PLoS ONE: Nikotin hemmt die Cisplatin-induzierte Apoptose über Regulierung α5-nAChR /AKT Signal in menschlichen Magenkrebszellen

Abstrakt

Magenkrebsinzidenz zeigt eine starke ursächlichen Zusammenhang mit Rauchen. Nikotin, die Hauptkomponente in Tabak, ist ein Überleben-Agonist, der Apoptose induziert durch bestimmte Chemotherapeutika hemmt, aber die genauen Mechanismen noch weitgehend unbekannt. Vor kurzem haben Studien gezeigt, dass α5-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor (α5-nAChR) hoch mit Lungenkrebsrisiko und Nikotinabhängigkeit verbunden ist. Dennoch hat keine Informationen zur Verfügung, ob Nikotin wirkt sich auch auf die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen durch die Regulierung von α5-nAChR. Um die Hypothese zu bewerten, dass α5-nAChR eine Rolle bei Magenkrebs spielen können, untersuchten wir seine Expression in Magenkrebs Geweben und Zelllinien. Die Expression von α5-nAChR erhöhte sich im Magenkrebsgewebe verglichen mit para-Karzinom Gewebe. Angesichts der Ergebnisse, gingen wir untersuchen, ob Nikotin Cisplatin-induzierte Apoptose über Regulieren α5-nAChR in Magenkrebszelle hemmt. Die Ergebnisse zeigten, dass Nikotin signifikant die Zellproliferation in einer dosis- und zeitabhängigen Weise durch α5-nAChR-Aktivierung in menschlichen Magenzellen gefördert. Außerdem Nikotin gehemmt Apoptose durch Cisplatin induziert. Silence of α5-nAChR abgetragenen die protektive Wirkung von Nikotin. Wenn jedoch LY294002 Co-Administration, ein Inhibitor der PI3K /AKT-Weg wurde eine erhöhte Apoptose beobachtet. Dieser Effekt korreliert mit der Induktion von Bcl-2, Bax, Survivin und Caspase-3 durch Nikotin in Magenzelllinien. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Exposition gegenüber Nikotin negativ könnte die apoptotische Potential von chemotherapeutischen Medikamenten auswirken und dass α5-nAChR /AKT-Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle bei der anti-apoptotische Aktivität von Nikotin durch Cisplatin induziert

Citation:. Jia Y , Sonnen H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) Nikotin hemmt Cisplatin-induzierte Apoptose über Regulierung α5-nAChR /AKT Signal in menschlichen Magenkrebszellen. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10.1371 /journal.pone.0149120

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, USA

Empfangen: 1. Juni 2015; Akzeptiert: 15. Januar 2016; Veröffentlicht: 24. Februar 2016

Copyright: © 2016 Jia et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Durch auferlegten Beschränkungen durch Jinan Central Hospital, sind Daten auf Anfrage erhältlich. Interessierte Wissenschaftler können an Dr. Xiaoli Ma ([email protected]) den Datenzugriff zu beantragen

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 81272588) und Shandong Provincial Natural Science unterstützt wird Foundation of China (Nr ZR2012HM061and ZR2013CM010)

konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der wichtigsten Ursachen. der Krebstodesfälle in der Welt. Offenbar sowohl genetische und Umweltfaktoren sind in Magen Karzinogenese beteiligt. Vorherige Ergebnisse haben die starke Assoziation zwischen Zigarettenrauch und Magenkrebs Inzidenz [1-3], jedoch entwirrt, der genaue Mechanismus ist vollständig nicht untersucht.

Nikotin, ein Hauptbestandteil von Zigarettenrauch, gezeigt wurde, bei der Initiierung, Förderung einbezogen werden, und sogar den Verlauf einiger Tumoren, einschließlich Magenkrebs. Mehrere Beweislinien legen nahe, dass Nikotin seine zelluläre Funktionen durch nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) ausübt. Verschiedene Epithelzellen, nicht nur neuron-Zellen, express nAChRs und die Struktur der nAChRs ein Homo- (α7or α9) oder heteropentamer (α2-α10; b2-b4). Studien haben gezeigt, dass Nikotin die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen durch ihre Wechselwirkung mit α7-nAChR stimuliert [4, 5]. Während andere Mitglieder der nAChR Familie regulieren können Signalwege zusammenlaufen, haben sie oft vielfältig und sogar entgegengesetzte Aktionen. Vor kurzem haben genomweite Assoziationsstudien zeigten, dass α5-nAChR hoch mit Lungenkrebsrisiko und Nikotinabhängigkeit ist [6, 7]. Dennoch hat keine Informationen zur Verfügung, ob Nikotin wirkt sich auch auf die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen durch die Regulierung von α5-nAChR.

Die Abgabe von chemotherapeutische Mittel Cisplatin nach der chirurgischen Resektion definiert derzeit die Standard-Behandlung für Magenkrebs [8 -10]. Leider ist eine erworbene Resistenz gegen Cisplatin häufig und Umgehung von Zell-Apoptose wird als einer der wichtigsten Mechanismen, die für Cisplatinresistenz [11, 12] anerkannt. Insbesondere hemmen Nikotin Apoptose durch Cisplatin bei Lungenkrebszellen [13-15] und oralen Krebserkrankungen [16] induziert könnte. Die hemmende Wirkung von Nikotin auf die Apoptose hat seiner Fähigkeit zugeschrieben worden anti-apoptotischen Proteinen wie Bcl-2 zu aktivieren und Survivin, sowie die Inaktivierung von proapoptotischen Proteinen wie Bax und Caspase-3, durch die Aktivierung von sowohl PI3K /AKT und PKC /ERK Signalwege in Krebszellen [13-15]. Diese Wirkung von Nikotin auf die Zell-Apoptose wird auch von nAChRs vermittelt, sondern zusätzlich zu α5-nAChR scheinen anderen Untereinheiten beteiligt sein [17, 18].

Obwohl viele dieser Mechanismen wurden in Lungenkrebs beobachtet [19-21], gibt es keinen Beweis für die anti-apoptotische Wirkung und der Mechanismus, durch Nikotin auf Magenkrebszellen ausgeübt wird. Das Ziel der vorliegenden Studie war es Nikotin Cisplatin-induzierte hemmt über Regel α5-nAChR in Magenkrebszellen Apoptose zu untersuchen. Darüber hinaus schlagen wir vor, die Beteiligung von Pro-Überlebensfaktoren, wie Bcl-2 und Survivin, durch AKT Wege aktiviert sind.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Das Studienprotokoll wurde von der Ethik in der Medizin und klinischen Studie Ausschuss des Jinan Central Hospital genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten.

Gewebeproben, Zellkultur und medikamentöse Behandlung

Fünfzig Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Proben, die 40 Proben von Magenkrebs und 10 para-Karzinom Gewebe wurden retrospektiv und zufällig aus den Akten des Jinan Central Hospital ausgewählt, nachdem das Protokoll, das von der lokalen Ethikkommission genehmigt wurde. Nach dem Bericht des Rauchens (oder nicht) in der Krankengeschichte der Patienten hatten 32 Fälle keine Geschichte Rauchen Aufnahme, 8 Rauchen Aufnahme Geschichte. Alle Proben wurden für die Diagnose von zwei erfahrenen Pathologen zur Diagnose ausgewertet.

Die menschlichen Magenkrebszelllinien MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 und MKN45 wurden aus der Zellbank von Shanghai erhalten, Institut für Biochemie und Zellbiologie, chinesische Akademie der Wissenschaften. Zellen wurden in DMEM (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS; Invitrogen), 1% Antibiotika bei 37 ° C in 5% CO 2 befeuchteten Luft. In allen Experimenten wurden 60-70% konfluenten Zellen gewaschen und in serumfreiem Medium für 24 Stunden für die angegebene Zeit vor der Behandlung mit Nikotin, Cisplatin und LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert.

Immunhistochemie

die immunhistochemische Färbung unter Verwendung des Streptavidin-Peroxidase-Methode (SP-Methode) wurde auf 4 &mgr; m Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Proben durchgeführt α5-nAChR-Expression in Magenkrebs und para-Karzinom Gewebe zu erkennen. Kurz gesagt, nach der Entparaffinierung und Hydratisierung wurden die Objektträger mit endogener Peroxidase in 0,3% H _{2 O behandelt 2 für 30 min und 2 h bei Raumtemperatur blockiert mit 1,5% Serum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung blockiert (PBS ). (: 100 Verdünnung 1) bei 4 ° C über Nacht, Waschen mit PBS und inkubiert mit sekundärem anti-Maus-Antikörper biotinyliert (KIT-5010 Die Schnitte wurden dann mit anti-α5-nAChR-Antikörper (Abcam, Inc. Cambridge, MA) inkubiert, , Max Vision Maixin.Bio, China) (1: 2000) in PBS für 30 min bei 37 ° C. (; Dako-Code K0377) mit 3, 3-Diaminobenzidin für 3 min als chromogenes Substrat unter Verwendung des Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex /HRP der Antikörper-Bindung wurde detektiert. Die Objektträger wurden dann mit Hämatoxylin leicht gegengefärbt. Als negative Kontrolle, Duplikatsabschnitte wurden ohne Kontakt mit den primären Antikörpern gefärbt. Die Ergebnisse wurden unter einem Mikroskop beobachtet.}

Quantitative Real-time RT-PCR

Die Gesamt-RNA isoliert wurde mit der Trizolreagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Fünfundzwanzig Nanogramm Gesamt-RNA pro Probe transkribiert wurde revers durch die reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung von Kit (Takara Code: DRR061S) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantitative real-time PCR wurde auf die Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR-System analysiert geführt, um die relativen Mengen von α5-nAChR und β-Aktin (interne Kontrolle) mRNAs ausgedrückt zu bestimmen. Die SYBR Green Supermix wurde für alle Echtzeit-PCR-Reaktionen verwendet. PCR-Primer in dieser Studie verwendet werden, sind wie folgt: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) nach vorne, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'und umgekehrt, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Die quantitative Echtzeit-PCR-Parameter waren 95 ° C für 10s als vorge denaturieren Schritt, gefolgt von 40 PCR-Zyklen von 95 ° C für 5 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 10 min. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung in jedem Versuch durchgeführt. Die relative Menge mRNA wurde unter Verwendung des Vergleichs CT-Methode berechnet nach der Normalisierung zu β -Actin-mRNA-Spiegel.

Western-Blotting-Analyse

Die Zellpellets wurden in Extraktionspuffer (50 mmol /L Tris-HCl homogenisiert , pH 6,8, 0,1% SDS, 150 &mgr; mol /L NaCl, 100 mg /l Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mg /l Aprotinin, 1% NP-40 und 0,5% Natriumorthovanadat), 30 min bei 4 ° C inkubiert und zentrifugiert für 20 min bei 12000 g /min. Gesamtprotein in dem Zelllysat wurde unter Verwendung des Bio-Rad kolorimetrischen Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen. Für Western-Blot-Analyse wurde Gesamt-Protein auf 10% SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulosemembranen übertragen (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), die mit den Antikörpern für α5-nAChR bei 4 ° C für 24 h inkubiert wurden, (1: 500, ab41173 oder ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat Nr: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat Nr: 2118-1), Caspase-3 (1: 500, Epitomics Cat Nr: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat Nr: 1017-1), Survivin (1: 500, Epitomics Cat Nr: 2463-1) und GAPDH (1: 1000; ab37168), dann Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Anti-Maus /Kaninchen-IgG-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) nach einer letzten Wäsche. Signale wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Kits (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK) nachgewiesen. GAPDH Ebene war ein interner Standard

RNA-Interferenz

Ein Doppelstrang-siRNA-Oligonukleotid CHRNA5 Targeting, die α5-nAChR kodiert, (Sinn. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', Antisense: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') wurde von Shanghai Genepharma Co. Ltd. (China) synthetisiert. Ein Paar von negativen Kontrolle siRNA wurde auch mit Sequenzen, die sich von siRNA-CHRNA5 und nicht homolog zu irgendwelchen Sequenzen gefunden in Genbank konstruiert (sense: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', Antisense: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). Die Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen ausplattiert. Wenn die Zellen 30-50% Konfluenz erreichten, wurden die siRNAs auf eine Endkonzentration von 50 nM mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Zell Viability Assay

Die Lebensfähigkeit der Zellen war durch das CCK8-Assay (Dojindo, Tokyo, Japan) bestimmt. Kurz gesagt, wurden bei den angegebenen Dosen mit Nikotin behandelt in 96-well-Platten ausplattiert Zellen (1500 Zellen /Vertiefung). Die Zellproliferationsassay wurde gut durch Inkubation für 2 h bei 37 ° C, gefolgt von der Zugabe von 10 ul CCK8-Lösung in jede durchgeführt. . Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplattenleser (Synergy 2 Multi-Mode Mikroplatten-Reader; BioTek, Winooski, VT, USA) gemessen

Annexin V /7-AAD-Färbung

BGC823 Zellen wurden bei Konfluenz in 6-Well-Gewebekulturplatten (Falcon, Becton Dickinson Labware) in einem vollständigen Medium kultiviert. Dann wurde das Medium durch frisches Vollmedium oder durch serumfreies Medium ersetzt; die Zellen wurden dann mit 100 &mgr; M Nikotin allein oder in Kombination mit 20 mM Cisplatin für 24 h auf der Basis unserer früheren Daten, mit Trypsin behandelt und zweimal mit PBS stimuliert. Die Zellen wurden gefärbt mit PE Annexin V /7-AAD markiert (7-aminoactinomycine-D) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Annexin V /7-AAD-Kit; Becton, Dickinson and Company). Kurz gesagt, wurde ein gewaschenes Zellpellet in 500 &mgr; l Bindungspuffer resuspendiert. Als nächstes wurden 5 ul Annexin-V-PE und 5 ul 7-AAD hinzugefügt. Durchflusszytometrieanalyse wurde unmittelbar nach Supravitalfärbung durchgeführt. Datenerfassung und Analyse wurden in einem Becton Dickinson FACS-Calibur Durchflußzytometer unter Verwendung der Cellquest-Software durchgeführt. Die Zellen in frühen Stadien der Apoptose waren AnnexinV positiv und 7-AAD negativ, während die Zellen in den späten Stadien der Apoptose sowohl AnnexinV waren und 7-AAD positiv.

Hoechst 33342 Färbung

Zellen wurden in 12-Well-Gewebekulturplatten ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen an Nikotin und Cisplatin behandelt. Am Ende jeder Inkubation wurden die Zellen für 20 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen und anschließend mit Hoechst 33342 (1 &mgr; g /ml) für 10 min inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) beobachtet. Mindestens 400 Zellen, die aus 12 zufällig ausgewählten Feldern pro Schale wurden gezählt, und jede Behandlung wurde dreimal durchgeführt.

Statistik Analyse

Das Ergebnis der Immunhistochemie analysiert wurde mit der χ ^{2 Test. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± S. D. aus Dreifachversuchen in einer parallelen Weise durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Bedeutung der Unterschied zwischen Kontrollgruppen und Nikotinbehandlungsgruppen wurde durch einen zweiseitigen Student-t-Test bestimmt. Die Unterschiede wurden als signifikant bei P < 0,05 oder P < 0,01.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Ein Lymph Node Staging System für Magenkrebs: ein Hybrid Basierend auf Topographische und Numerische Systems
• PLoS ONE: N-terminale Polypeptid von Annexin A2 Vermindert Infektion von Mycoplasma hyorhinis an Magenkrebs Cells