Genetisk polymorfisme i osteopontin arrangøren øker risikoen for avstand metastaser og død hos kinesiske pasienter med mage cancer

genetisk polymorfisme i osteopontin arrangøren øker risikoen for avstand metastaser og død hos kinesiske pasienter med magekreft
Abstract
Bakgrunn
in vitro og in vivo

studier har antydet at osteopontin (OPN) er forbundet med mange typer av kreft. Imidlertid har ingen studier rapporterte forekomsten av OPN polymorfismer og risikoen for magekreft. Målet med denne studien var å undersøke sammenhengen mellom OPN polymorfismer og magekreft i en kinesisk pasientpopulasjon.
Metoder
Tre genetiske varianter i OPN arrangøren ble genotypet ved hjelp av direkte sekvensering i 200 mage kreftpasienter og 200 kjønns- og alderstilpassede kreftfrie kontroller. Den 4-års overlevelse kurve ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test for hver enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) nettsted. Vi målte promoteren aktiviteten til -443 T → C polymorfisme ved hjelp av en dobbel luciferase reporter-analyse.
Resultat
For varianten ved nt -443 (CC), var det en signifikant forskjell mellom antall pasienter med stadium IV og de med stadium i magekreft (IA + IB; P =
0,014) og mellom de med stadium IV og alle andre stadier av magekreft (IA + IB + II + III; P =
0,02). For varianten ved nt -443 (CT), var det en signifikant forskjell mellom antallet av magekreftpasienter med stadium IV og de med trinn II (P =
0,013). Overlevelsesratene for pasienter med C /C-genotype var signifikant lavere enn for pasienter med de to andre genotyper (C /T, T /T). Dessuten var betydelig høyere luciferase-aktivitet observert i pGL3-C-konstruksjon i forhold til pGL3-T-konstruksjonen.
Konklusjoner
Denne undersøkelsen gir det første bevis på at variasjon ved nt -443 i OPN promoteren øker potensialet for gastrisk kreft metastasering og påfølgende død i den kinesiske befolkningen.
nøkkelord
osteopontin Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP Polymorfisme genetiske varianter metastaser Bakgrunn
Gastric adenokarsinom fortsatt den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og står for 738,000 dødsfall årlig [1] . Magekreft er den tredje vanligste kreftformen i Kina. Utviklingen av magekreft er assosiert hovedsakelig med Helicobacter pylori
infeksjon [2], men andre risikofaktorer inkluderer en diett høy i salt, røyking, inntak av syltet mat, og spesifikke genetiske bakgrunn [3]. Det har vist seg at H. pylori-infeksjon
er en uavhengig risikofaktor som fører til vedvarende kolonisering og kronisk betennelse i mageslimhinnen, og dermed øke risikoen for utvikling av peptisk ulcerasjon og gastrisk kreft [2, 4-6]. Imidlertid er det merkede inter-individuelle forskjeller i omfanget av betennelse blant personer med H. pylori
infeksjon, og kliniske konsekvenser bare utvikle seg i et lite antall av mage krefttilfeller. Multifaktorielle modeller tyder på at genetisk mottakelighet skyldes spesifikke variant alleler i polymorfismer kan påvirke utfallet av miljøeksponering [7].
Osteopontin (OPN) er et utskilt lim phosphoglycoprotein som inneholder en funksjonell Gly-Arg-Gly-Asp-Ser celle-bindende sekvens [8]. Den OPN
-genet er kartlagt til kromosom 4q24-Q25, og det har vist seg at OPN spiller en viktig rolle i tumormetastase [9]. OPN er blitt vist å bli uttrykt i tumorceller og i det omkringliggende stroma av mange humane kreftformer, slik som kolon, bryst, lunge, mage, endometrium, og skjoldbruskkjertelen, og gir forbindelse med ondartet invasjon [10-13]. Tidligere studier har vist at OPN ofte overuttrykt i human magekreft [14], og at ekspresjon av OPN mRNA var signifikant høyere i magekreft vev sammenlignet med ikke-tumorvev.
Flere polymorfismer er blitt beskrevet for OPN
gen, hvorav noen er forbundet med oligoarticular (eller pauciarticular) juvenil idiopatisk artritt, nyresten, og kronisk hepatitt C [15-18]. En fersk studie [19] rapporterte at pasienter med en G /G genotype ved nt -156 i OPN arrangøren ble oftere diagnostisert med avansert stadium (IIIB-IV) ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) enn de med andre genotyper, mens en annen rapport antydet at OPN polymorfismen kan være genetisk faktor for hepatitt B viral klaring og hepatocellulært karsinom forekomst [20].
det er for tiden ingen publiserte studier som vurderer forholdet mellom OPN
genetisk polymorfisme og risikoen for gastrisk kreftutvikling. Derfor er målet med denne studien var å finne ut om en sammenheng eksisterer mellom OPN polymorfismer og risikoen for magekreft i den kinesiske befolkningen.
Metoder
Motiver Fra 2005 til 2008, 310 urelaterte pasienter med magekreft (GC gruppe), ble registrert ved First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Alle pasientene var etniske Han-kinesiske innbyggere som histologisk hadde bekreftet adenokarsinom i ventrikkel. Kontrollgruppen (ikke-GC-gruppen) besto av et tilfeldig utvalg av 591 etniske Han-kinesere fra Jiangsu-provinsen. Etter å ha gitt skriftlig informert samtykke, ble alle deltakerne bedt om å tilveiebringe en blodprøve. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av First Affiliated av Nanjing Medical University (É0-SR-073).
Før sekvensering av genotyper i OPN
promoter, brukte vi SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, USA) programvare for å tilfeldig velge 200 GC pasienter og kjønns- og alders matche dem til 200 tilfeldig utvalgte kontroller av ikke-GC-gruppen. Vi evaluerte alle pasienter og kontroller for H. pylori
bruker en indirekte fast fase Immunokromatografisk (ICM) analysen for å undersøke tilstedeværelse av IgG antistoffer mot H. pylori plakater (Genelabs Diagnostics, Singapore). Denne testmetode ble tidligere validert i vårt laboratorium med en nøyaktighet på 92,3% [21].
Genomisk DNA fra kontroller og magekreftpasienter ble ekstrahert fra etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) -anticoagulated perifert blod ifølge den tradisjonelle proteinase K og fenol -chloroform metode, og lagret ved -70 ° C.
Analyse av polymorfismer i OPN regulatoriske omegn den OPN-66, -156 (rs17524488), og -443 (rs11730582) varianter ble genotypet ved direkte sekvensering av følelsen og anti-sense tråder følgende polymerase chain reaction (PCR) forsterkning av arrangøren reguleringsområdet -473 til -3 (forover primer 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; revers primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), som tidligere beskrevet [19]. PCR ble utført ved anvendelse av 50 ng DNA som et templat under følgende betingelser: 95 ° C i 10 min, deretter 36 sykluser ved 94 ° C i 30 s, en glødetemperatur i 60 s, og 72 ° C i 60 s, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 15 min. Etter å ha affinitet membran rensing ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), ble PCR-produktene underkastet syklussekvensering med de respektive forover og revers primer ved anvendelse av en automatisk ABI 3100-DNA sequencer ved GeneCore Bio Technologies (Shanghai Kina) .
Luciferase assay med SNP ved nukleotid (nt) -443 i OPN arrangøren Bedrifter den 250 bp fragmenter av OPN promoter (-590 til -340) bærer enten T eller C-allelet ble syntetisert av Invitrogen og satt inn oppstrøms for ildflue luciferase-genet i den pGL3-Enhancer plasmid-vektor (Promega, USA) i separate prosedyrer. Hver konstruksjon ble bekreftet ved sekvensering. En rekke OPN promoter-luciferaserapportørplasmid konstruksjoner ble transient transfektert inn i magekreft cellelinjer MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) og SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), og transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. De MKN28 og SGC-7901 cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. Aktiviteten av de forskjellige promotorer genotypen ble målt ved anvendelse av luciferase reporter Assay System (Promega, USA). Alle forsøk ble gjentatt i triplikat.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av SPSS 10,0 programvare. Kvantitative variabler avgang fra normalfordelingen, inkludert alder, ble oppsummert som gjennomsnitt og standardavvik (SD). Sammenligning av alder mellom saker og kontroller ble vurdert ved hjelp av en uavhengig Student t
-test. Sammenligning av ekstra mage svulster, H. pylori
infeksjon, og genotypefrekvensene mellom saker og kontroller ble vurdert ved hjelp av en chi-kvadrat-test og en Fishers eksakte test. Overlevelse ble beregnet ved Kaplan-Meier-metoden. Alle sannsynlighet (P
) verdier ble tosidige og statistisk signifikans ble angitt som P
< 0.05.
Resultater
Demografiske og kliniske kjennetegn ved pasientene
magekreft (GC) gruppe besto av 200 personer (64% mannlige), med en gjennomsnittsalder på 56,29 ± 3,46 år. Kontrollen (ikke-GC) gruppe besto av 200 personer, 64% var av dem menn, med en gjennomsnittsalder på 55,67 ± 4,21 år (tabell 1). Det var ingen signifikante forskjeller når det gjelder fordeling av alder og kjønn, samt H. pylori
seropositivitet. Clinicopathologic karakteristikker av pasienter og kontroller er vist i tabell 1.Table 1 Clinicopathologic karakteristikker av pasienter med magekreft karsinom og friske kontroller
Karakteristisk
No. av pasienter eller kontroller
P
Cases (n)
Control (n)
No.
200
200
Age, år
> 0,05
Mean
56.29
55.67
Standardavvik
3,46
4,21
Range
63
65
Kjønn
> 0,05
Mann fra 130
130
Kvinne
70
70
Helicobacter pylori
infeksjon
0,12
Seronegative
62
77
seropositive
138
123
Vaskulær invasjon
Fravær
155 -
Presence
45 -
lymfeknutemetastaser
fravær
80 -
Presence
120 -
levermetastaser
fravær
182 -
Presence
18
-
Peritoneal formidling
Fravær
172 -
Presence
28 -
TNM stadium -
IA
39
-
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNPs i promotorområdet av menneskelig OPN genet
direkte sekvensering av DNA-fragmenter mellom nt -473 og nt -3 pasienter og alders- og kjønns matchet kontroller avdekket 3 SNPs i OPN arrangøren, som ligger ved nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozygote, GG /G- (sletting) heterozygoter, G- /G- homozygote], nt -443 [CC homozygote, CT heterozygoter, TT homozygote] og nt -66 (figur 1), som vist i tabell 2 . det var ingen signifikant forskjell i fordelingen av disse SNPs (nt -66, -156, -443) mellom GC pasienter og kontroller. Fordelingen av genotyper for TNM stadier i magekreft er vist i tabell 3. Figur 1 skjematisk diagram og sekvenseringsdata for OPN promoteren. Representant tall for sekvensering analyse på arrangøren. SNP nt -443 har følgende lene: CC, CT, og TT. Det er en liten innførings ved nt-156, som har tre allelene: G /G, G /GG, GG /GG. SNP nt -66 har bare ett allel. TT
Tabell 2 Sammenligning av OPN promoter mellom magekreftpasienter og friske kontroller
Controls
Pasienter

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP
genotyper Book n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabell 3 Fordeling av genotyper for TNM stadier i magekreft Book De TNMS av mage cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Men om tumor-node-metastase TNM etapper, fant vi at for SNP ved nt -443 blant pasienter med CT genotype, var det en signifikant forskjell mellom pasienter med etapper II og IV (P
< 0,01) , og mellom stadium IV og alle andre trinn (IA + IB + II + III; P =
0,04; tabell 4). Tilsvarende blant pasienter med CC genotype ved nt -443, var det en betydelig forskjell mellom pasienter med trinn IV, og trinn I (IA + IB; P =
0,011) og mellom stadium IV og alle andre trinn (IA + IB + II + III; P
= 0,012; tabell 4). Det var ingen signifikante forskjeller mellom de TNM stadier og de to andre SNPs (NT -66 og nt -156) av OPN promoter. Vi fant heller ingen sammenheng mellom SNPs i OPN promoter og lymfeknute metastasis.Table 4 genotype fordeling av nt -443 i OPN arrangøren av magekreft TNM stadium
TNM stadier av magekreft

genotyper
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indikerer signifikant forskjell (P < 0,05).
Sammenhenger mellom genotyper i OPN promoter-regionen og overlevelse
Kaplan-Meier estimater for ulike genotyper på nt -443 i OPN
promoter er vist i figur 2 . de overlevelse for pasienter med C /C genotype var betydelig lavere enn overlevelse for pasienter med de to andre genotyper (C /T, T /T). Det var ingen signifikant sammenheng mellom overlevelse og genotyper på andre nettsteder (nt -156 og nt -66). Figur 2 Kaplan-Meier-overlevelses er betydelig lavere i magekreftpasienter med en C /C-genotype i forhold til de to andre genotyper ved nt -443 i OPN promoter.
Virkning av -443 T → C polymorfisme på promoteraktivitet
For å undersøke effekten av -443 T → C promoter region polymorfisme på transkripsjonen av OPN
genet, målte vi promoter-aktivitet med en Dual Luciferase reporter analysesystem og sammenlignet aktivitetene til -443C og -443 T lene ved hjelp av en forbigående transfeksjon analysen med MKN28 og SGC-7901 cellelinjer. Som vist i figur 3, var signifikant høyere luciferase-aktivitet generert med den pGL3-C-konstruksjon i forhold til pGL3-T-konstruksjon (P
= 0,001 for MKN28; P
= 0,021 for SGC-7901). Figur 3 Effekt av -443 T → C polymorfisme på promoteraktivitet. Betydelig høyere luciferasepreparater aktiviteter ble generert av pGL3-C konstruksjon i forhold til pGL3-T konstruksjon med (P
= 0,001 for MKN28; P
= 0,021 for SGC-7901)
Diskusjon
Montering. bevis tyder på at OPN spiller en rolle i reguleringen av tumormetastase og som OPN ekspresjon er særlig høy i metastatiske tumorer [22]. OPN er overuttrykt i kreftformer som har en høy tilbøyelighet til å danne benmetastaser. I skjelettmetastaser, er OPN vanligvis assosiert med grenseflaten mellom karsinom og benoverflaten, og dette synes å være relatert til økt bein resorptive aktivitet av osteoclaster [23]. Videre er høy OPN uttrykk i den primære svulsten assosiert med tidlig metastasering og dårlig klinisk utfall i human magekreft og andre kreftformer [24-27]., En fersk studie antydet at OPN arrangøren var assosiert med NSCLC [19]. I denne studien har vi fokusert på sammenslutning av disse SNPs med GC, og selv om fordelingen av genotyper i OPN
arrangøren var ikke signifikant forskjellig mellom GC pasienter og friske kontroller, det var signifikante forskjeller i fordelingen av genotyper ( CC) ved nt -443 mellom pasienter med stadium IV, og trinn i magekreft (IA + IB) og mellom stadium IV og de kombinerte, andre tre stadier av magekreft (IA + IB + II + III, Tabell 4). De overlevelse for pasienter med C /C genotype var betydelig lavere enn overlevelse for de to andre genotyper (C /T, T /T, figur 3). I tillegg ble betydelig høyere luciferase-aktivitet generert med den pGL3-C-konstruksjonen i forhold til pGL3-T-konstruksjon til. Reportergen analyse har vist at den haplotype -443C /-156 G /-66 T er forbundet med betydelig forbedret promoter-aktivitet sammenlignet med fem andre alleliske varianter som ble testet [28]. En nylig studie på melanommetastaser funnet at de som er homozygote for -443C allel uttrykte betydelig høyere nivåer av OPN mRNA sammenlignet med de som var enten heterozygote (CT) eller homozygot for den -443 T-allelet [29]. Transkripsjonsfaktor c-Myb binder seg til det område av OPN promoteren i en allel-spesifikk måte og induserer økt aktivitet av -443C i forhold til -443 T OPN
promoter [30]. Samlet utgjør disse data tyder på at variasjonen i nt -443 i OPN arrangøren spiller en rolle i GC progresjon og metastasering, spesielt for CC genotypen ved nt -443 i OPN
promoter. Hvorvidt polymorfismer av OPN er knyttet til uttrykk for OPN i kreftpasienter er fortsatt ukjent selv. Over-uttrykk for OPN ble funnet i magekreftprøver i en tidligere studie [14]. Derfor er flere studier for å ytterligere belyse dette funnet.
I denne studien fant vi at CT genotype ved nt -443 i OPN arrangøren viste signifikante forskjeller mellom stadium IV og stadium II magekreft, og også mellom scene IV og andre stadier av magekreft (IA + IB + II + III), men ikke mellom stadium IV og stadium III eller trinn I. den viktigste årsaken til dette kan være på grunn av det begrensede antall pasienter i hver undergruppe. Det er også mulig at transkripsjonsfaktoren c-Myb kan ha forbedret aktivitet av det område av OPN
promoteren som inneholdt CC eller CT genotyper, men ikke den andre genotype (dvs. TT) [29]. Men disse hypotesene kreve ytterligere undersøkelser i større studier.
Den nåværende genomiske funn hos friske kontroller var ikke identisk med tidligere funn blant japanske og italienske kontrollpersoner [30, 31]. Selv om tidligere rapporter tyder på at høy OPN er uttrykt ved høye nivåer i GC [17], fant vi ingen sammenheng mellom genotyper av OPN
arrangøren med risiko for GC. Vi har imidlertid funnet etniske forskjeller i SNPs av flere verts gener i GC pasienter [30, 31]. Derfor kan de foreliggende funn ikke gjelder for alle populasjoner. Likevel, selv om det ikke var noen sammenheng mellom OPN SNPs og GC magekreft følsomhet eller alvorlighetsgrad hos kinesiske pasienter, må våre funn tyder på at det er en sammenheng med spredning av GC.
Konklusjon
Som konklusjon, er dette den første studien av OPN genetisk polymorfisme og risiko for GC i en kinesisk befolkning. Vi har vist at genetisk polymorfisme ved -443 i OPN promoteren er assosiert med metastase og påfølgende død av GC. Derfor kan disse funnene har en tilnærming til å forutsi den kliniske utfallet av GC pasienter. Imidlertid er flere studier er nødvendig å bruke en større kohort av pasienter for å bekrefte disse funnene
. Merknader
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen bidratt likt til dette arbeidet
. Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av naturvitenskapelige fond i Kina (nr 81072032 og 30770992). Forfatterne takker Medjaden Bioscience Limited for korrekturlesing av manuskriptet.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Forfatternes bidrag
ZF deltatt i utformingen av studiet og utført statistisk analyse, CX utført luciferase assay, MT, HB unnfanget av studien, og particpated i sin utforming og koordinering, ZZ, ZG deltatt i utformingen av studien. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Transkripsjonsfaktor FOXO4 er nedregulert og hemmer tumor spredning og metastase i magekreft
• Fase I studie av imatinib, cisplatin og 5-fluoruracil eller kapecitabin i avansert esophageal og gastrisk adenokarsinom