PLoS ONE: High-Mobility Group Box 1 Remt maagzweer genezing door Toll-like receptor 4 en Receptor voor Advanced Glycation End Products

Abstract

High-mobiliteit groep box 1 (HMGB1) werd aanvankelijk ontdekt als een nucleair eiwit dat een interactie aangaat met DNA als chromatine-geassocieerde niet-histon eiwit nucleosomen stabiliseren en de transcriptie van veel genen in de celkern regelen. Zodra gelekt of actief uitgescheiden in de extracellulaire omgeving, HMGB1 activeert ontstekingsreacties door het stimuleren van verschillende receptoren, waaronder Toll-achtige receptor (TLR) 2, TLR4 en receptor voor gevorderde glycatie eindproducten (RAGE), wat leidt tot weefselbeschadiging. Hoewel het vermogen HMGB1 om ontstekingen te induceren is goed gedocumenteerd, zijn er geen studies de rol van HMGB1 bij wondgenezing in het gastro-intestinale gebied onderzocht. Het doel van deze studie was de rol van HMGB1 en zijn receptoren bij de genezing van maagzweren evalueren. We onderzochten ook welke receptor onder TLR2, TLR4, of RAGE bemiddelt effecten HMGB1 op genezing van ulcera. Maagzweren werden geïnduceerd door serosale toepassing van azijnzuur bij muizen en gastrische weefsels werden bewerkt voor verdere evaluatie. De inductie van zweren verhoogd de immunohistochemische kleuring van cytoplasmatische HMGB1 en verhoogde serum niveaus HMGB1. Ulcus grootte, myeloperoxidase (MPO) activiteit, en de expressie van tumor necrosis factor α (TNF) mRNA een piek op dag 4. intraperitoneale toediening van HMGB1 vertraagde genezing van ulcera en verhoogde MPO-activiteit en TNFa expressie. Daarentegen toediening van anti-HMGB1 antilichaam bevorderd genezing van ulcera en verminderde MPO-activiteit en TNFa expressie. TLR4 en RAGE deficiëntie verbeterde genezing van ulcera verkleinde niveau van TNFa, terwijl genezing van de zweer in TLR2 knockout (KO) muizen was gelijk aan die van wild-type muizen. In TLR4 KO en RAGE KO muizen, leverde exogene HMGB1 geen invloed op de genezing van ulcera en TNFa expressie. Zo hebben we aangetoond dat HMGB1 is een complicerende factor bij de maagzweer genezingsproces, die werkt via TLR4 en RAGE overmatige ontstekingsreacties induceren.

Visum: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) High Mobility Group Box 1 Remt maagzweer genezing door Toll-like receptor 4 en Receptor voor Advanced Glycation eindproducten. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10.1371 /journal.pone.0080130

Editor: Mathias Chamaillard, INSERM, Frankrijk

Ontvangen: 29 mei 2013; Aanvaard: 30 september 2013; Gepubliceerd: 11 november 2013 |

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen:. Kenji Watanabe - Grant /Onderzoek Steun van de Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Spreken en Onderwijs: Abbott Japan Co., LTD. Yasuhiro Fujiwara - Spreken en Onderwijs: Eisai Co. Ltd Tetsuo Arakawa - raadgevende comités of Review Panels: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. De andere auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan. Dit betekent niet naleving van de auteurs te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen.

Introductie

High-mobiliteit groep box eiwit 1 (HMGB1), een lid van de high- mobiliteit groep eiwit superfamilie, is een nucleair eiwit [1]. HMGB1 interactie met DNA als chromatine-geassocieerde eiwitten nonhistone nucleosomen stabiliseren en de transcriptie van veel genen reguleren in de nucleus [2]. Wanneer gelekt uit een cel in necrotische celdood [3] of actief uitgescheiden in de extracellulaire omgeving door monocyten en macrofagen [3,4], HMGB1 werkt als een krachtige proinflammatoire Alarm in met eigenschappen [5].

De best bestudeerde HMGB1 receptoren zijn Toll-like receptor (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], en de receptor voor geavanceerde glycatie eindproducten (RAGE) [6,8]. TLR2 en TLR4 zijn leden van de familie TLR, en ze een cruciale rol in de aangeboren immuunrespons op pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen en-schade in verband moleculaire patroon moleculen [10] spelen. TLR2 herkent voornamelijk componenten van de grampositieve bacteriële celwand en TLR4 herkent voornamelijk lipopolysaccharide, dat het belangrijkste bestanddeel celwand van gram-negatieve bacteriën. Triggering TLR2 en TLR4 signaleringsroutes leidt tot de activering van de kernfactor KB (NF-KB), door het accessoire proteïne MyD88 en de daaropvolgende regulering van immuun- en inflammatoire genen, zoals inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor α (TNFa), met de activering van door mitogeen geactiveerde eiwitkinasen [11-13]. Receptor voor geavanceerde glycatie eindproducten (RAGE) is een multi-ligand receptor die behoort tot de immunoglobuline superfamilie [14]. Andere bekende RAGE liganden omvatten amyloïde [15] en S100 [16]. Meerdere experimenten hebben gesuggereerd dat de ligand-RAGE interactie activeert NF-KB en door mitogeen geactiveerde eiwitkinasen [17-20].

Veel pathologische aandoeningen hebben betrekking op de pro-inflammatoire eigenschappen van HMGB1. Eerdere rapporten aangetoond dat HMGB1 een cruciale rol in endotoxemie [21], acute pancreatitis [22], acute respiratory distress syndrome [23], sommige auto-immuunziekten [24], cerebrale ischemie letsel [25] en ischemie-reperfusie (IR) speelt verwondingen van de lever [26], het hart [27], en de nieren [28]. Wat het maagdarmkanaal, HMGB1 is een complicerende factor bij experimentele colitis [29,30], en niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel geïnduceerde dunne darm letsel [31].

Momenteel is de rol van HMGB1 bij wondgenezing is onduidelijk, maar het vermogen om ontstekingen te induceren is goed gedocumenteerd, zoals hierboven beschreven. In het gastro-intestinale gebied, heeft geen enkele studie de rol van HMGB1 bij wondgenezing onderzocht. Het doel van deze studie was de rol van HMGB1 in maagzweer genezing onderzoeken. We onderzochten de rol van HMGB1 bij het genezingsproces met een gevestigde experimentele chronische maagzweren model gemaakt knaagdieren door topicale toepassing van azijnzuur uit de maag serosale zijde. Het model nauw bootst de menselijke ulcus maagzweer in histologie en morfologie [32]. We hebben ook onderzocht of HMGB1 invloed op de genezing van ulcera door middel van TLR2, TLR4, of RAGE.

Materialen en methoden

Dieren

TLR2- en TLR4-knock-out (KO) muizen, die oorspronkelijk werden gegenereerd door Dr. S. Akira (Universiteit van Osaka, Osaka, Japan ) en teruggekruist 8 keer op een C57BL /6 achtergrond, werden verkregen van Oriental Bioservice, Inc. (Kyoto, Japan). RAGE-KO muizen, die teruggekruist had op een C57BL /6 achtergrond, werden oorspronkelijk gegenereerd door en een gift van Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japan). Wildtype C57BL /6-muizen werden aangekocht bij Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japan) als controlestam voor TLR2 KO KO TLR4 en RAGE KO muizen. Specifieke pathogeenvrije 12 weken oude mannelijke dieren gebruikt. Alle dieren werden ondergebracht in polycarbonaat kooien met papier chip beddengoed. De kooien bevonden zich in een van airconditioning voorziene biohazard kamer met een 12-uur licht-donker cyclus. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Osaka City University Graduate School of Medicine (Permit Number: 11.006). Alle operaties werden uitgevoerd onder isofluraan en alle inspanningen geleverd om het lijden te minimaliseren.

Experimental Inductie van Ulcer

Maagulcus werd geïnduceerd door een werkwijze in detail beschreven elders [33], met ondergeschikte modificaties . Kort samengevat, onder ether anesthesie de buik van de dieren werden ingesneden en de maag werd blootgesteld. Een polypropyleen buis (4 mm diameter) werd geplaatst tegen de serosale zijde van de maag. Een 80-pl aliquot van 60% azijnzuur werd aan de buis, die in contact met de serosale oppervlakte van 30 s werd gehouden toegevoegd. Na onmiddellijke verwijdering van azijnzuur uit de buis door afzuiging, werd de maag terug in de oorspronkelijke stand en de buik gesloten. Eerdere rapporten aangetoond dat de grootte van de maagzweren bereikte een maximum op dag 3 en 4 na inductie zweer, en daarna geleidelijk verlaagd [32,34]. De genezing van de experimentele fase maagzweren begint op dag 4 na inductie zweer

Experimental Groups

Om het effect van exogene HMGB1 onderzoeken, kregen muizen intraperitoneale injecties van recombinant humaan HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 gg /kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) of drager (fosfaatgebufferde zoutoplossing) tweemaal daags vanaf 4 dagen na inductie zweer (van dag 4 tot dag 9).

Vervolgens werd het effect van immunoneutralisatie van HMGB1 aan maagzweren genezing werd vastgesteld. Muizen werden intraperitoneaal toegediend kip neutraliserende anti-HMGB1 polyklonaal antilichaam (5 mg /kg; Shino-Test Corporation, Tokyo, Japan) of normaal chicken IgY (5 mg /kg, Sigma-Aldrich Co.) vanaf 4 dagen na inductie zweer ( van dag 4 tot dag 9). Bovendien, om het effect van de introductie van een remmer van HMGB1 bevestigen, werden ethylpyruvaat of medium tweemaal per dag geïnjecteerd, beginnend op dag 4 na inductie zweer.

Teneinde voorts de receptor verantwoordelijk voor HMGB1 gerelateerde maagzweer vastgesteld helen, maagzweren werden geïnduceerd in TLR2 KO, TLR4 KO, en RAGE KO muizen met of zonder intraperitoneale injectie van 1000 ug /kg rHMGB1 tweemaal daags begin op dag 4 na zweer inductie.

De maag werd verwijderd en de zweer grootte werd gemeten op dag 6 en 9 na inductie zweer. Maagzweer grootte werd uitgedrukt als een ulcus index, het product van de maximale lengte minimumlengte (d.w.z. maximale lengte vermenigvuldigd met minimale lengte). Studies werden uitgevoerd met 4-8 monsters. De monsters van de maag weefsel werden verwerkt voor verdere evaluatie.

mRNA expressie van ontstekingsmediatoren in Gastric Tissue bepaald door real-time kwantitatieve reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Real- time kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [35]. In het kort werd totaal RNA geïsoleerd uit intestinaal weefsel met behulp van een kit ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan) volgens het protocol van de fabrikant. Complementair DNA werd verkregen met een hoge capaciteit RNA naar cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) volgens het protocol van de fabrikant. Real-time kwantitatieve RT-PCR analyses werden uitgevoerd met een Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem en software (Life Technologies Corporation). Het reactiemengsel werd bereid volgens het protocol van de fabrikant met behulp van de Fast TaqMan Universal PCR Master mengsel (Life Technologies Corporation). Thermische cycli waren als volgt: 45 cycli van amplificatie bij 95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. Totaal RNA werd onderworpen aan real-time kwantitatieve RT-PCR voor het meten van doelgenen gebruik TaqMan glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase control reagentia (Life Technologies Corporation), die werden gebruikt als interne standaard. De expressie van mRNA coderend HMGB1, TLR4, RAGE, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine-1-bèta (IL-1β) en TNFa in zweren en normale gastrische weefsels werd gekwantificeerd met real time RT-PCR en gestandaardiseerd glyceraldehyde -3-fosfaatdehydrogenase mRNA. De expressie van elk mRNA wordt aangeduid als een verhouding ten opzichte van de gemiddelde waarde normaal maagweefsel. De primers en probes gebruikt voor RT-PCR zijn in Tabel 1 getoond
Gene
Primer en Sonde
TNF-αPrimer (voorwaarts) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Voorwaarts) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Voorwaarts) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Voorwaarts) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (reverse) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (voorwaarts) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Voorwaarts) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (reverse) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (voorwaarts) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (reverse) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. Primers en Probes.
CSV Download CSV

immunohistochemische en immunofluorescentie kleuring

weefselmonsters werden gefixeerd met 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) bevattende 4% paraformaldehyde. De monsters werden ingebed in paraffine en seriële-5 urn dikke secties werden gemonteerd op gesilaniseerde objectglaasjes (Dako, Tokyo, Japan). De monsters werden ondergedompeld in een oplossing van 3% H _{2O 2 in absolute methanol gedurende 5 minuten om endogene peroxidase activiteit te remmen en vervolgens geïncubeerd in 5% magere melk gedurende 10 min. Hematoxyline en eosine kleuring werd uitgevoerd voor de morfologische waarnemingen. Een konijn monoklonaal anti-HMGB1 antilichaam (verdund 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) werd als het primaire antilichaam en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met monsters. Een secundair antilichaam (Histofine Simple Stain MAX Peroxidase Kit; Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) werd geïncubeerd met de monsters gedurende 1 uur volgens de instructies van de fabrikant. Immunoreactiviteit werd gevisualiseerd door behandeling van de secties met Histofine Simple Stain en diaminobenzidine oplossing (Nichirei Biosciences Inc.). De specimens werden vervolgens tegengekleurd met hematoxyline. Vervolgens werd TLR2, TLR4 en RAGE expressie bepaald met een immunofluorescentie methode. De primaire antilichamen gebruikt immunofluorescentie kleuring omvatte een monoklonaal antilichaam tegen TLR2 (verdund 1: 200, Abcam), een muizen monoklonaal antilichaam tegen TLR4 (verdund 1: 200, Abcam), en een rat monoklonaal antilichaam tegen RAGE (verdund 1: 250; Abcam). Weefselmonsters, die werden bereid zoals hierboven beschreven, werden gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met primaire antilichamen en vervolgens met de overeenkomstige fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen (Abcam) gedurende 2 uur. De monsters werden onderzocht met een confocale microscoop uitgerust met argon en argon-krypton laserbronnen.}

Meting van Serum HMGB1 Levels

Blood (1000 pl) monsters werden in serumscheidingsbuisjes verkregen door het hart doorboren. Na centrifugeren bij 3000 rpm gedurende 10 minuten werd het serum verzameld en bewaard bij -80 ° C. Serumniveaus van HMGB1 werden gemeten met een sandwich ELISA kit HMGB1 (Shino-Test Corporation) volgens het protocol van de fabrikant.

Meting van Myeloperoxidase (MPO) activiteit

Methods gebruikt om MPO-activiteit te meten zijn in detail beschreven elders [36]. In het kort werden de monsters gehomogeniseerd in 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0) bevattende 0,5% hexadecyltrimethylammoniumbromide (Sigma Chemical Co.). Suspensies werden gecentrifugeerd en MPO activiteit in het resulterende supernatant werd bepaald met een spectrofotometer. Eén eenheid MPO activiteit werd gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 1 umol peroxide /min afgebroken bij 25 ° C. De resultaten worden uitgedrukt als eenheden per gram maagweefsel.

Statistische analyse

De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Enkele factoren variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt om de significantie van de verschillen tussen testen dosisgroepen en de resultaten werden geanalyseerd met Fisher's beschermde minst significante verschiltoets. P-waarden kleiner dan 0,05 werden als statistisch significant.

Resultaten

tijdsverloop van maagzweer Healing

Om het genezingsproces van maagzweren te evalueren, werd experimenteel maagzweer veroorzaakt door plaatselijke toepassing van azijnzuur uit de maag serosale kant . De zweren werden microscopisch geëvalueerd (Figuur 1A, 1B) en macroscopisch. De grootte van de zweren bereikte een maximum op dag 4 en verlaagde de tijd daarna (figuur 1C). MPO activiteit (figuur 1D) en de expressie van TNFa (figuur 1E) en IL-1β (figuur 1E) mRNA in de zwerende maagweefsel ook piek op dag 4 en hun niveaus waren hoger in zweren weefsel dan in normaal maagweefsel gehele examenperiode. Zweren verhoogde ook de expressie van VEGF mRNA (Figuur 1F).

HMGB1 Expression volgende Ulceratie

We next geëvalueerd of HMGB1 was betrokken bij maagzweer genezing. HMGB1 mRNA niveaus in de maag weefsel (Figuur 2A) en serum niveaus van HMGB1 (figuur 2B) bereikten hun maximum op dag 4. HMGB1 mRNA vrijwel constant tijdens de examenperiode waren, terwijl de serumspiegels van HMGB1 gedaald tot normale niveaus 6 dagen na de inductie van zweren. Immunohistochemisch, ulceratie geïnduceerde zichtbare cytoplasmische kleuring van HMGB1 in epitheelcellen, in het bijzonder verzwakte zones (Figuur 2C, 2D). Daarentegen, in intacte maagslijmvlies werd HMGB1 lokalisatie beperkt tot in de kernen van epitheelcellen (figuur 2E).

Effecten van exogeen HMGB1, HMGB1 immunoneutralisatie en Remming van HMGB1 release op maagzweer Healing

mRNA expressie en MPO-activiteit werden geëvalueerd op dag 6, en de zweer index werd geëvalueerd op dag 9 volgens het tijdsverloop studie. Muizen werd rHMGB1 of anti-HMGB1 antilichaam intraperitoneaal na de inductie van zweren. Toediening van rHMGB1 met een dosis van hetzij 100 ug /kg of 1000 ug /kg onderdrukte aanzienlijk maagzweer genezing (figuur 3A), die in verband met verhoogde MPO-activiteit (Figuur 3B) en TNFa mRNA expressie in zweren weefsels (Figuur 3C). Daarentegen HMGB1 neutraliserende antilichamen bevorderen genezing van zweren (figuur 4A) met verminderde MPO activiteit (figuur 4B) en TNF mRNA expressie (figuur 4C). De complicerende effect van exogene rHMGB1 op maagzweer genezing werd geannuleerd door gelijktijdige toediening van anti-HMGB1 antilichaam (Figuur 4F). Expressie van VEGF mRNA werd niet beïnvloed door behandeling met rHMGB1 (Figuur 3D, 3E) of anti-HMGB1 antilichaam (figuur 4D, 4E). In normaal maagweefsel toediening van rHMGB1 of anti-HMGB1 ook geen effect op cytokine expressie of MPO activiteit (gegevens niet getoond). Bovendien is de toediening van ethylpyruvaat, een remmer van HMGB1 release sterk bevorderd genezing van ulcera, tegenover dragerbehandeling. Healing ging gepaard met de onderdrukking van TNF-a mRNA expressie (gegevens niet getoond).

De rol van TLR2, TLR4 en RAGE in maagzweer genezing

Om te onderzoeken of TLR2, TLR4 en RAGE bijdragen to-HMGB1 gemedieerde maagzweer genezing, werden experimentele maagzweren geïnduceerd in TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO, en controle wild-type muizen. TLR4 en RAGE deficiëntie bevorderd gastrische ulceratie en voorkwam de toename van TNF mRNA expressie na ulceratie, terwijl TLR2 deficiëntie beïnvloed noch de ulcus index noch de expressie van TNFa mRNA (Figuur 5A, 5B). Toediening van exogeen HMGB1 beïnvloed noch de zweer index noch de expressie van TNFa mRNA in ofwel TLR4 KO of RAGE KO muizen (Figuur 5C-5F). Toediening van exogeen HMGB1 echter vertraagde genezing van de zweer in wild-type muizen en verlaagde TNF mRNA expressie (figuur 3).

De expressie van TLR2, TLR4 en RAGE tijdens maagzweer Healing

Vervolgens onderzochten we mRNA expressie en immunoreactiviteit van TLR2, TLR4 en RAGE in wild-type muizen. Een significante opregulatie van TLR2 mRNA waargenomen na inductie van een maagzweer (figuur 6A). TLR2 immunoreactiviteit waargenomen hoofdzakelijk in inflammatoire cellen (Figuur 6B). De expressie van TLR4 mRNA werd niet beïnvloed door de inductie van zweer (figuur 6C). TLR4 immuunreactiviteit werd waargenomen in het apicale deel van het epitheel aan de wondrand en sommige ontstekingscellen in de zweer bed (figuur 6D).

Een aanzienlijk opregulatie van RAGE mRNA werd waargenomen op dag 9 na de inductie van zweren (figuur 6E). RAGE immunoreactiviteit werd voornamelijk gezien in ontstekingscellen aan de rand van de zweer bedden en in de vasculaire endotheliale celmembraan (figuur 6F).

Kleuring van zwerende weefsel van TLR4 KO of RAGE KO muizen met een anti-TLR4 antilichaam of anti-RAGE-antilichaam onthulde geen positieve signalen, hetgeen de specificiteit van deze antilichamen (gegevens niet getoond).

Discussie

In deze studie hebben we aangetoond dat exogene HMGB1 vertragingen maagzweer genezing, terwijl het induceren TNFa expressie en MPO-activiteit. Omgekeerd immunoneutralisatie van HMGB1 of remmen van de vrijlating van HMGB1 bevordert de genezing van ulcera terwijl het verminderen van TNFa expressie en MPO-activiteit. Bovendien, TLR4 en RAGE-deficiëntie bevordert de genezing van ulcera en exogene HMGB1 niet in slaagt om de genezing van ulcera vertraging in TLR4 KO en RAGE KO muizen. Deze resultaten suggereren dat HMGB1 is een complicerende factor voor maagzweer genezing die door middel van TLR4- en RAGE-afhankelijke trajecten werkt. Voor zover wij weten is dit het eerste verslag om de rol van HMGB1 bij wondgenezing duidelijk in het maagdarmkanaal.

Enkele studies gericht de rol van HMGB1 bij wondheling anders dan het maagdarmkanaal organen, maar de resultaten van deze onderzoeken zijn controversieel [37-40]. Consistent met onze resultaten, sommige studies aangetoond dat HMGB1 heeft een remmend effect op wondgenezing [37,38]. Zhang et al. aangetoond dat HMGB1 schaadt incisie wondgenezing door het verminderen van herstellende van collageen afzetting via RAGE [37]. Goova et al. aangetoond dat het blokkeren van RAGE liganden zoals AGE en HMGB1 door een oplosbare vorm van de receptor voor AGE (sRAGE) versnelt de genezing van ulcera en onderdrukt de niveaus van inflammatoire cytokines [38]. Eerdere studies toonden aan dat overmatige ontsteking verminderde wondgenezing. Bijvoorbeeld, onze eerdere studie toonde aan dat TNFa overexpressie en overmatig neutrofielinfiltratie complicerende factoren bij de vorming en genezing van maagzweren [41]. Verder in een ander model van weefselherstel, Goren et al. aangetoond dat overmatige neutrofielen en macrofagen infiltratie met TNFa overexpressie remt de genezing van de huid van muizen verwondingen [42]. Aldus is het mogelijk dat HMGB1 vertraagt ​​maagzweer genezing door TNFa veroorzaakt ontstekingsreacties.

In tegenstelling tot sommige in vitro studies suggereerden dat HMGB1 en zijn receptoren zijn essentieel voor de wondgenezing [39,40]. Staraino et al. aangetoond dat HMGB1 versnelt het wondgenezingsproces en regeneratie door verbetering van de migratie van keratinocyten en huidfibroblasten [39]. HMGB1 bevordert ook de wondgenezing 3T3 fibroblasten door het induceren van proliferatie en migratie van cellen door activering van de RAGE /extracellulair signaalgereguleerde kinase pathway [40]. Omdat deze in vitro studies werden uitgevoerd in de afwezigheid van ontstekingscellen, kunnen de verschillen in experimentele methoden incoherentie conclusies over de rol van HMGB1 bij wondgenezing.

VEGF, een krachtige angiogene groeifactor, speelt een belangrijke rol in maagzweer genezing [43,44]. Eerdere rapporten toonden aan dat HMGB1 de expressie van VEGF in verschillende weefsels en diermodellen [45-47] zou kunnen veroorzaken. Echter, in deze studie niet rHMGB1 noch anti-HMGB1 antilichamen getroffen VEGF expressie in weefsels ulcerosa. De reden voor het verschil tussen onze bevindingen en die van eerdere onderzoekers is onduidelijk, maar het kan worden geassocieerd met het gebruik van verschillende organen en experimentele modellen.

Er zijn 2 mogelijke bronnen van extracellulaire HMGB1: passieve vrijlating uit necrotische cellen [48] en actieve secretie van inflammatoire [5] cellen. In deze studie werd HMGB1 immunoreactiviteit waargenomen in het cytoplasma en de kern, wat suggereert dat necrotische cellen een bron van HMGB1. Gastric HMGB1 mRNA niveaus stegen tijdens de genezing van ulcera, wat erop wijst dat ontstekingscellen produceren en laat HMGB1. Collectief, de verhoging van serum HMGB1 leidde was te wijten aan passief vrijlating uit de beschadigde cellen in de maagzweer en actieve secretie van ontstekingscellen.

Serum HMGB1 levels verhoogd naar aanleiding van de inductie van een maagzweer, maar daalde in de late fase van genezing, hoewel de expressie van HMGB1 en TNFa bleef hoog. Deze gegevens verhogen de mogelijkheid van een systemische HMGB1 opvangsysteem. Daartoe heeft het bestaan ​​van een HMGB1 bindingseiwit gerapporteerd. Trombomoduline een celoppervlak glycoproteïne, is een voorbeeld van een HMGB1 bindingseiwit. Recombinant humaan oplosbaar trombomoduline remde de toename in plasma HMGB1 geïnduceerd door lipopolysaccharide in een rattenmodel [49] en gebonden aan HMGB1 via de lectine domein [50] om te voorkomen HMGB1 interageren met andere receptoren [51]. In klinische toepassingen trombomoduline is ook nuttig in HMGB1-gerelateerde ziekten en aandoeningen zoals sepsis vanwege zijn anti-HMGB1 eigenschappen [52]. sRAGE, die in het bloed, is een ander voorbeeld van een HMGB1 bindingseiwit. sRAGE is de oplosbare vorm van RAGE; het fungeert als decoy interactie tussen RAGE celoppervlak en liganden, zoals HMGB1 [53] te voorkomen. In deze studie, zou het ook vangsystemen een beschermende rol spelen bij het voorkomen van de verspreiding van de ontsteking, waardoor genezing van de zweer te bevorderen.

Het is bekend dat veel maagzweer patiënten die besmet zijn met Helicobacter pylori
. Hoewel in de huidige studie hebben we niet onderzocht de rol van HMGB1 in maagzweer genezing in muizen geïnfecteerd met H. pylori
, klinische en experimentele studies suggereren dat de schadelijke werking van HMGB1 op maagzweren genezing meer uitgesproken bij patiënten zou zijn met een H. pylori
infectie dan in die zonder. We hebben eerder toonden aan dat H. pylori
infectie verhoogt neutrofielen infiltratie in zweren weefsels in Mongoolse woestijnratten [54]. Shimizu et al. ook aangetoond dat neutrofielen en macrofagen infiltreren ulcus een hogere mate bij patiënten met H. pylori
infectie dan bij mensen zonder de infectie [55]. Een grote hoeveelheid HMGB1 is daarom waarschijnlijk aanwezig in de zwerende weefsel geïnfecteerd met H. pylori
, daar dit wordt uitgescheiden door de ontstekingscellen. Bovendien Radin et al. gemeld dat VacA, een belangrijke virulentiefactor van dit organisme veroorzaakt geprogrammeerde necrose van maagepitheelcellen en daaropvolgende afgifte van HMGB1 [56]. Zo verwachten wij dat de schadelijke van HMGB1 op genezing van de zweer duidelijker bij H zou zijn. pylori
geïnfecteerde patiënten.

TLR2, TLR4 en RAGE, die pro-inflammatoire reacties bemiddelen, zijn algemeen bekend HMGB1 receptoren. Onze resultaten toonden duidelijk aan dat TLR4 en RAGE spelen een cruciale rol in maagzweer genezing. Dit resultaat is consistent met eerdere bevindingen over de ontstekingsreacties geïnduceerd door HMGB1. Een van de bestaande modellen waarbij de interactie tussen HMGB1 en deze receptoren I-R schade. In de lever I-R schade, TLR4-deficiënte muizen vertoonden minder lever I-R schade; de schade TLR4-deficiënte muizen werd niet beïnvloed door rHMGB1 of anti-HMGB1 antilichaam [26]. Bovendien, het blokkeren van RAGE beschermd tegen hepatocellulaire dood en necrose in de lever I-R schade model [57]. In een model van cardiale I-R schade, Andrassy et al. toonde aan dat RAGE-deficiënte muizen getoond slechts een lichte ontsteking als gevolg van cardiale I-R schade; ontsteking werd niet beïnvloed door de inductie van rHMGB1 [27]. Deze bevindingen suggereren dat de TLR4-HMGB1 en RAGE-HMGB1 interacties spelen een cruciale rol in I-R schade, hoewel het noodzakelijk om de verschillen in elk orgaan overwegen. De andere gevestigde model is systemische ontsteking, zoals sepsis [5,8,58]. In een experimenteel model van intra-abdominale sepsis, Susa et al. aangetoond dat de HMGB1-RAGE interactie nauw werd geassocieerd met sepsis geïnduceerde middenrif disfunctie [58]. In een in vivo systemische inflammatie model gegenereerd door injectie van exogene HMGB1, Zoelen et al. aangetoond dat HMGB1 induceert het vrijkomen van cytokines, activatie van stolling en neutrofielen werving door middel van TLR4 en RAGE [8]. Zo TLR4 en RAGE spelen cruciale rol in de pathogenese gemedieerd door de HMGB1-geassocieerde route, met inbegrip van de weg in onze genezing van ulcera model.

Onze resultaten geven aan dat TLR2 heeft geen relatie met een maagzweer genezing: genezing van ulcera in TLR2 KO muizen leek op die in wild-type muizen. Hoewel in vitro onderzoek met macrofaag cellijnen gaf aan dat de TLR2-HMGB1 route induceert ontstekingsreacties [6,9], in vivo effecten van TLR2 in HMGB1-gemedieerde pathologieën zijn niet gemeld. Dus, op basis van eerdere bevindingen [8] en onze resultaten, de HMGB1-TLR2 route kan een kleine rol in de reparatie en de pathogenese van delen letsels en ontsteking spelen.

Concluderend, hebben wij aangetoond dat HMGB1 is een complicerende factor bij het genezingsproces van maagzweren en andere pathologische aandoeningen. Bovendien hebben we aangetoond dat HMGB1 remt de genezing van maagzweren door een mechanisme dat TLR4, RAGE en overmatige ontstekingsreacties omvat. Hoewel proton pomp remmers vaak worden voorgeschreven voor maagzweren, hardnekkige zweren vormen nog steeds een klinisch probleem. Onze studie ondersteunt een nieuw concept voor de behandeling van hardnekkige maagzweren, naast proton pomp inhibitoren therapie.

Dankwoord

Wij danken Emi Suzuki-Yoshioka voor technische ondersteuning. Ik zou ook graag mijn oprechte dank betuigen aan de medewerkers van de Osaka City University die ons gesteund.

• PLoS ONE: Mangiferin vermindert maagzweer in ischemie /reperfusie Rats: Betrokkenheid van PPAR-γ, NF-KB en Nrf2 /HO 1-signaalwegen
• PLoS ONE: Nee Vereniging van koffieconsumptie met een maagzweer, darmzweren, refluxoesofagitis, en Non-Erosieve Reflux Disease: Een cross-sectionele studie van 8013 gezonde proefpersonen in Japan