminozuursequentie van ANXA2 N-terminale regio (van 1 ^{e 30 e aa, hier een peptide zoals A2PP genoemd we), kunnen blokkeren M
. hyorhinis
infectie via de concurrentie met ANXA2 en eventueel worden gebruikt als een geneesmiddel voor het voorkomen van M
. hyorhinis
infectie in celkweek. In deze studie hebben we getest deze hypothese en ook de effecten vergeleken van A2PP met andere geneesmiddelen bij het voorkomen M
. hyorhinis
infectie.}

Materialen en methoden

Cell Culture

AGS maagkanker cellijn was van American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 maagkanker cellijn werd opgericht door de Universiteit van Peking People's Hospital en werd gekocht van Cell Culture Center van de Chinese Academie van Medische Wetenschappen (Beijing, China). AGS en BGC823 cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium waaraan 10% foetaal kalfsserum verkregen van Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). Mycoplasma test werd uitgevoerd voor elk nieuw experiment met behulp van PCR-amplificatie van M
. hyorhinis p37
.

Mycoplasma Voortplanting en co-cultuur

Mycoplasma vermeerdering en de co-cultuur werd uitgevoerd zoals eerder gemeld [17,18,19].

antilichamen en reagentia

Anti-p37 monoklonaal antilichaam PD4 werd gegenereerd en eerder gekenmerkt [5,20,21]. Polyklonaal anti-p37 antilichaam werd verkregen door immuniseren van konijnen met GST-p37 fusieproteïne na het standaardprotocol. Anti-EGFR en anti-fosfo-EGFR werd gekocht bij Cell Signaling Technology (CST, USA). Anti-ANXA2 was van Novus Biotechnologie (Novus Biotechnology, USA). Anti-fosfo-ANXA2 was van Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1 ^{st tot 30 e bis) en verschillende afgeknotte A2PP peptiden, waaronder A2PP-Pd4 (5 e tot 30 e bis), A2PP-ND8 (9 e tot 30 e bis), A2PP-ND12 (13 rd tot 30 e bis), A2PP-ND16 (17 e tot 30 e bis), A2PP CD4 (1 st tot 26 e bis), A2PP-CD8 (1 st tot 22 nd aa), A2PP-CD12 (1 st tot 18 e bis), A2PP- CD16 (1 st tot 14 e bis), samen met een willekeurige controle peptiden (CONP) werden gesynthetiseerd door Sbsbio (Beijing, China). Antimicrobiële mycoplasma I (MYCO I) en mycoplasma II (MYCO II) werden gekocht bij M &C GENTECHNOLOGIE (Beijing, China). Ciprofloxacine (CIP) was van Double-Crane Pharm (Beijing, China).}

detectie van M
. hyorhinis
door kwantitatieve PCR (qPCR)

DNA werd geëxtraheerd uit AGS of BGC823 cellen na M
. hyorhinis
infectie door DNA lysisbuffer (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20 en 200 mg /l proteïnase K) volgens het standaard protocol. qPCR werd uitgevoerd met 30 ng DNA en SYBR Green real-time PCR 2 × voormengsel kit (Takara, Otsu, Japan) onder toepassing Stap een systeem van ABI (Foster City, CA, USA). Het reactiemengsel s en p37
-specifieke primers (voorwaarts: 5'- TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'reverse: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3') werden eerder [22] beschreven. Te vergelijken M
. hyorhinis
DNA niveaus in cellen, GAPDH
(voorwaarts: 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', reverse: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') werd geamplificeerd als controle en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van de 2 ^{-ΔΔCt methode. Primers werden gesynthetiseerd door Sangon (Shanghai, China).}

Western Blotting

De cellen werden geoogst van cultuur schotel met 2 x SDS ladingsbuffer. Polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [23].

ELISA

96 putjes werden geënt met cellen (1 x 10 ^{4 /goed), gevolgd door behandeling van de aangegeven peptiden en infectie van M
. hyorhinis
gedurende 24 uur. Cellen werden geïmmobiliseerd met 0,05% glutaaraldehyde gedurende 10 minuten, daarna ELISA werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [24].}

Vaste-fase bindingstest en Pull-Down Assay

Recombinant GST-p37 en GST eiwitten werden geproduceerd en gezuiverd zoals eerder beschreven [17]. GST-p37 en GST werden verdund in buffer (0,1 M Na _{2CO 3, 0,1 M NaHCOs 3, PH 9,6) en gecoat in 96-putjes platen bij 4 ° C overnacht. De platen werden gewassen met PBS driemaal en geblokkeerd met 5% afgeroomde melk /PBS bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 uur. Na wassen met PBS, aangegeven concentraties van biotine-geconjugeerd A2PP (gesynthetiseerd door Sbsbio) werd toegevoegd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Na wassen met PBST 3 maal, streptavidine-HRP geconjugeerd (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) werd toegevoegd en geïncubeerd bij KT gedurende 30 min. Na kleurontwikkeling met Ortho-fenyleendiamine (Sigma), optische dichtheid bij 490 nm (OD490) werd opgenomen met een Microplate Reader (Bio-Rad 550). Voor pull-down test 100 ng GST-p37 of GST-eiwit werd samen geïncubeerd met 20 pM biotine-A2PP en streptavidine korrels (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) in bindingsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF en 1 x volledige proteaseremmers) bij 4 ° C overnacht. De neerslagen werden gewassen met bindingsbuffer voor vier keer en geanalyseerd door Western blotting.}

Co-immunoprecipitatie

M
. hyorhinis
geïnfecteerde cellen (BGC823 of AGS) werden gehomogeniseerd in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF en 1 × volledige proteaseremmers) bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Na 12, 000 g centrifugatie gedurende 10 min bij 4 ° C, supernatanten werden gewonnen. Eiwit lysaten (500 ug) geïncubeerd met 20 pM of A2PP CONP, 1 ug anti-ANXA2 plus proteïne G sepharose korrels (GE Healthcare) bij 4 ° C overnacht. Pre-immuun IgG (1 ug) werd gebruikt als controle. Neergeslagen bolletjes werden gewassen met lysisbuffer vier keer geëlueerd in 2 x ladingsbuffer, gekookt en geanalyseerd door Western blotting.

immunofluorescentietest

De cellen werden gezaaid op dekglaasjes en overnacht gekweekt. De volgende dag werden de cellen behandeld met peptiden aangegeven en geïnfecteerd met M
. hyorhinis
gedurende 24 uur. Daarna werden de cellen gewassen met ijskoude PBS driemaal, in 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het blokkeren gedurende 1 uur in 5% BSA /PBS werden cellen geïncubeerd met antilichamen aangeduid bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vervolgens werden de cellen gewassen 3 keer opnieuw met PBST en geïncubeerd met FITC en TRITC-gelabelde secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na wassen met PBS en met DAPI tegenkleuring werden cellen aangebracht op 50% glycerol /PBS. Een Zeiss LSM780 confocale microscoop (Zeiss Microsystems, Oberkochen, Duitsland) werd gebruikt om de lokalisatie van eiwitten aangegeven observeren.

celmigratie Assay

Transwell kamer met 8,0 urn poriën membranen (Corning, NY, USA) werd gebruikt bij de celmigratie assay. De onderste kamer werd gevuld met 800 pl medium dat 10% FBS als chemoattractant. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in serumvrij medium bevattende M
. hyorhinis
plus A2PP of CONP vervolgens zorgvuldig overgebracht naar de bovenste kamer van elk Transwell apparaat bij een dichtheid van 2 x 10 ^{5 cellen /ml (120 pl /kamer). Men liet de cellen migreren 24 uur bij 37 ° C. Het bovenoppervlak van elk membraan werd ontdaan van cellen met een wattenstaafje. Cellen doorgedrongen tot de onderzijde van het membraan werden gefixeerd in koude methanol, gekleurd met 0,1% kristalviolet en geteld in negen willekeurig gekozen microscopische velden per putje. Elk monster werd in drievoud bereid kamers en elk experiment werd herhaald gedurende minstens 3 maal.}

Cell Proliferation Assay

Maagkanker cellen werden gezaaid in 96-well kweekplaten bij een densiteit van 5 x 10 ^{3/100 pl /putje in drievoud, en werden behandeld met de aangegeven reagentia. Proliferatie van de cellen werd gekwantificeerd door de cellen samenvloeiing met een CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).}

Microarray analyse en real-time RT-PCR

AGS en BGC823 cellen ( 1 x 10 ^{6 per 10 cm 2 plaat) werden behandeld met A2PP, CIP, MYCO I en II MYCO voor 24 uur, gewassen met PBS en in Trizol reagens geoogst. RNA-monsters werden in OE Biotechnologie (Shanghai, China) onderzocht met behulp van Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ Human Gene Expression Array. Microarray data is gedeponeerd in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (toetreding no.GSE73777). Ruwe data werd opgenomen met behulp van Affymetrix GeneChip Command Console (versie 4.0, Affymetrix). Vervolgens Genespring software (versie 12.5, Agilent Technologies) werd gebruikt om de fundamentele analyse af met de ruwe data. Om te beginnen, de ruwe data werd genormaliseerd met de RMA-algoritme. Differentieel tot expressie van genen werden vervolgens geïdentificeerd door middel van voudige verandering. De set-up- en down-gereguleerde genen drempel was een voudige verandering ≥ 2,0. Daarna, GO en KEGG analyse werden toegepast op genen die verband houden met de celcyclus en cel apoptose uit te kiezen. Real-time RT-PCR werd gebruikt om de resultaten van de microarray valideren en uitgevoerd volgens de fabrikant instructie (SYBR, TOYOBO). Expressie van genen werden genormaliseerd door middel van GAPDH
en de 2 -ΔΔCT werd gebruikt om het relatieve genexpressie te berekenen. De primers voor real-time RT-PCR ( ATF
, forward, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', omgekeerde, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, vooruit, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', reverse, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB
, voorwaarts, 5'- AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', reverse, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') werden gesynthetiseerd door Sangon <. br>}

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. De verschillen werden geanalyseerd door ANOVA met SPSS 11.0 software en P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Microarray Number toetreding

microarray data is gedeponeerd in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (toetreding geen. GSE73777).

Resultaten

A2PP heeft geen effect op de levensvatbaarheid of Migratie van de maagkanker Cellen

met het oog op de rol van ANXA2 de N-terminale domein in de M
evalueren. hyorhinis
infectie, we eerst gesynthetiseerd A2PP peptide dat overeenkomt met N-terminus van ANXA2 (figuur 1A). Biotine gelabelde A2PP bleek specifiek interageren met GST-P37 in de vaste fase bindingstest (figuur 1B) en pull-down assay (figuur 1C). We hebben gemerkt dat A2PP had geen invloed op de morfologie van AGS en BGC823 cellen (figuur 1D). Bovendien, in concentraties van minder dan 20 pM, A2PP niet celproliferatie (figuur 1E) remt, suggereert dat A2PP een minimale toxiciteit voor cellen. EGFR is betrokken bij het reguleren van fosforylatie ANXA2 [17,25,26], terwijl A2PP geen effecten op de fosforylaties of eiwit niveaus van EGFR en ANXA2 [figuur 2A] had. Bovendien A2PP had geen effect op de migratie van AGS en BGC823 cellen (Fig 2B en 2C). Cellulaire lokalisatie van ANXA2 wordt gereguleerd door de fosforylering, die essentieel is voor de functie [17,27,28]. We vonden A2PP hebben de subcellulaire lokalisatie van endogeen ANXA2 (figuur 2D) niet veranderen. Deze resultaten geven aan dat A2PP alleen geen effect heeft op kwaadaardige fenotypes of EGFR-ANXA2 signalering van maagkanker cellen.

A2PP Verlaagt M
. hyorhinis
Infection

Onze vorige werk heeft aangetoond dat N-terminale van ANXA2 bemiddelt M
. hyorhinis
infectie [17]. Zoals blijkt uit het resultaat van de cel ELISA-test, vonden we dat M
. hyorhinis
infectie werd geblokkeerd door A2PP in een dosis-afhankelijke manier in BGC823 en AGS cellen, maar CONP-behandelde cellen werden nog steeds zeer geïnfecteerd door M
. hyorhinis
(figuur 3A). Deze resultaten werden ondersteund door qPCR assays (figuur 3B). Consequent, A2PP daalde ook eiwit niveaus van p37 eiwit in de Western blotting-analyse (Fig 3C en 3D). Ondertussen, het niveau van phophos-AXNA2 en phophos-EGFR in de geïnfecteerde cellen werden down-gereguleerd door behandeling met A2PP (Fig 3C en 3E), terwijl de totale niveaus van AXNA2 en EGFR relatief stabiel (figuur 3C) waren. In de immunofluorescentie analyse werd A2PP gevonden om te remmen M
. hyorhinis
-infectie geïnduceerde p37 accumulatie en co-localisatie tussen P37 en ANXA2 (figuur 4A). In de co-immunoprecipitatie assay met eiwit lysaten van M
. hyorhinis
geïnfecteerde cellen, A2PP daalde de interactie tussen P37 en ANXA2 (figuur 4B). Samen vormen deze bewijzen steunden het idee dat A2PP kon afnemen M
. hyorhinis
infectie bevestigden onze eerdere ontdekking dat het N-uiteinde van ANXA2 is vereist voor het mediëren M
. hyorhinis
infectie [17].

A2PP onderdrukt M
. hyorhinis
geïnduceerde migratie

Onze eerdere studies suggereerden dat M
. hyorhinis
infectie kan migratie van maagkanker cellen [17, 23] te bevorderen. In deze studie, merkten we dat M
. hyorhinis
-promoted migratie van maagkanker cellen werd niet beïnvloed door CONP, maar was dosis-afhankelijk geremd door A2PP (Fig 5A en 5B). Deze resultaten suggereren dat A2PP remde M
. hyorhinis
geïnduceerde migratie, die werd geassocieerd met zijn vermogen om infectie bevorderd fosforyleringen van EGFR en ANXA2 (Fig 3C en 3E).

A2PP Heeft Essentiele Motif te verlagen M verlagen
. hyorhinis
Infection

Om de kritische motief van A2PP karakteriseren, we gevraagd om te bepalen of de diverse ingekorte peptiden A2PP (figuur 6A) kon vermindert M
. hyorhinis
infectie. In de qPCR analyse A2PP en ingekorte peptiden A2PP-Pd4, ND8, ND12 CD4, CD8 en CD12 verminderde M
. hyorhinis
infectie bij maagkanker cellen, maar A2PP-ND16 en A2PP-CD16 niet te verlagen M
. hyorhinis
infectie (figuur 6B). Vergelijkbaar patroon van remming werd verkregen bij Western blot assay (figuur 6C). Deze resultaten suggereren het bestaan ​​van een specifiek motief van A2PP essentieel voor zijn capaciteit te verminderen M
. hyorhinis
infectie. Om verder in kaart de kern sequenties van dit potentieel motief, we gesynthetiseerd de twee peptiden die overeenkomen met 11 ^{e -20 e aa (aangeduid als A2PP-10aa) en 13 e -18 e aa (aangeduid als A2PP-6 bis bis) (figuur 7A). In qPCR assay, konden beide peptiden afnemen M
. hyorhinis
infectie (figuur 7B), die werd ondersteund door Western blot assay (figuur 7C). Met name de remmende effecten van A2PP-10aa waren beter dan die van A2PP-6aa, maar de effecten van beide peptiden waren minder sterk als die van A2PP (figuur 7B en 7C). Thesefore, de centrale sequenties (11 e -20 e) van A2PP kon de essentiële motief om te remmen M
zijn. hyorhinis
infectie.}

Vergelijking van A2PP met andere drugs in het voorkomen van M
. hyorhinis
Infection

M
. hyorhinis
was één van de belangrijkste bronnen van vervuiling celkweek [13,14,15]. De beste manier om te elimineren M
. hyorhinis
infectie aan cellen weg te gooien en snel steriliseren alle contact opgenomen met schepen, maar een aantal geïnfecteerde cellen kunnen niet worden vervangen in een aantal gevallen. Derhalve is het noodzakelijk om specifieke anti-microbiële benaderingen voorkoming of eliminatie M
. hyorhinis
infectie. Er zijn verschillende antimicrobiële middelen zijn geweest voor het voorkomen van M
. hyorhinis
infecteren. Zo kan ciprofloxacine (CIP) uit te roeien M
. hyorhinis
in een geschikte concentratie [29]. Twee antimicrobiële componenten genoemd als mycoplasma I (MYCO I) en mycoplasma II (MYCO II) kan verminderen M
. hyorhinis
infectie door het blokkeren van de eiwitten en nucleïnezuur synthese. Echter, sommige problemen, zoals lage gevoeligheid, sterke weerstand en hoge toxiciteit hun toepassingen in celcultuur beperken. Op basis van deze overwegingen, zijn wij van mening dat het noodzakelijk is om de efficiëntie van A2PP, CIP, MYCO I en II MYCO vergelijken bij het voorkomen van M
. hyorhinis
infectie. Door Western blotting en qPCR assays, vonden we dat remmend effect A2PP op M
. hyorhinis
infectie was vergelijkbaar met die van MYCO I, maar was beter dan die van CIP en MYCO II (Figuur 8A en 8B). Interessant, vonden we dat A2PP de M
ook efficiënt zou kunnen elimineren. hyorhinis
infectie in zwaar geïnfecteerde cellen in het proces van passages P _{1 tot P 3 (Figuur 8C en 8D). Bovendien, vergeleken met MYCO I en II MYCO, A2PP had minder remmend effect op de celproliferatie (Figuur 9A). Om de mechanismen van A2PP, CIP, MYCO I en effecten MYCO II op cellen proliferatie verkennen, voerden we microarray analyse en gescreend een subset van differentieel tot expressie genen in A2PP, CIP, MYCO I en II MYCO behandelde cellen. Kwantitatieve RT-PCR-analyse toonde verhoogde expressie van apoptose-gerelateerde genen ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB
) door MYCO I en behandeling MYCO II, maar kleine veranderingen waren waargenomen in A2PP en CIP groepen (figuur 9B). Deze resultaten geven aan dat A2PP minder toxiciteit en betere preventieve potentieel in het blokkeren van M
. hyorhinis
infectie in gekweekte cellen.}

Discussie

Mycoplasma infectie en besmetting zijn nog steeds overwegend vandaag en brengen aanzienlijke risico's voor de patiënten en de kwaliteit van het onderzoek. De laatste jaren hebben verschillende studies gesuggereerd dat mycoplasma infectie werd ook geassocieerd met tumorigenese [3-8]. Mycoplasma infectie kan het DNA beschadigen, genexpressie beïnvloeden, en verstoren de celcyclus en apoptose [30]. M
. hyorhinis
werd gevonden in 56% van maagkanker, 55,1% van colonkankers en 39,7% borstkanker weefsels [20]. Daarnaast serologische tests bleek dat 36% benigne prostaathyperplasie (BPH) en 52% prostaatkanker weefsels waren M
. hyorhinis
positief [4]. Deze studies suggereren een mogelijk verband tussen de M
. hyorhinis
besmetting en het optreden van tumoren [4,20]. Bovendien, in het proces van celkweek, de meest voorkomende vervuiling bronnen mycoplasma, bacteriën en schimmels, maar de infectiegraad van mycoplasma relatief hoger [13]. Resultaten van verschillende groepen hebben aangetoond dat het aantal mycoplasmabesmetting varieerde 15-80%, soms zelfs 100% [15,31] bereikt. Een analyse van de DNA sequenties van 1000 genomen Projectontwikkeling impliceerde dat 7% van de monsters verontreinigd door mycoplasma [32]. Het voorkomen mycoplasma infectie en verontreiniging is moeilijk. Ten eerste was er pleomorfe, plasticiteit, filtreerbaarheid en gemakkelijke oplosbaarheid, mycoplasma door kon microfiltratiemembraan passeren gemakkelijk, waardoor ze bestaan ​​op het oppervlak of gastheercel worden geëndocytoseerd door cellen [1,13,33]. Ten tweede, mycoplasma mist celwanden, waardoor ze ongevoelig voor antibiotica die celwand remt, zoals penicilline. Effectieve antimicrobiële middelen bestaan ​​wel, maar hun voortdurende toepassingen in celcultuur wordt niet aanbevolen vanwege de toxiciteit voor cellen. Tenslotte mycoplasma is een atypisch bacteriën, waardoor difficulities de juiste diagnose [34].

Talrijke anti-mycoplasma geneesmiddelen zijn ontwikkeld, zoals erytromycine, leucomycine, roxitromycine, ofloxacine en ciprofloxacine. Maar de negatieve effecten, toxiciteit, en weerstand nog steeds problemen brengen om vervuiling tegen te [10,11,35-38]. Trouwens, zou continue toediening van deze antibiotica niet volledig te elimineren mycoplasma voor één of zelfs meerdere weken [39,40]. Daarom is het essentieel om nieuwe manieren die de mycoplasma infectie of besmetting effectief en tijdig te kunnen elimineren. De oplossing voor dit doel kan waarschijnlijk worden gevonden via de karakterisering van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan mycoplasma-infectie.

Onze eerdere studie bleek dat de interactie van P37 eiwit met AXNA2 gemedieerde M
. hyorhinis
infectie [17]. In deze studie hebben we eerst gesynthetiseerd het N-terminale polypeptide van ANXA2 (A2PP) en gevalideerd zijn specifieke interactie met GST-P37 eiwit in de vaste fase streptavidine binding en pull-down tests. Geïnspireerd door dergelijke interactie, vroegen we ons af of A2PP infectie van M
kunnen tegenwerken. hyorhinis
. We vonden dat A2PP, in een geschikte concentratie (20 pm), verminderde M
. hyorhinis
infectie, remde-infectie bevorderd migratie, en tegen verlaagde infectie uitgelokt de fosforyleringen van EGFR en ANXA2 bij maagkanker cellen. Deze effecten werden geassocieerd met een verminderde interactie tussen p37 en ANXA2. Opgemerkt zij dat A2PP alleen nauwelijks effect vertoonden op de proliferatie van cellen en fosforyleringen van EGFR en ANXA2 suggereert dat A2PP wordt waarschijnlijk een bruikbaar reagens te verminderen M
. hyorhinis
infectie. Dit idee werd gesteund door vergelijkingen van A2PP's en effecten commerciële antibiotica 'op celproliferatie en M
. hyorhinis
infectie, waaruit bleek dat A2PP inderdaad had minder toxiciteit voor cellen, maar sterk vermogen om besmetting tegen te gaan.

Ondanks dat A2PP, een 30 aa polypeptide, kan afnemen M
. hyorhinis
infectie effectief, moeten we nog steeds om te begrijpen of afgeknotte vormen van A2PP soortgelijke anti M
zou kunnen bereiken. hyorhinis
vermogen. Door verscheidene afgeknotte peptiden A2PP, vonden wij dat de centrale sequenties (11 ^{e -20 e) van A2PP kunt de essentiële motief remmen M
. hyorhinis
infectie. De remmende effecten van afgeknotte peptiden waren nog niet zo sterk als die van volledige lengte A2PP, wat suggereert dat flankerende sequenties essentieel voor een goede structuur te bereiken efficiënte binding van p37 behouden. Verdere studies zijn nodig om de effecten van de wijziging en /of mutatie van dit motief te vinden op het remmen van M
. hyorhinis
infectie}

Dankwoord

Wij danken en dankbaar te erkennen Lin Meng, Dr. Zhihua Tian (allen van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis & Institute). Voor het leveren van kritische reagentia of technische bijstand.

• PLoS ONE: Nicotine Remt cisplatine-geïnduceerde apoptose via Reguleren α5-nAChR /AKT Signalering in Human MaagKanker Cells
• PLoS ONE: lage incidentie van synchrone of metachrone Tumoren na endoscopische submucosale Dissection voor Early Gastric Cancer met gedifferentieerde Histologie