Lav Helicobacter pylori primære motstand mot klaritromycin i mage snitt fra dyspepsi pasienter i en by i det indre av São Paulo, Brazil

lav Helicobacter pylori primære motstand mot klaritromycin i mage snitt fra dyspepsi pasienter i en by i det indre av São Paulo, Brasil
Abstract
Bakgrunn
klaritromycin, amoxicillin, og en pumpe proton inhibitor er de vanligste legemidlene som førstelinjetrippelterapi for H. pylori
behandling, noe som resulterer i utrydding priser nær 80% , varierende regionalt, hovedsakelig på grunn av nødstilfeller og økninger av klaritromycin resistente stammer. Nukleotidsubstitusjoner på H. pylori
domene V i 23S rRNA fraksjonen er involvert i makrolid-resistens og A2142G og A2143G mutasjoner er fremherskende i kliniske isolater hele verden, inkludert i Brasil. Som H. pylori
kultur er kresen, undersøkte vi den primære forekomsten av H. pylori
A2142G og A2143G rDNA 23S mutasjoner ved hjelp av en molekylær tilnærming direkte på mage biopsi av dyspepsi pasienter fortløpende deltok på Hospital das Clinicas av Marilia, São Paulo, Brasil.
Metoder
Snitt hentet fra 1137 dyspepsi pasienter ble utsatt for histopatologi og H. pylori
diagnose av histologi og PCR. PCR /RFLP-analyse ble benyttet for å detektere A2142G og A2143G punktmutasjoner på domenet V av H. pylori
23S rDNA forbundet med klaritromycin motstand. Gjennom utviklet analysen, et 768 bp PCR fragment tilsvar to1728 til 2495 bp av 23S H. pylori
rDNA er begrenset med MboII
for A2142G mutasjonsdeteksjon og med BsaI
for A2143G mutasjonsdeteksjon. Forekomst av 23S rDNA A2142G resulterer i to DNA-fragmenter (418 og 350 bp) og av 23S rDNA A2143G resulterer i tre DNA-fragmenter (108, 310 og 350pb), på grunn av en konservert BsaI
restriksjonssete.
Resultatene
PCR-metoden som brukes til å diagnostisere H. pylori
presenteres sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet på 77,6%, 79,3% og 78,6%, sammenlignet til histologi, gullstandarden metode for H. pylori
diagnose brukes i vår rutine. Utbredelse av H.pylori
med klaritromycin resistente genotyper var 2,46%, med overvekt av A2143G 23S rDNA punktmutasjon.
Konklusjoner
PCR /RFLP analysen var en rask og nøyaktig h.pylori
diagnostisk og klaritromycin resistensbestemmelse metoden nyttig for rutinemessig praksis. Som utbredelsen av primær motstand av H.pylori
til klaritromycin grunn A2142G og A2143G mutasjoner fortsatt lav i Marilia, standard klaritromycin inneholder trippelterapi er fortsatt gyldig.
Nøkkelord
Helicobacter pylori
Klaritromycin motstand Helicobacter pylori
23S rDNA Gastric sykdommer nukleinsyre-basert diagnose Bakgrunn
Det er allment akseptert at Helicobacter pylori
, en Gram negativ microaerophylic bakterien, er involvert i flere kliniske fordøyelseskanalen tilstander som kronisk magekatarr, magesår og duodenalsår , magekreft og lymfoproliferative sykdommer [1]. Behandling av H. pylori-infeksjon resulterer
i sårtilheling og i en reduksjon av risikoen for magekreft og lymfom [2, 3].
Når bakterien H. pylori
påvises i endrede gastrisk mucosa, den indikerte behandling består av en trippel antibiotika regime med methronidazol, klaritromycin, amoxicillin, tinidazole, tetracyklin og fluorokinoloner forbundet med en pumpe proton inhibitor som omeprazol, lansoprazol eller pantoprazol [4-6]. H. pylori
eradikasjonsrate med et antall kombinerte midler og regimer er nær 80% [7-9], varierende fra land til land og regionalt, innen land [10]. Flere faktorer bidrar til denne lave frekvensen av H. pylori
helbredelse herunder ineffektiviteten av antibiotikumet penetrasjon i mageslimhinnen, inaktivering av antibiotikumet av syresekresjon i magen [11], mangel på pasientens etterlevelse [12] og fremst, nødstilfeller og økende H. pylori
antibiotikaresistente stammer [13]. Dermed er regional H. pylori
motstand overvåking av stor betydning for test- og behandlingsstrategier.
I Brasil, et land av kontinentale dimensjoner, flertallet av praktiserende leger benytter den klassiske trippelregime bestående av klaritromycin, amoxicillin og en protonpumpehemmer i sju dager som førstelinjebehandling for å overvinne H. pylori
infeksjon [5, 14]. Dette regimet har vist seg å bli ineffektiv over hele verden, i hovedsak som følge av fremveksten og økningen av H. pylori
stammer resistente mot klaritromycin, noe som reduserer bakterien renseeffekt fra 55% til 100% [15-18]. Blant brasilianske lokaliteter, presenterer H. pylori
klaritromycin motstand høy forekomst, varierende 7-16% hos voksne [19-22] og 27% hos barn [23]. Følgelig vurderer den kliniske betydningen av primær H. pylori
motstand mot klaritromycin, dens utbredelse bør vurderes før du velger utrydding regimer [24].
Bestemmelse av H. pylory in vitro
mottakelighet for antibiotika kan utføres ved standardteknikker slik som agar diffusjon, agar fortynning og kokes mikrofortynningsplater metoder og E-testen. Men på grunn av den langsomme vekst og de spesielle kravene til H.pylori
kultur, er denne metode ikke er pålitelig for anvendelse i de fleste rutinemessige kliniske laboratorier, i hovedsak i utviklingsland. Derfor molekylære tester rettet mot H. pylori
motstand forbundet genmutasjoner direkte fra mage biopsier har potensial for bruk i store studier [25-29].
Molekylære mekanismen involvert i klaritromycin motstand består av mutasjoner i sekvensen av H. pylori
domene V i 23S rRNA fraksjon som er involvert i peptiltransferase ribosombindingssetet å forhindre ligering av makrolid til rRNA [30]. De store karakteriserte punktmutasjoner er A til G i posisjonene 2142 og 2143, A til C i 2142 [31-33], A til T ved 2144 [34], T til C på 2717 [35] og C til A på 2694 [ ,,,0],36]. De A2142G og A2143G mutasjoner er dominerende i kliniske isolater hele verden, inkludert i Brasil [21, 37-40]. Derfor, for å utføre en storskala undersøkelse av klaritromycin primære motstand direkte fra biopsiprøver av 1137 pasienter deltok på sykehuset das Clínicas av Marilia, en by i det indre av São Paulo, Brasil, har vi utviklet en polymerase kjedereaksjon i forbindelse med begrensning fragment lengde polymorfisme (PCR-RFLP) analyse for å oppdage A2142G og A2143G nukleotidsubstitusjoner på domene V av H. pylori
23S rDNA
. Metoder
pasienter
1137 voksne pasienter bosatt i Marilia byen, São Paulo i Brasil, i alderen 19 til 91 år, som hadde fortløpende gjennomgått esophagogastroduodenoscopy (EGD) for øvre magesmerter eller dyspepsi symptomer fra februar 2003 til desember 2006 i en gastroenterologi poliklinikken på sykehuset das Clinicas av Marília Medical School, ble innrullert i denne studien.
Endoskopi og biopsier
EGD ble oppnådd ved fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) eller video-endoskop (GIF-100) begge fra Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan. Gastric eller duodenalsår diagnostisk ble definert av endoskopi og to fragmenter av antrum ble samlet for å utføre raske urease og histopatologiske tester. Biopsi anvendes for hurtig urease testen ble videresendt DNA-ekstraksjon. Protokollen som brukes er i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Etisk Komité i Human Forskning fra Marilia Medical School, med referanse nummer 388/01. I Etisk Komité godkjent forskningsprotokoll et skriftlig informert samtykke fra hver pasient inkludert i denne studien ble frafalt som alle mage biopsiprøver analysert var de samme biopsier som brukes rutinemessig for urease rask test som en del av gastroenterologi poliklinisk tjeneste Hospital das Clinicas av Marilia Medical School og dermed ingen spesifikk pasient intervensjon var nødvendig for innmelding i denne foreslåtte studien. Følgelig fraskrivelse av skriftlig informert samtykke ikke påvirkes negativt rettighetene og velferden til de fagene som inngår i denne forskningen, og også konfidensialitet av pasienter identitet ble garantert.
Histologi
One antrum prøven ble løst i formol løsning ved 10% og innstøpt i parafin. Seksjoner ble Giemsa farget for H. pylori
evaluering og ble farget med hematoksylin og eosin for vurdering av histopatologiske forandringer [41].
Polymerase kjedereaksjon, begrensning og sekvensering analyse
samme biopsi brukes for rask urease testen ble sendt til DNA-ekstraksjon med ansettelse av gfx DNA-ekstraksjon kit kjøpt fra Amersham /Pharmacia Biotech, etter produsentens anvisninger. DNA ble kvantifisert i agarosegel-elektroforese ved bruk av Invitrogen, Grand Island, New York, USA, lav masse stige og 50-100ug av total-DNA ble anvendt i PCR-reaksjonene med oligonukleotidene: Hp23Sr6 forstand (5 'CACACAGGTAGATGAGATGAGTA3') og antisense Hp23Sr7 (CACACAGAACCACCGGATCACTA3 '), som forsterkes et fragment av 768pb svarende til domenet V av H. pylori
23S rDNA (figur 1). For å overvinne problemene med omfattende genetisk polymorfisme for presis PCR påvisning av H. pylori
ble oligonukleotid konstruksjon utført etter en komparativ analyse av 23S rDNA fra h.pylori Hotell og beslektede organismer tilgjengelig på Genebank på MegAlign Lasergene programvare . PCR tilstand var 94 ° C 5 'etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C, 30 "/60 ° C 30" /72 ° C 30 "og en syklus ved 72 ° C 7", med et totalt volum på 25 ul inneholdende 1 x PCR-buffer, 200 uM dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM av hver oligonukleotid, 1,25 U Taq DNA Polimerase platina Brasil (Invitrogen). I alle PCR-reaksjonene en negativ og en positiv kontroll ble anvendt svarende til henholdsvis sterilt vann og H. pylori
PCR-positive gastrisk biopsier. De forsterkede fragmenter ble fordøyd med MboII Hotell og BsaI
(New England Biolabs). Disse enzymene skille mutasjoner i H. pylori
domene V i 23S rDNA på posisjonene 2142 og 2143, henholdsvis. I nærvær av A2142G mutasjon de resulterende restriksjons DNA-fragmenter er av 418 bp og 350 bp, og i nærvær av A2143G mutasjon de resulterende fragmenter er fra 108, 310 e 350 bp. Som en kontroll av MboII
fordøyelse vi brukte en PCR-amplifisert DNA-fragment på 601 bp som tilsvarer den Leishmania større
chitinase-gen som inneholder et restriksjonssete for MboII
. En konservert BsaI
restriksjonssete på 768 bp PCR-fragment er den positive kontrollen for spalting med dette enzymet fremstilling av DNA-fragmenter med 108 og 660 bp i fravær av A2143G mutasjon. Produktene fra PCR-reaksjoner og restriksjonsanalyse ble løst i 1,5% agarosegeler, farget med etidiumbromid og fotografert under UV-lys. 23S rDNA 768 bp PCR amplikonene fra fire mage biopsier (to positive og to negative for H. pylori
histologisk test) med klaritromycin sensitive MboII
og BsaI
restriksjonsmønster, og fra ti mage biopsier med clarytromycin resistente MboII product: (tre prøver) og BsaI
(syv prøver) restriksjons mønstre ble sendt til sekvensering med DyeTM Terminator v3.0 syklus sekvense~~POS=TRUNC Klar Reaction kit og en ABI-3100 maskin kjøpt fra Applied Biosystems, i henhold til produsentens instruksjoner. Nukleotid-sekvensbestemmelse ble utført i duplikat, og komparativ analyse ble utført ved enkel nukleotid-BLAST-oppstilling [42]. Figur 1 molekylær diagnose av Helicobacter pylori ved PCR og påvisning av RLFP domenet V av 23S rRNA mutasjonene A2142G og A2143G ansvarlig for klaritromycin motstand. A. Fremstillingen av H. pylori
23S kodende gen (Genbank: HPU27270), posisjon av primerne anvendt for PCR og av A2142 og A2143 fra fraksjon V i 23S rDNA, størrelsen av fragmentene som oppnås med restriksjonsenzymene BsaI og MboII
i PCR-fragmenter som inneholder mutasjoner A2142G og A2143G, og intern BsaI
restriksjonssetet av 768 bp fragment, indikeres. B, C og D. agarosegel farget med etidiumbromid som inneholder en PCR-diagnostisk analyse, restriksjonsanalyse av 768pb amplikon med MboII
og BsaI
, respektivt. 1-10 tilsvarer forskjellige humane biopsiprøver; C-, negativ kontroll av PCR, M-100 bp stige innkjøpt fra Invitrogen. Størrelser av DNA-fragmentene er angitt til venstre eller høyre for hver gel figur.
Statistisk analyse
H. pylori
diagnostiske tester ble evaluert ved å beregne sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet ansette histologi som gullstandarden.
Resultater og diskusjon
Dette er den første brasilianske storskala studie på H. pylori
diagnose og klaritromycin motstand direkte fra biopsiprøver av 1137 fortløpende pasienter sendes til øvre gastroskopi, over en fire års periode, i en by i interiøret i São Paulo, Brasil.
Gastric sykdom utfallet av alle pasientene som deltok i denne studien deltok på gastroenterologi poliklinikken Hospital das Clínicas av Marília ble undersøkt med endoskopi og histopatologi. Endoskopiske funn av peptic eller duodenal sår sykdom (PUD) var til stede i 123 pasienter. Forskjellige grader av kronisk gastritt (CG) ble observert ved histopatologi i 706 pasienter og normal gastrisk mucosa, assosiert eller ikke for å gastroøsofageal reflukssykdom (GERD) ble funnet i 290 pasienter. Atten pasienter ble diagnostisert med adenokarsinom (15) og MALT lymfom (3) og ble ekskludert fra studien. . Epidemiologiske analyse, klinisk utfall og H. pylori
utbredelsen av disse prøvene ble nylig publisert [43]
Påvisning av H. pylori
ble utført direkte fra biopsiprøver av tre forskjellige tester: histologi, en husholdning rask urease test og PCR med primerne Hp23Sr6 /r7 som amplifiserer et 768 bp fragment av bakterie domenet V i 23S rDNA. Histologi er gullstandarden h.pylori
diagnostisk test ansatt i vår kliniske rutine som sammen med histopatologiske analyse brukes til å bestemme for H. pylori
eradikasjonsbehandling. Husholdningenes rask urease testen viste en meget lav positiv prediktiv verdi for H. pylori
forbundet mage sykdommer og høyt avvik i forhold til histologi; følgelig disse dataene ble ekskludert fra studien (data ikke vist). 23S rDNA PCR-metoden oppdaget H. pylori
i 488 mage biopsi prøvene der histologi var positiv for 451 biopsier prøver. Komparativ analyse av PCR-assay utført med Hp23Sr6 /r7 med histologi viste følsomhet, spesifisitet og nøyaktighet på 77,6%, 79,3% og 78,6%, henholdsvis (tabell 1). Som begge tester ble utført på en enkelt og forskjellig biopsi og H. pylori-infeksjon
presenterer en fokal karakteristisk for infeksjon [44, 45], nøyaktighet på 78,6% er akseptabelt for en pålitelig diagnostisk test. Det kan demonstreres ved konsistens på H.pylori
påvisning ved PCR og histologi som anvendes i CG (53,1% og 52,7%, henholdsvis) og PUD (61,2% og 62,6%, respektivt) pasienter (tabell 1). PCR oppdaget h.pylori
i 12,75% hos pasienter med normal mageslimhinnen mens histologi var positiv for bare 0,8% av prøvene. Disse resultater kan forklares ved den mer følsomme karakteristikk av syren nuklein basert metode. For å forbedre diagnose av Helicobacter pylori
noen forfattere antyder analyse av multiple biopsier [44]. For å bekrefte spesifisiteten av PCR-fragmenter oppnådd, amplikonene fra to prøver med histologisk test for H. pylori
positive og to prøver med histologisk test for H. pylori
negativ ble sekvensert. BLASTN analyse av alle fire biopsi forsterket PCR-fragmenter med 23S rDNA H. pylori
spesifikke primere [Genbank: KF680642, Genbank: KF680643, Genbank: KF680644 og Genbank: KF680645] avslørte identiteten til 100% med 23S rDNA referent til annen stammer av H. pylori
. Følgelig er det utviklet PCR-analysen hurtig og nøyaktig, og kan brukes som en praktisk metode for påvisning av H. pylori
infection.Table en klinisk utfall og sammenligning av H. pylori diagnostiske metoder Book PUD ( n = 123)
CG (n = 706)
N (n = 290)

His +
His
His +
His
His +
His

T
PCR +
63
13
76
286
89
375
1 36
37
488
PCR
14
33
47
86
245
331
1 252
253
631
T
77
46
123
372
334
706
2
288
290
1119
CG
kronisk gastritt, PUD
mavesår, N
normal mageslimhinnen forbundet eller ikke gastroøsofageal reflukssykdom (GERD), PCR
polymerase chain reaction, Hans
histologi.
Antibiotikabehandling behandling~~POS=HEADCOMP av mage sykdommer anbefales når H. pylori
diagnose er positiv og bakterien klassiske eradikasjonsbehandling sammensatt av klaritromycin, amoxicillin og en pumpe proton inhibitor er foreskrevet. Den valgte terapi presentere en høy feil av H.pylori
eradikasjonsrate i områder hvor resistens mot clarithromycin er høyere enn 15%, sannsynligvis som følge av den utbredte bruken av dette antibiotikum ved luftveisinfeksjoner, spesielt hos barn [9]. Globalt primære motstand av H. pylori
til klaritromycin varierer fra 1 til 29% [46]. I Brasil, flere studier har rapportert en klaritromycin motstand prevalens på 7-16% hos voksne [19, 20, 22, 47] og 27% hos barn [23]. Derfor, for å forbedre den empirisk valg av H.pylori
assosiert sykdom terapi, undersøkte vi den regionale frekvensen av H.pylori
klaritromycin motstand gjennom detektering av de store tilhørende punktmutasjoner, A2142G og A2143G ved domene V i H. pylori
23S rDNA.
Således ble alle 488 H.pylori
PCR-positive prøvene analysert ved hjelp av RFLP av 768 bp PCR-fragment oppnådd med primerne Hp23Sr6 /7 med restriksjonsenzymene MboII
og BsaI
, med påvise mutasjoner A2142G og A2143G på domene V av H. pylori
23S rDNA, henholdsvis (figur 1). Bare 12 prøver (2,46%) viste den muterte restriksjonsmønster, tre (25%) husing A2142G mutasjon, syv (58,3%) A2143G og en prøve (8,7%) viste begge rDNA punktmutasjoner i PCR-23S rDNA 768 bp fragment. En prøve viste en delvis spalting med enzymet MboII plakater (figur 1). De punktmutasjoner A2142G og A2143G av amplikonene innhentet fra tre [Genbank: KF680646, Genbank: KF680647 og Genbank: KF680647] og syv [Genbank: 680649, Genbank: 680650, Genbank: 680651, Genbank: 680652, Genbank: 680653, Genbank: 680654 og Genbank: 680655] forskjellige biopsi prøver, henholdsvis, ble bekreftet ved sekvensering. Det var ingen assosiasjon av klaritromycin H.pylori
motstand punktmutasjoner med pasientenes alder eller kjønn (data ikke vist).
Utbredelsen av H. pylori
klaritromycin motstand som finnes i vår region var lik den som finnes i utviklede land som Italia og Tyskland [7] og i den søramerikanske u-land Paraguay [48]. Disse resultatene bekrefter den høye regional variasjon av H.pylori
antibiotikaresistens og til tross for økende klaritromycin motstand over hele verden, i Marilia, ble en lav motstand hastighet opprettholdes over en periode på fire år. Videre PCR /RFLP var en rask og nøyaktig metode for påvisning av klaritromycin motstand gjennom en genmutasjon direkte i mage biospsy prøver og kan brukes sammen med histologi å bestemme for forskrivning av klaritromycin regime terapi.
H. pylori
23S rRNA domene V A2142G og A2143G punktmutasjoner er de viktigste mutasjonene som finnes i H. pylori
kliniske isolater som er resistente til klaritromycin. Vi fant en høyere forekomst av A2143G forhold til A2142G mutasjon i våre prøver som er i overensstemmelse med de fleste brasilianske studier inkludert States of Minas Gerais, São Paulo og Recife [20, 34, 36]. A2143G men ikke A2142G punktmutasjon viser en synergistisk effekt av klaritromycin og amoxicillin, som har blitt brukt sammen i førstelinje H. pylori
diett [49], forsterker behovet for å undersøke dette klaritromycin 23S rDNA punktmutasjon før behandling. En prøve næret både A2142G og A2143G mutasjoner på domenet V av H. pylori
23S rDNA som også ble funnet i tre h.pylori
isolater innhentet fra pasienter i den brasilianske delstaten Minas Gerais [20]. Disse resultatene sammen med forekomsten av delvis fordøyelse av et 768 bp 23S rDNA PCR fragment (figur 1) kan være en indikasjon på magen kolonisering av flere stammer av H.pylori product: [50].
I Minas Gerais, Brasil, klaritromycin motstand har økt fra 4,48% i 1996 til 19,05% i 2000 [20], sannsynligvis på grunn av bruk av makrolider for behandling av andre infeksjonssykdommer. Vi fant ingen signifikant forskjell i prøver som er resistente mot klaritromycin henhold til den perioden av studien (data ikke vist). Disse dataene indikerer at i vår region resept og utnyttelse av makrolider ikke er utført på en høy skala. Flere studier er nødvendig for å bekrefte denne hypotesen.
Klaritromycin motstand reduserer den kliniske effekten av klaritromycin baserte trippelterapi. Men som utbredelsen av primær motstand av H.pylori
til klaritromycin grunn av rDNA 23S A2142G og A2143G nukleotidsubstitusjoner fortsatt lav i Marilia, standard klaritromycin inneholder trippelterapi er fortsatt gyldig som den mest effektive empiriske førstelinje eradikasjonsbehandling for H. pylori-infeksjon
.
Konklusjoner
utviklet PCR assay rettet mot 23S rDNA-genet fra H. pylori
er hurtig og nøyaktig, og kan brukes som en praktisk metode for påvisning av H .pylori
smitte direkte på mage biopsiprøver. Videre kan H. pylori
23S rDNA PCR-fragment erholdt brukes for å påvise punktmutasjoner 1728-2495 bp av H. pylori
23S rDNA domene V knyttet til klaritromycin motstand. Forekomsten av primære motstand av H.pylori
til klaritromycin grunn av 23S rDNA A2142G og A2143G nukleotidsubstitusjoner fortsatt lav i Marilia, og dermed standard klaritromycin inneholder trippelterapi er fortsatt gyldig som den mest effektive empiriske førstelinje eradikasjonsbehandling for H. pylori
infeksjon
Forkortelser
PUD.
mavesår
CG:
Kronisk gastritt

GERD:
gastroøsofageal reflukssykdom
PCR:
Polymerase kjedereaksjon
RFLP:
rflp.
Erklæringer
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros for hennes omsorg til alle pasienter inkludert i studien, og til Alex Gusmão da Silva for hans bidrag i å utføre den statistiske analysen. Dette arbeidet ble støttet av Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Stipend 03 /01223-0, 08 /01394-4; Stipend Rabl 2008 /01395-0, GACL 2005 /02482-6, THH 2003 /03675-7.
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12876_

• Udifferensiert-type adenokarsinom i ventrikkel: prognostisk effekt av tre histologiske typer
• Sikkerhet og foreløpige resultatene av perioperativ kjemoterapi og hyper intraperitoneal kjemoterapi (HIPEC) for høyrisikomagekreftpasienter