MicroRNA-144 remt de uitzaaiing van maagkanker door zich te richten BMO expression

MicroRNA-144 remt de uitzaaiing van maagkanker door zich te richten BMO expressie
De abstracte Maagkanker (GC) blijft een van de meest voorkomende vormen van kwaadaardige kanker, en het moleculaire mechanisme achter de metastase is nog grotendeels onduidelijk. MicroRNAs zijn als belangrijke regulatoren van uitzaaiingen ontstaan ​​vanwege hun vermogen om te handelen op meerdere signaalroutes. In onze studie vonden we dat miR-144 significant neerwaarts gereguleerd in zowel zeer metastatische GC cellijnen en weefsels. De resultaten van beide gain-of-functie en loss-of-function experimenten tonen aan dat verhoogde miR-144 expressie aanzienlijk verminderd GC celmigratie, terwijl miR-144 expressie drastisch verbeterde GC celmigratie afgenomen. De met proto-oncogen (MET), die vaak in humane kankers en functies geamplificeerd als een belangrijke regulator van celgroei en tumorinvasie, werd geïdentificeerd als een direct doelwit van miR-144. Bovendien silencing van BMO gebruik van kleine interfererende RNA (siRNA) herinnerd aan de anti-metastatische functie van miR-144, terwijl het herstel van BMO expressie verzwakt de functie van miR-144 in GC cellen. Verder vonden we dat miR-144, door zich te richten BMO, onderdrukt fosforylering van Akt. Tenslotte zagen we een omgekeerde correlatie tussen de expressie van miR-144 en MET mRNA in GC metastatische weefsels. Samengevat, miR-144 GC progressie onderdrukt door direct neerwaarts reguleren MET expressie, die vervolgens voorkomt activering van het pro-oncogene Akt pathway. Herinvoering van miR-144 expressie in GC cellen is een aantrekkelijke therapeutische benadering van de metastase van maagkanker te blokkeren.
Sleutelwoorden
microRNA miR-144 BMO Maagkanker Metastases Inleiding
Globally, maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende vormen van maligne aandoeningen. In 2008 werden ongeveer 989.600 nieuwe gevallen van GC gediagnosticeerd. Verder GC werd betrokken als een oorzaak van 738.000 sterfgevallen, het maken van GC de vierde meest voorkomende kanker en de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. Als de tumor vordert, ontwikkelt het vermogen tot omringende weefsels binnen te dringen en metastaseren. De hepatocyt groeifactor receptor, MET, is bekend dat de beweeglijkheid en invasieve vermogen van tumorcellen bevorderen [2]. MET is een lid van de receptor tyrosine kinase familie en is aangetoond dat opgereguleerd in veel tumoren [3-5]. Er wordt gesuggereerd dat BMO expressie wordt verhoogd door ofwel genamplificatie of hypoxie via HIF1α. Bij patiënten met metastatische GC, BMO versterking en sterke eiwitexpressie zijn niet zeldzaam. Deze gebeurtenissen blijken significant geassocieerd met slechte klinische uitkomst [6]. Ongeveer 10% van de blanke patiënten haven een winst van vijf of meer exemplaren van BMO. Bovendien wordt deze winst in BMO aantal kopieën significant geassocieerd met een ongunstige prognose [7]. Bovendien hebben de miR-34a /c microRNAs is aangetoond dat negatief moduleren BMO expressie in cellijnen die zijn afgeleid van prostaatkanker, leverkanker en GC [8-10].
MicroRNAs (miRNAs) zijn niet-coderende RNA-moleculen, ongeveer 21-23 nucleotiden lengte, die genexpressie reguleren op het transcriptionele of post-transcriptioneel niveau [11-13]. miRNA expressieprofielen analyses globale downregulatie van rijpe miRNA niveaus in tumoren ten opzichte van normale weefsels [14] geopenbaard. Bovendien kunnen miRNAs functioneren in ofwel een tumor suppressor of oncogene rol, afhankelijk van de functie van hun doel. Bijvoorbeeld, miR-133b significant neerwaarts gereguleerd GC weefsels en oefende de tumor suppressor rol GC-cellen [15]. Expressie van miR-337-3p was significant neerwaarts gereguleerd in lymfeklier metastatische weefsels van GC patiënten, en inductie van miR-337-3p expressie deed verminderen maagkanker cel invasie capaciteit [16]. miR-25 bevordert GC progressie door direct neerwaarts reguleren TOB1 meningsuiting; derhalve verhoogde expressie van miR-25 een potentieel noninvasive biomarker voor de prognose van patiënten GC [17]. Bovendien wordt miR-7 significant neerwaarts gereguleerd in zowel zeer metastatische GC cellijnen en metastatische weefsels. Overexpressie van miR-7 aanzienlijk remt GC metastase door richt de expressie van het insuline-achtige groeifactor-1 receptor (IGF1R) oncogen [18]. In GC cellijnen, herinvoering van miR-144 expressie resulteert in onderdrukking van ZFX, die een matige verhoging van kankercel gevoeligheid voor 5-fluorouracil chemotherapie. In 93 gevallen van primaire GC, verminderde miR-144 expressie is geassocieerd met een slechte prognose [19]. Deze voorbeelden hebben gewezen op de belangrijke rol van miRNAs in GC kwaadaardigheid en de progressie van kanker.
In deze studie hebben we kenmerkten de doelstellingen en definieerde de werkingsmechanisme van miR-144 in GC. Door het induceren van ectopische expressie van miR-144, ontdekten we een BMO is een nieuw target van miR-144 regelgeving. Deze bevinding werd bevestigd aan beide mRNA en eiwit niveaus, en reporter gen luciferase assays geverifieerd directe binding van miR-144 aan de regelgevende bindingsplaats in de 3'UTR van BMO. Verder vonden we dat een BMO expressie omgekeerd correleert met miR-144 levels in een kleine, maar goed gedocumenteerde GC cohort. Onze hypothese is dat miR-144 remt GC metastase, en dat sommige van deze inhibitie wordt gemedieerd door targeting MET expressie.
Materialen en werkwijzen
menselijke weefselmonsters en cellijnen
GC-monsters werden verzameld van patiënten die een operatie ondergaan aan de Fudan Universiteit in Shanghai Cancer Center tussen 2012 en 2013. het protocol werd goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van Fudan University, en het onderzoek werd overeenkomstig de bepalingen van de Verklaring van Helsinki van 1975. Alle monsters werden verkregen met de informed consent uitgevoerd van de patiënten. De menselijke GC cellijn AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™) NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), en KATO III (ATCC® HTB-103 ™) werden in DMEM dat 10% foetaal runderserum gehandhaafd. Alle cellijnen werden in medium bevattende penicilline (100 IU /ml) en streptomycine (100 mg /ml) bij 37 ° C met 5% CO2 gehandhaafd. Het miRNA bootst en remmers werden gekocht van Ambion (Austin, TX, USA).
RNA-extractie en real-time PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen met behulp van TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Voor miRNA analyse werden poly (A) staarten toegevoegd aan totale RNA met behulp van poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) voorafgaand aan omgekeerde transcriptie. De MiRcute miRNA qPCR detectie kit (TIANGEN, Beijing, China) werd gebruikt om de expressie van miR-144 te kwantificeren volgens het protocol. De volgende PCR-condities werden toegepast: 95 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 31 s. De hoeveelheid doel (BMO /miR-144), genormaliseerd naar de endogene housekeeping gen GAPDH /U6snRNA en ten opzichte van een referentie-monster, wordt gegeven door de volgende vergelijking: hoeveelheid target = 2- △△ CT
Microarray hybridisatie.
kort RNA monsters werden gebruikt voor het dubbelstrengs complementaire DNA (cDNA), en synthetiseren dubbelstrengs cDNA werd gemerkt en gehybridiseerd met de Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Na hybridisatie en wassen werden verwerkt objectglaasjes gescand met de Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-waarde werd berekend met de gepaarde t-test. De set-up- en down-gereguleerde genen drempel was een fold change > 2.0 en een p-waarde < 0,05. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd op basis van differentieel tot expressie genen en miRNAs met behulp van Cluster Treeview software van Stanford University (Palo Alto, CA).
MiRNA-genetische netwerk
Wij geconstrueerd het netwerk nabijheid tussen twee genen, i en j, gedefinieerd als een vermogen van de Pearson correlatie tussen de overeenkomstige gen-expressie profielen, xi en xj. De adjacentiematrix, M (i, j), werd gevisualiseerd als een grafiek en de topologische eigenschappen van deze grafiek werden onderzocht. (; 0.98 >) werden in deze renderings getrokken om een ​​visuele representatie, alleen de sterkste correlaties te maken. In miRNA-gen netwerken, elk gen overeenkomt met een knoop. Twee genen zijn verbonden door een rand, wat wijst op een sterke correlatie. Binnen het netwerk analyse, een diploma is de eenvoudigste, meest belangrijke maatstaf voor de centrale rol van een gen in een netwerk en bepaalt het relatieve belang. Een graad wordt gedefinieerd als het aantal direct gekoppeld buren
Voorspelling van miR-144 bindingsplaats
Vermoedelijke miR-144 bindingsplaatsen in onvertaalde gebied BMO mRNA 3 'werden voorspeld door het programma Target Scan (http:. //www.targetscan.org). Positie 1430-1436 van MET 3 'UTR heeft een geconserveerd bindingsplaats voor miR-144 richt.
Plasmid transfectie
De ORF sequenties van BMO uit genoom DNA geïsoleerd uit de SNU-5-cellijn werden versterkt en werden vervolgens gesubkloneerd in de Plenti vector. Het plasmide werd getransfecteerd in SNU-5-cellen met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Na 24 uur werden de cellen gebruikt voor een reddings experiment.
Oligonucleotide transfectie
MiR-144 bootst, miR-144 remmer (anti-miR-144), en MET siRNA (siRNA-MET) werden gesynthetiseerd door Genepharma , Shanghai, China. Oligonucleotide transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De eindconcentratie van miR-144 bootst, anti-miR-144 of siRNA-MET in het transfectiesysteem was 100 nM. Transfectie-efficiëntie voor de interne en gecotransfecteerde studies werd bepaald met behulp van fluorescentie microscoop.
Immunoblottingtest
equivalente hoeveelheden van cellysaten werden opgelost door 7% SDS /PAGE en werden overgebracht naar polyvinylideenfluoride membranen. Het membraan werd geïncubeerd met een konijn polyklonaal anti-MET-antilichaam (1: 500, Abcam, ab47431), een geit polyklonaal anti-Adam-12 antilichaam (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747), en een konijn polyklonaal anti-Versican antilichaam (1 ug /ml, Abcam, ab19345). IRdye-gelabelde secundaire antilichamen werden gebruikt voor kwantificering van de immunoblotting signaal en de signalen werden geanalyseerd met een Odyssey scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNA-ChIP assay
RNA-eiwitinteracties worden gefixeerd met formaldehyde en chromatine afschuiving wordt gecombineerd met DNase behandeling RNA /eiwitcomplexen die kan worden immunogeprecipiteerd met antilichamen tegen mET eiwitten verkregen. Cross-koppelingen worden vervolgens omgedraaid; RNA teruggewonnen en opnieuw behandeld met DNase om de afwezigheid van DNA te waarborgen. RNA geprecipiteerd uit het immuuncomplex vervolgens worden geanalyseerd door real-time PCR. In dit RNA-ChIP assay, de volgende formule worden gebruikt:% van de input (herstel) = AE (Ct input-Ct monster) * Fd * 100%. Hier, AE is de amplificatie-efficiëntie (10 (-1 /helling)) en Fd is een verdunningsfactor van de input RNA om het verschil in de hoeveelheden RNA-ChIP monster en input RNA gebruikt voor real-time PCR evenwicht.
Luciferase assay
volledige 3'UTR BMO werd geamplificeerd met PCR met gebruik SNU-5 cDNA als matrijs en gekloneerd in pGL3 controlevector. We gebruikten Quick Change mutagenese de miR-144 vermoedelijke bindingsplaats muteren (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 cellen en AGS-cellen werden getransfecteerd met miR-144 bootst /remmers en pGL3 luciferase reporter constructen herbergen de BMO 3'UTR. Na 24 uur werden de activiteiten van vuurvlieg luciferase en Renilla luciferase in de cellysaten gemeten met de Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Migratie assays
Voor de transwell migratie assays, 1 × 105 cellen werden uitgeplaat in de bovenste kamer met een niet-bekleed membraan. De cellen werden uitgeplaat in serumvrij medium, en medium aangevuld met 10% (v /v) serum werd gebruikt als een chemoattractant in de onderste kamer. De cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een weefselkweek incubator met 5% (v /v) CO2. Na 16 uur werden de niet-gemigreerde cellen verwijderd uit de bovenzijde van de transwell membraanfilter inserts. De gemigreerde cellen op de onderzijden van de inserties werden gekleurd met Coomassie brilliant blue en de cellen werden geteld.
Celproliferatie assay
de getransfecteerde cellen in 96-putjes platen werden geënt bij een dichtheid van 1 x 104 cellen /goed. Een celproliferatie assay werd uitgevoerd met de Cell Counting kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Vóór de toevoeging van CCK-8 werden de cellen met warm kweekmedium gewassen door het draaien van de plaat bij 500 rpm gedurende 3 m en werp de supernatant
Primers
De volgende primers werden gebruikt voor real-time PCR.: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL voorwaartse primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, reverse primer: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; BMO voorwaartse primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, reverse primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A voorwaartse primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverse primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; Adam-12 voorwaartse primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverse primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN voorwaartse primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, reverse primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. De volgende primers werden gebruikt voor het volledige BMO 3UTR toepassing: MET 3'UTR voorwaartse primer: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, een BMO 3'UTR reverse primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Het siRNA nucleotide voor BMO werd gebruikt als volgt: siRNA-MET forward: 5-GUGCC ACUAA Cuaca UUUAU U-3, siRNA-MET omgekeerde:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Statistische analyse
De resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM, en de gegevens werden geanalyseerd met Student's t-test. Een waarde van p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
MicroRNA expressieprofiel bij maagkanker
Vergelijking van peritoneale metastatische weefsels met gekoppelde primaire brandpunten monsters GC gebruik hiërarchische clustering analyse onthulde systematische variatie in de expressie van miRNAs en genen (Fig 1A en B). Onze gegevens suggereren dat een set van miRNAs en genen wordt vaak afwijkend tot uitdrukking in de peritoneale metastatische weefsels van GC. Daarnaast vonden we ook dat sommige eerder goed gebleken moleculen zoals miR-7 [18], miR-25 [17], en TOB1 IGF1R werden niet geïdentificeerd in onze microarrays. We vonden deze verschillen kunnen worden geïnduceerd door de diversiteit van klinische monsters afkomstig uit verschillende gebieden. Figuur 1 Core miRNA-gen netwerk, inclusief 8 sleutel miRNAs en hun doelstellingen. Hiërarchische clustering analyse van miRNAs 27 (A) en 32 genen (B) die differentieel tussen metastatische weefsels werden uitgedrukt in de peritoneale en gepaarde primaire monsters van GC (meer dan 2,0-voudig; p < 0,05). Expressie waarden zijn weergegeven in de kleuren rood en groen, wat betekent expressie boven en onder de mediaan expressiewaarde voor alle monsters. (C) Het miRNA-genetische netwerk toont de verhoudingen tussen 8 key miRNAs en tumor-geassocieerde genen ze voorspeld reguleren. De kleuren geven de geannoteerde expressieniveaus van de miRNAs en genen.
Het miRNA-gen-netwerk werd geassembleerd met gepoogd de belangrijkste miRNAs die tumor-geassocieerde genexpressie reguleren tijdens de progressie van tumor metastase. Omdat co-expressie modules waarschijnlijk overeen met biologische routes, hebben we ons gericht op co-expressie modules die worden geassocieerd met een hoog aantal eiwitcoderende genen. Bovendien NCBI RefSeq de functies van vele genen, die onze identificatie van GC-geassocieerde genen geholpen. Bij deze methode kenmerk we de rol van miR-144 in de peritoneale metastatische foci van GC. In de co-expressie kanker netwerk wordt miR-144 aangesloten 6 eiwitcoderende genen die betrokken zijn bij tumorgroei en metastase (figuur 1C).
Regulerende rol van miR-144 in maagkanker metastase Belgique Om te onderzoeken buitenspiegels 144 functie onderzochten we eerst miR-144 niveaus in een panel van 6 menselijke GC cellijnen. Zoals getoond in Figuur 2A, selecteerden we AGS, met het kenmerk opgereguleerd miR-144 en SNU-5, met het kenmerk gedownreguleerd miR-144, voor verdere studie. De AGS-cellijn werd afgeleid van maagtumor fragmenten die werden weggesneden uit een patiënt die geen voorafgaande therapie hadden gekregen, terwijl de SNU-5 werd verkregen uit ascites van een patiënt met een slecht gedifferentieerd carcinoom van de maag. Figuur 2 MiR-144 onderdrukt de migratie van cellen GC. (A) expressie van miR-144 werd gecontroleerd in een panel van 6 menselijke GC cellijnen middels real-time PCR-methode. (B) Migratie van SNU-5 cellen behandeld met miR-144 bootst werd gecontroleerd met behulp van niet-Matrigel behandeld Transwell kamer. (C) Migratie van AGS cellen behandeld met een miR-144 remmer werd gecontroleerd met behulp van niet-Matrigel behandeld Transwell kamer. (*** P < 0,001).
In ons onderzoek zagen we een nauwe samenwerking tussen miR-144 verlies en uitzaaiingen in GC (figuur 1A en C). Dienovereenkomstig, hebben eerdere studies miR-144-gebaseerde remming van de tumorcel migratie en invasie in epitheliale plaveiselcelcarcinoom gedocumenteerd. Onze hypothese was dat herinvoering van miR-144 expressie zou onderdrukken kankercel migratie. Geschikt is de invoering van miR-144 expressie remde celmigratie in SNU-5 (Figuur 2B). Vergeleken met SNU-5, AGS cellen hebben een relatief hogere endogene miR-144 expressie. Zoals te verwachten, remming van miR-144 steeg AGS celmigratie (Figuur 2C). In feite, voerden we ook de invasie assay met behulp van Matrigel behandelde Transwell, en er geen verschil voor invasieve vermogen van SNU-5 /AGS cellen na behandeling met miR-144 /anti-miR-144 (gegevens niet getoond). Deze resultaten blijkt dat miR-144 speelt een belangrijke rol bij de migratie, maar niet bij de invasie van GC cellen.
MiR-144 beïnvloedt MET expressie
Door de ectopische expressie van miR-144 in SNU-5 cellen, bepaalden wij Adam-12 , VCAN en marktgericht bedrijf zijn vermeende miR-144 targets. Zoals getoond in figuur 3A, miR-144 expressie dramatische invloed op de mRNA niveaus van Adam-12, VCAN en MET. Adam-12, VCAN en MET eiwit expressie niveaus werden ook gedetecteerd door middel van western blot in kankercellen getransfecteerd met miR-144 bootst. Zoals getoond in figuur 3B, slechts MET eiwitniveaus werden neerwaarts gereguleerd door miR-144. Dit geeft aan dat miR-144 beïnvloedt BMO uitdrukking op het transcriptionele niveau, misschien door splitsing of destabilisatie van het mRNA structuur. Echter, we vonden ook de Adam-12 en VCAN eiwit niveaus zijn niet afgenomen door exogene introductie van miR-144. We vonden dat mRNA en eiwitniveaus niet direct kan worden gecorreleerd door verschillende halfwaardetijd. Ook vonden ze toonden dat kan worden veroorzaakt door de aanwezigheid van miR-144 die continu werd onderdrukken vertaling in een geval maar niet de andere. De MET: miR-144 interactie werd ook gedemonstreerd in levende cellen door RNA-CHIP test. In feite werd endogeen miR-144 sterk verband met endogene MET anti-MET maar niet anti-IgG immunoprecipitaten van cellen (Figuur 3C). Figuur 3 Expressie van BMO werd geregeld door miR-144. (A) mRNA niveaus van vermeende miR-144 targets werden onderzocht door real-time PCR in SNU-5-cellen die met miR-144 bootst of miR-NC. (B) Protein niveaus van vermeende miR-144 targets werden onderzocht door western blotting in SNU-5-cellen die met miR-144 bootst of miR-NC. (C) De% ingang terugvorderingen van de RNA-ChIP reacties illustreert de verrijking door BMO antilichaam. RNA-chip test voor miR-144 uitgevoerd op anti-MET antilichaam uit lysaten van de cellen. RNA-chip met een niet- in IgG dienden als controles. (D) Een schematische afbeelding van de voorspelde miR-144-bindingsplaats in het 3'UTR van MET. (E) SNU-5-cellen werden tijdelijk gecotransfecteerd met LUC-MET 3'UTR en miR-144 nabootsen. (F) AGS cellen werden tijdelijk gecotransfecteerd met LUC-MET 3'UTR en miR-144 remmer. (G) het muteren van de miR-144 bindingsplaats in BMO 3'UTR schafte de miR-144-geïnduceerde luciferaseactiviteit onderdrukking. Luciferase-activiteit werd gemeten na 24 uur en genormaliseerd naar de gecotransfecteerde Renilla. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Met behulp van bioinformatica-gebaseerde analyse, identificeerden we een enkele miRNA bindingsplaats voor miR-144 in de 3 'UTR van BMO mRNA (Figuur 3D). Om te testen of miR-144 rechtstreeks bindt de 3'-UTR van BMO mRNA, voerden we luciferase reporter assays in SNU-5-cellen. PCR-afgeleide fragmenten uit BMO 3'UTR werden ingebracht in de pGL3 controle vector op Xba1 plaats (LUC-MET 3'UTR). Co-transfectie van LUC-MET 3'UTR en miR-144 bootst in SNU-5-cellen resulteerde in een verlaagde luciferase signaal (in vergelijking met miR-NC), waarin wordt bevestigd dat de binding van miR-144 aan de 3'UTR van BMO heeft een direct remmend effect (figuur 3E). Het omgekeerde experiment, uitgevoerd door het blokkeren van endogene miR-144 productie met een miR-144-remmer in AGS cellen, resulteerde in een verhoogde luciferase signaal (figuur 3F). Een gemuteerde luciferase reporter op de miR-144 bindingsplaats werd geconstrueerd (Figuur 3D). Mutatie van het miRNA bindingsplaats afgeschaft miR-144-gemedieerde remming van luciferaseactiviteit (Figuur 3G). Deze gegevens suggereren dat de 1430-1436 positie van de BMO 3'UTR is van cruciaal belang voor miR-144-gemedieerde genregulatie.
BMO bemiddelt de miR-144-geïnduceerde resistentie tegen migratie
Met behulp van real-time PCR, BMO expressieniveaus werden voor zes menselijke GC cellijnen. Zoals getoond cellijnen "neerwaarts gereguleerd" miR-144 niveaus hogere hoeveelheden BMO vergelijking met cellijnen "gereguleerd" miR-144 niveaus (Figuur 4A). Met behulp van niet-parametrische testen, bepaalden wij een significante inverse correlatie tussen BMO mRNA en miR-144 uitdrukking in het GC metastatische monsters (Figuur 4B). Figuur 4 BMO modulatie is goed voor de antimetastatische effect van miR-144. (A) Western blot die BMO expressie in een set van menselijke GC cellijnen. (B) Een significante omgekeerde correlatie waargenomen tussen miR-144 en MET expressieniveaus in de GC weefsels (n = 52). (C) De BMO en gefosforyleerd Akt werden geremd door de geforceerde expressie van miR-144 of siRNA-MET. (D, E) De effecten van miR-144 of siRNA-MET op de migratie en proliferatie werden bepaald in SNU-5-cellen. (F) De BMO en gefosforyleerd Akt werden gerestaureerd door de overexpressie van BMO in miR-144-bootst behandeld SNU-5-cellen. (G, H) De effecten van miR-144 in combinatie met MET-ORF voor de migratie en proliferatie van SNU-5 cellen. (I) De BMO en gefosforyleerd Akt werden up-gereguleerd door het blokkeren van miR-144 in AGS-cellen. (J, K) De effecten van de miR-144 op de migratie en proliferatie van cellen AGS. Ondernemingen De MET eiwit functioneert als een receptor tyrosine kinase en speelt een centrale rol bij het bevorderen van celgroei en migratie transduceren extracellulaire stimuli intracellulaire signalering circuits. Een belangrijke component van de intracellulaire signalering machine is PI3K (fosfoinositide 3-kinase) pad [20,21]. Omdat miR-144 remt BMO meningsuiting, we de hypothese dat miR-144 uiteindelijk Akt fosforylering en activering kunnen verlagen door het terugbrengen van BMO signalering. Daarom hebben we Akt fosforylering niveaus onderzocht na miR-144 overexpressie en zagen een significante daling van Akt fosforylering (Figuur 4C).
We hebben besloten om te onderzoeken of miR-144-geïnduceerde BMO downregulatie een effect op de tumorcel migratie en proliferatie gehad. We getransfecteerde miR-144 en siRNA voor MET (siRNA-MET) in SNU-5-cellen. Celmigratie werd beoordeeld 16 uur na transfectie door Transwell-assay, terwijl celproliferatie werd bepaald door middel van CCK-8. Zoals getoond in figuren 4D en E, transfectie met miR-144 geremde celmigratie en proliferatie in vergelijking tot de controle. Ook het verlagen van BMO eiwit expressie met behulp van siRNA daalde eveneens tumorcel migratie en proliferatie.
Om te bepalen of een BMO is de kritische mediator van het effect miR-144 op cellulaire migratie en proliferatie, gebouwd we twee ontmoetten expressievector. Waarvan het ene alleen het open afleesraam sequentie van MET-gen (MET-ORF), en andere vector bevat de volledige lengte nucleotide BMO gen waaronder 3'UTR sequentie (MET-volledige lang). Vervolgens hebben we uitgevoerd western blot-analyse 48 uur na transfectie van MET-ORF /MET-full lang in miR-144-bootst behandeld SNU-5-cellen (Figuur 4F). In vergelijking met de negatieve controlegroep (lege vector), ectopische expressie van MET-ORF aanzienlijk verhoogde de totale expressie van MET en gefosforyleerd Akt. Bovendien expressie van de MET-ORF bevorderd migratie en proliferatie van GC cellen (Figuur 4G en H). Overexpressie van BMO afgeschaft miR-144-geïnduceerde remming van de cel migratie en proliferatie. In tegenstelling, het eiwitniveau van MET en gefosforyleerd AKT verhoogd AGS cellen behandeld met anti-miR-144 (Figuur 4I), en het blokkeren van miR-144 bevorderde ook de migratie en proliferatie van AGS cellen (Figuur 4J en K). Deze resultaten geven aan dat een BMO is een kritische doelstelling voor de anti-migratie effect van miR-144 in de menselijke GC cellen.
Discussie
In deze studie hebben we geïdentificeerd niet-overlappende handtekeningen van een klein aantal van miRNAs en genen die afwijkend tot expressie in peritoneale metastatische weefsels van GC, in vergelijking met gepaarde primaire weefsels. Analyse van miRNA en genexpressieprofielen in het miRNA-gen-netwerk geïdentificeerd miR-144 als regulator van grote oncogene routes, zoals proliferatie en migratie. GC patiënten met peritoneale uitzaaiingen had lagere miR-144 expressie niveaus dan patiënten zonder uitzaaiingen. Deze bevinding impliceert miR-144 als een potentiële tumor suppressor in GC. Bovendien miR-144 is geassocieerd met de mechanismen van metastase. Onze resultaten stemmen overeen met de resultaten van eerdere studies naar de rol van miR-144 in kanker proliferatie, migratie en invasie [22,23]. miR-144 remt uitzaaiing van kankercellen door zich te richten op de A desintegrine en metalloproteinase (ADAM) eiwit familielid ADAMTS5. MicroRNA ontregeling wordt geassocieerd met verhoogde tumor invasiviteit en metastase, en minder patiënt prognose van epitheliale kanker [24]. We verder onderzocht de rol van miR-144 deregulering in GC. We onderzochten het effect van miR-144 expressie in de SNU-5 cellijn, zoals wordt gekenmerkt door lage expressie van miR-144. Ectopische expressie van miR-144 in SNU-5 cellen leidt tot ingrijpende fenotypische veranderingen, zoals verminderde migratie. Het omgekeerde experiment blokkeren miR-144 expressie, werd op AGS cellijn, die een relatief hoog niveau van endogeen miR-144 expressie. Remming van miR-144 expressie resulteerde in toenemende migratie AGS cel. Belgique Om het mechanisme achter miR-144-afhankelijke onderzoeken verminderde migratie van GC, identificeerden we de vermeende doelen voor miR-144 zoals voorspeld door miRNA-gen-netwerk. miR-144 overexpressie kan BMO uitdrukking te verminderen, zowel op mRNA en eiwit niveaus, en dienovereenkomstig, luciferase reporter assays bleek dat miR-144 rechtstreeks kan communiceren met de BMO 3'UTR. We vervolgens geëvalueerd BMO expressie in een cohort van 52 GC patiënten en vond dat miR-144 levels omgekeerd gecorreleerd zijn met BMO expressie. Om die reden hebben we de hypothese dat miR-144 remt GC het ontstaan ​​van tumoren door zich te richten BMO expressie. MET is ook beschreven als miR-34a /c doelwit andere cellulaire modellen en is bekend motiliteit en het invasieve vermogen van tumorcellen bevorderen. Overexpressie van marktgericht bedrijf is nauw gecorreleerd met tumor invasie en patiënt prognose in GC [6]. In GC, BMO overexpressie is een onafhankelijke prognostische factor en potentiële drug target. Bovendien kan een BMO overexpressie voorspellen welke patiënten kunnen profiteren van doelgerichte therapie met BMO-remmers [25]. In onze studie werd BMO expressie significant geassocieerd met GC differentiatie, TNM en metastase [26]. We hebben vastgesteld dat veranderingen in celproliferatie en migratie door middel van miR-144 door middel van de regulering van de BMO expressie zou kunnen worden uitgeoefend. miR-144 repressie leidt tot verhoogde niveaus van BMO, die de metastase fenotype van miR-144-uitgeputte cellen kunnen verklaren. Interessant miR-144 beïnvloed hepatocyte growth factor (HGF) signalering. HGF als het ligand van MET, kan de activering van MET induceren in epitheelcellen. Terwijl BMO overexpressie GC tumorigene kwaliteiten niet volledig zou kunnen herstellen, werden GC cel migratie en proliferatie gedeeltelijk hersteld na BMO overexpressie. Derhalve kan miR-144 GC andere genen in cellen reguleren. Eerdere studies hebben aangetoond dat BMO GC tumorigenese kan induceren door de activatie van de PI3K. In deze studie hebben we vastgesteld dat miR-144 aanzienlijk verzwakt Akt fosforylering, en dat Akt fosforylering volledig werd gerestaureerd met overexpressie van marktgericht bedrijf. Onze resultaten suggereren dat miR-144 regelt Akt fosforylering door middel van BMO regelgeving in GC.
Kortom, onze studie identificeerde een basis voor de verminderde niveau van miR-144 zien in GC metastatische weefsels. miR-144 werd geïdentificeerd als een potentiële tumor suppressor in GC en is geassocieerd met de mechanismen van GC metastase. Bovendien, miR-144 remt GC het ontstaan ​​van tumoren door zich te richten BMO, en vervolgens de PI3K /Akt route. Voor zover wij weten is dit de eerste keer dat miR-144 is aangetoond dat gedeelte bereikt GC cellen. Daarom kan verdere studies het verkennen van de anti-kanker rol van miR-144 een bijdrage leveren aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor GC.
Notes
juni Liu Hui en Xue eveneens bijgedragen aan dit werk.
Verklaringen
Dankwoord Inloggen Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81201897). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.
Concurrerende belangen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. Bijdragen
Authors '
JL voerde het biologisch onderzoek moleculaire. HX opstellers van het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Vereniging van aanwezigheid /afwezigheid en de aan /uit-patronen van Helicobacter pylori OIPA gen met maagzweren en maagkanker risico's: een meta-analyse
• Relatie tussen darm hormonen en glucose homeostase na bariatrische chirurgie