PLoS ONE: Overuttrykte og biologisk funksjon av Ubiquitin-Specific Protease 42 i Gastric Cancer

Abstract

Ubiquitin-spesifikk protease 42 (USP42) er medlem av deubiquitinating enzymer (Dubs). De endringer av Dubs er implisert i patogenesen av et bredt spekter av tumorer. Imidlertid er det få studier på ekspresjon og biologisk funksjon av USP42 i magekreft (GC). Her betyr uttrykket nivåene av USP42 var signifikant høyere i GC vev enn i ikke-tumorvevet. USP42 uttrykk var signifikant korrelert med tumorstørrelse, TNM stadium, lymfeknutemetastase og total overlevelse av pasienter med GC. Videre USP42 stanse i to GC cellelinjer, AGS og MKN-45, særlig hemmet celle spredning, men stimulert G1 fase arrest. Proteinene fremme cellesyklusprogresjon (cyclin D1, Cyclin E1 og PCNA) ble nedregulert i USP42 undertrykt celler. Videre hemming av USP42 i GC celler svekket celle invasjon via påvirker uttrykket av matrix metalloproteinaser (MMP) og epiteliale-mesenchymale overgangs (EMT) regulatorer. Som konklusjon kan USP42 overekspresjon være en potensiell prognostisk markør for GC, regulere overlevelsen og invasive egenskaper av GC, og kan representere en ny terapeutisk molekylære mål for denne tumoren

relasjon:. Hou K, Z Zhu, Wang Y, Zhang C, Yu S, Zhu Q, et al. (2016) Overuttrykte og biologisk funksjon av Ubiquitin-Specific Protease 42 i magekreft. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10,1371 /journal.pone.0152997

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea

mottatt: 29 desember 2015; Godkjent: 22 mars 2016; Publisert: 31 mars 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Scientific Research Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (20124321)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den femte vanligste kreftformen [1] og den tredje største årsaken til kreftdød [2]. Kjente store risikofaktorer for GC inkluderer Helicobacter pylori (H. pylori) infeksjon, bomiljø, kosthold, genetiske og immunologiske faktorer, og kroniske magesykdommer [3]. Prognosen blant pasienter med GC er generelt dårlig, fordi svulsten har ofte spredning og de fleste pasientene er eldre (median alder er over 70 år) på den tiden det er diagnostisert. Den 5 års overlevelse for GC er rapportert å være mindre enn 25% [4]. Det er av stor klinisk betydning å identifisere sensitive diagnostiske og prognostiske markører for GC, undersøke molekylære mekanismer for GC utvikling, og utforske nye terapi mål av denne sykdommen.

Ubiquitin-spesifikk protease 42 (USP42) er en deubiquitinating enzym (DUB) som er mye uttrykt i forskjellige humane vev [5]. Ubiquitinering, en reversibel post-translasjonell modifikasjon, er involvert i flere cellulære prosesser, slik som cellesyklus, DNA-reparasjon og apoptose [6, 7]. Økende bevis har vist at endret DUB funksjon er implisert i patogenesen av et bredt spekter av tumorer [8]. Overekspresjon av USP9X, USP9Y, USP10 og USP25 ble avslørt i brystkreft med todimensjonal polyakrylamidgelelektroforese og proteomikk analyse [9]. Noen studier har vist at USP22 overekspresjon fremmet kreft progresjon og dårlig prognose for gliom, bukspyttkjertelkreft, livmorhalskreft og lungekreft [10-13]. USP42 har tidligere vist seg å bli omorganisert i akutt myelogen leukemi [14]. Men til vår kunnskap, ingen etterforskning har blitt utført på uttrykket mønster og biologiske funksjoner av USP42 i GC.

I denne studien, USP42 mRNA nivåer i GC vev ble funnet å være bemerkelsesverdig høyere til nivåer i kontroller . Ytterligere kliniske karakteristika analyse viste at ekspresjonsnivået av USP42 var forbundet med GC total overlevelse av pasienter. Vi deretter brukt RNA interferens (RNAi) teknologi for å slå ned uttrykket av USP42 i to GC cellelinjer (AGS og MKN-45 celler), og undersøkt spredning, cellesyklus og invasiv kapasitet i begge cellelinjer. Våre data tyder på at USP42 er en potent onkogen i GC, som gir oss en fremtidig mål for GC terapi.

Materialer og metoder

Vevsprøver

Totalt 90 GC pasienter som gjennomgår kirurgi ved Institutt for generell kirurgi, ble Folkets sykehus, Pudong New District (Shanghai, Kina) mellom februar 2007 og juni 2009 registrert i denne studien. Median alder for pasientene var 56 år (spredning: 34-68 år). Alle pasientene ble gitt skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av etisk komité Shanghai Pudong District Folkets sykehus (Shanghai, Kina). Tumor vevsprøver ble oppnådd fra alle GC pasienter. I mellomtiden 42 matchet ikke-tumorprøver plassert > 3 cm fra svulsten ble oppsamlet. Alle kirurgiske prøver ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgisk reseksjon, og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon.

Cellelinjer

cellelinjer avledet fra humane magekreft, inkludert AGS, SGC-7901, ble BGC-823, MKN-28 og MKN-45 hentet fra institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO _2.

stanse av USP42 av små interfererende RNA (siRNA)

siRNA spesifikt for humant USP42 (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ') ble valgt. En ikke-spesifikk krafse siRNA-sekvens (sinc) ble anvendt som negativ kontroll. De sirnas ble transient transfektert inn i AGS eller MKN-45 celler ved anvendelse av lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til fremstilling instruksjon. Analysene ble utført 48 timer etter transfeksjon.

Real-time PCR

Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon reaksjonen ble utført med tilfeldige heksamerprimere og en Super revers transkriptase sett (Invitrogen). Den resulterende cDNA ble brukt som mal for real-time PCR utføres med en standard SYBR Grønn PCR kit (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) på ABI7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) termosykler. GAPDH ble anvendt som kontroll for inngangs RNA-nivå. Alle reaksjoner ble utført ved bruk av følgende Syklusparametrene, 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 45 sek. For å verifisere spesifikt produkt amplifikasjon, ble produktene deretter underkastet dissosiasjonskurve analyse. Den genekspresjon ble beregnet ved anvendelse av Δ Ct-metoden. Alle data representerer gjennomsnittet av tre gjentak. Sekvensene til spesifikke primere var som følger: USP42 mRNA fremover, 5'- ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ', og USP42 mRNA-revers 5'ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH mRNA fremover, 5'CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ', og GAPDH mRNA revers, 5'CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.

Antistoffer og Western blotting

Antistoffer mot CyclinD1, E-cadherin, β -catenin, Snail1 og GAPDH ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antistoffer mot USP42, CyclinE1, PCNA, og MMP-9 var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-MMP-2 var fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer var fra Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kina).

Cellene ble vasket tre ganger med PBS og deretter lysert i på forhånd avkjølt radioimmunopresipitasjon (RIPA) assay-buffer på is i 10 min. Etter fjerning av celleavfall ved sentrifugering (12.000 g, 10 min), proteinkonsentrasjon på supernatanter ble målt ved BCA proteinanalysesett (Thermo Fisher Scientific). Etter koking i 5 minutter i prøvebuffer, var lik mengde av proteiner av forskjellige grupper separert ved SDS-PAGE, og overført på en nitrocellulosemembran (Millipore, Bredford, USA). Etter blokkering med 5% skummet melk, ble membranene inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten med omrøring, etterfulgt av inkubasjon med tilsvarende sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur med omrøring. Reaktivt protein ble deretter påvist ved anvendelse av ECL-kjemiluminescens-system (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

celle proliferasjonsanalyse av CCK-8

CCK-8-analysen ble utført ved standardmetoder i 96-brønners skåler. I korthet, 3 x 10 ^{3-celler ble sådd ut per brønn. Ved angitt tidspunkt, ble CCK-8-løsning (10 ul i 100 ul RPMI-1640 medium) tilsatt hver brønn og inkubert i 1 time. Absorbans ved 450 nm ble oppdaget ved hjelp av en mikroplateleser.}

In vivo tumorbærende nakne mus modell

Dyreforsøk ble godkjent og utført i henhold til retningslinjene for Animal Care og bruk Committee of Shanghai Pudong District Folkets sykehus (Shanghai, Kina). Tolv BALB /c naken mus i alderen 4-5 uker gamle (SLAC Animal, Shanghai, Kina) ble opprettholdt under spesifikke patogen-frie forhold ved hjelp av en laminær luftstrøm rack og hatt sammenhengende fri tilgang til sterilisert mat og autoklaveres vann. Forsøk ble startet etter en uke med akklimatisering. AGS-celler (2 x 10 ^{6) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av nakne mus for å etablere xenograft-bærende tumormodell. Ti dager etter subkutan injeksjon ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (n = 6 /gruppe) og IV injisert med USP42 siRNA eller sinc inneholdende formuleringer to ganger i uken. Den korteste og lengste diameter av tumoren ble målt av målepunkter ved fire dagers mellomrom, og tumorvolum (mm 3) ble beregnet ved anvendelse av følgende standard formel: (den korteste diameter) 2 x (den lengste diameter ) × 0,5. 36 dager etter tumor-emisjon ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon og tumorene ble gjenvunnet. De våte vekter av hver tumor ble undersøkt. Under den eksperimentelle fremgangsmåte ble alle musene overvåket hver dag. Ingen mus døde før den eksperimentelle endepunktet.}

cellesyklusanalyse

Cellene ble trypsinert, vasket to ganger i PBS og fiksert over natten ved 4 ° C i is-kald 70% etanol. Cellene ble deretter vasket to ganger i PBS, og inkubert i propidiumjodid (PI) farging buffer (5 ug /ml PI og 0,25 mg /ml RNase, Sigma, St. Louis, MO, USA) ved romtemperatur i 30 min. Cellene ble så analysert ved hjelp av et ved hjelp av et FACScan flowcytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prosentene av celler i G0 /G1, S og G2 /M fase ble bestemt av PI farging.

Cell invasjon analyser

For å måle celle invasiv potensialet i cellene, ble Transwell analyser utført ved hjelp en Matrigel-belagte Boyden kammer (BD Biosciences). Celler ble serum-sultet over natten, høstet og resuspendert i serumfritt medium. -Celler (1 x 10 ^{5) ble deretter tilsatt til det øvre kammer. Medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter at cellene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer, ble cellene på den øvre overflaten av membranen fjernes fullstendig ved hjelp av bomulls tips. De migrerende cellene er festet til den nedre overflate ble fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med 0,5% krystallfiolett. Antallet migrerte celler på den nedre overflate av membranen ble tellet under et mikroskop i fem felter på 100 x.}

Bio-analyse

magekreft datasett ble lastet ned fra NCBI Gene Expression omnibus database (Access ID: GSE26253) og Kreft Genome Atlas (TCGA). For ytterligere å undersøke de biologiske pathways involvert i magekreft patogenesen gjennom USP42 vei, Gene satt berikelse analyse (GSEA) ble utført ved bruk av offentlig tilgjengelig programvare fra Broad Institute ved MIT (http://www.broad.mit.edu/gsea/software /software_index.html) som tidligere beskrevet [15]. For hvert gen sett, GSEA definerer en berikelse score (ES), som reflekterer sammenhengen mellom genet sett og prøven.

Statistisk analyse

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført ved hjelp MedCalc ( Mariakerke, Belgia). Statistisk Package for Social Sciences (SPSS) versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) ble brukt for den andre statistisk analyse. Resultater av forsøkene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Students t test ble benyttet for å sammenligne verdier av test- og kontrollprøver. Chi-kvadrat-test ble anvendt for å identifisere forskjeller mellom kategoriske variabler. Statistisk signifikante forskjeller ble definert som å ha en P
. ≪ 0,05

Resultater

Uttrykk av USP42 i magekreft

For å utforske uttrykk for USP42 i GC, vi utførte real-time PCR-analyse på GC (n = 90) og noncancerous vevsprøver (n = 42). Den relative uttrykk for USP42 mRNA sammenlignet med GAPDH ble beregnet ved hjelp av △ Ct metoden. Åpenbart USP42 mRNA-ekspresjon var høyere i GC vev enn i noncancerous vev (figur 1A). For ytterligere å bekrefte disse funnene, vi re-analysert microarray data fra TCGA uavhengig GC datasett. Fig 1B viste åpenbare overekspresjon av USP42 i humane GC vev sammenlignet med normale vev.

Ved hjelp av den midlere verdi av to ^{-ΔCt (0,550) som en cut-off mellom lav-nivå og høyt nivå USP42 mRNA uttrykk, 90 pasienter ble klassifisert i lave (< 0.550) og høye USP42 uttrykk undergrupper (≥0.550). Som vist i tabell 1, ble USP42 signifikant assosiert med tumorstørrelse ( P
= 0,0328), TNM stadium ( P
= 0,0059) og lymfeknutemetastase ( P
= 0,0184). Det var imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom UP42 ekspresjon og andre pasientkarakteristikker, pasientens kjønn og alder ved diagnose og tumor plassering inkludert. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at den totale overlevelsestiden var betydelig kortere for pasienter med høyere USP42 uttrykk enn det hos pasienter med lavere USP42 ekspresjon (Fig 1C, P < 0,05), som ble ytterligere bekreftet ved overlevelsesanalyse på ArrayExpress datasett (Access id : GSE26253, figur 1D)}

USP42 siRNA trykkes USP42 uttrykk

Sammenligning av ulike magekreft cellelinjer avslørte at uttrykket nivået av USP42 protein i AGS og MKN-45 celler er høyere enn det. av SGC-7901, BGC-823 og MKN-28 celler (figur 2A). Derfor ble AGS og MKN-45 celler valgt for etterfølgende eksperimenter. For å utforske funksjonene til USP42 på GC, knock vi tømte USP42 uttrykk i GC cellelinjer av siRNA transfeksjon. Som vist i figur 2B, siRNA spesifikk for USP42 markert undertrykket USP42 ekspresjon i AGS og MKN-45-celler med en undertrykkelse grad på 60,4% og 74,4%, respektivt. Vi deretter analysert om undertrykkelse av USP42 uttrykk ville forandre vekst på GC-celler. Som vist i figur 2C, var det en betydelig nedgang i vekstraten til USP42 undertrykt celler sammenlignet med sinc-transfekterte celler.

USP42 siRNA undertrykte tumorvekst i nakne mus

For å finne ut virkningen av USP42 siRNA på tumorgenisitet in vivo, ble likt antall av AGS-celler injisert subkutant i nakne mus og USP42-siRNA var IV injisert etter tumordannelse. Svulsten vekst på mus injisert med USP42-siRNA var betydelig tregere enn for mus injisert med kontroll siRNA (Fig 3A). Volumet og vekten av USP42-siRNA tumorer var mindre enn 25% av det kontrolltumorer (figur 3B). Videre sammenlignet med kontroll svulster, USP42 og PCNA ble betydelig redusert i tumorer med USP42-siRNA injeksjon (figur 3C).

Induced G0 /G1 fase arrest i USP42-undertrykte kreftceller

Å finne ut hvordan høyere USP42 uttrykk påvirket GC celleproliferasjon, vi utførte Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) på TCGA datasettet ved å analysere forholdet mellom USP42 uttrykk og gener i Kyoto leksikon av gener og genomer (KEGG) cellesyklusen sti. Interessant, fant vi at høyere USP42 uttrykk var positivt korrelert med KEGG cellesyklus sti i GC pasienter basert på TCGA datasettet (fig 4A). Vi deretter analysert cellesyklus distribusjon av GC-celler med USP42 knockdown. Undertrykke USP42 uttrykk redusert S-fasen cellepopulasjon og førte til G1 arrest i AGS og MKN-45 celler (figur 4B). For ytterligere å undersøke den cellulære mekanisme som ligger til grunn USP42-indusert celleproliferasjon, ble proteinnivået av cellesyklusproteiner bedømmes. USP42 knockdown betydelig redusert ekspresjon av Cyclin D1, E1 og syklin PCNA (figur 4C). Dermed disse resultatene viste at en reduksjon i nivået av USP42 ekspresjon hemmet Cyclin D1, syklin E1 og PCNA ekspresjon i GC-celler, noe som kan indusere G0 /G1 faserest, i betydelig grad redusere antall S-faseceller og hemmer celleproliferasjon.

lav invasiv potensialet USP42-undertrykte kreftceller

GSEA også indikert at USP42 uttrykk var positivt korrelert med spredning (figur 5A). For å verifisere disse funnene i en in vitro analyse, undersøkte vi invasiv potensialet i USP42-trykkes celler ved hjelp av en in vitro Matrigel invasjon assay (fig 5B). De USP42-trykt celler viste signifikant mindre invasiv potensial enn sinc-transfekterte celler ( P
< 0,01)., Noe som tyder på at høy uttrykk for USP42 forbedret svulst invasivitet

Nedbrytning av den ekstracellulære matrise gjennom matriks-metalloproteinaser (MMP), er en viktig prosess i løpet av celle invasjon [16]. Som vist i figur 5C, stanse av USP42 downregulated ekspresjon av MMP-2 og MMP-9.

Videre er protein nivåer av epitel-mesenkymale overgang (EMT) pathway regulatorer, som er nært beslektet til metastasering av tumorceller, ble analysert ved hjelp av Western blot (fig 5D). Transfeksjon av USP42 siRNA betydelig redusert uttrykket nivåer av β-catenin, Twist og Snail1, mens økende E-cadherin.

Diskusjoner

Flere medlemmer av DUB-familien er kjent for å bidra til kreftutvikling, inkludert USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] og USP22 [10-12, 21], mens andre Dubs er nedregulert i humane kreftformer, inkludert USP10 [22] og BAP1 [23]. Men lite er kjent om uttrykket mønster og biologiske funksjoner av USP42, en DUB for p53 [24] og histon H2B [25], i kreft hos mennesker. I vår studie viste vi for første gang at GC vev uttrykker høye nivåer av USP42 mRNA sammenlignet med tilsvarende ikke-tumorvevet. Videre ble USP42 uttrykk forbundet med tumorstørrelse, TNM stadium, lymfeknutemetastase og total overlevelse av GC pasienter (fig 1). Våre funn gitt verdifull informasjon for klinisk resultat prediksjon av pasienter med GC.

Det antas at USP42 kan fungere som en onkogen faktor under GC utvikling. Deretter påføres RNAi-teknologi, som er mye brukt i kreftforskning eller cancerterapi, for å slå ned USP42 ekspresjon i to GC cellelinjer (figur 2B). Senking USP42 uttrykk effektivt redusert kreftcelle spredning in vitro (figur 2C) og in vivo plakater (figur 3). GSEA data avslørte sammenslutning av cellesyklusen vei med USP42 uttrykk (Fig 4A). Deretter påføres en cellesyklus-analyse ved hjelp av FACS (figur 4B) og ekspresjon analyse av Cyclin D1, cyklin E og PCNA ved western blot (Figur 4C). Våre data viste at USP42 siRNA hadde en inhibitorisk effekt på cellevekst GC via induserende G0 /G1 rest.

GC er en av de mest vanlige kreftformer og fortsatte å være et alvorlig helseproblem i verden. Høy forekomst av metastaser er fortsatt en av de viktigste årsakene til den dårlige overlevelsen av GC pasienter [4]. GSEA på TCGA datasett avslørte sammenslutning av metastase vei med USP42 uttrykk i GC (figur 5A). Videre, in vitro assay invasjon påpekes at USP42 knockdown redusert invasiv evne til udødeliggjorte GC-cellelinjer (figur 5B). Således våre data indikerte at forhøyet ekspresjon av USP42 i GC kan fremme tumormetastase og er forbundet med det kliniske resultatet av GC pasienter. Deretter prøvde vi å utforske de underliggende mekanismene ved å evaluere uttrykk for MMP og EMT regulatorer i USP42-undertrykte kreftceller. MMP-2 [26] og MMP-9 [27] er kjent for å formidle degradering av den ekstracellulære matriks og er forbundet med lymfeknutemetastase av GC. EMT er involvert i patogenesen kompleks av tumorer [28]. Her, stanse av USP42 indusert ekspresjon av den viktigste faktor på EMT (E-cadherin), men reduserte ekspresjon av MMP'er og tre kjente indusere av EMT (β-catenin, Twist og Snail1) (Figur 5C og 5D). Disse funnene antydet rolle USP42 som en invasjon promoter gen via påvirker uttrykket av MMP og EMT regulatorer, men videre studier er nødvendig for å klargjøre de nøyaktige mekanismene.

I sammendraget, denne studien viste at USP42 uttrykk var betydelig økt i GC vev. Den økte ekspresjon USP42 kan være viktig for tumorprogresjon og metastasering av GC, og kan tjene som en prognostisk markør for denne sykdommen. Våre in vitro funn viste at lyddemping av USP42 hemmet celledeling via induserende G0 /G1 arrest og undertrykte celle invasjon via MMP og EMT regulatorer. Dermed kan USP42 være en roman terapeutisk molekylære mål for GC.

Takk

Denne studien ble støttet av Scientific Research Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (20124321).

• PLoS ONE: beskyttende rolle av Helicobacter pylori infeksjon i Prognose av magekreft: Bevis fra 2454 pasienter med mage Cancer
• PLoS ONE: Sirkulasjons mikroRNA-26a i plasma og dets potensial diagnostisk verdi i Gastric Cancer