Identificação de genes de referência válidos para estudos de expressão gênica de câncer de estômago humano por transcrição reversa-qPCR

Identificação de genes de referência válidos para estudos de expressão génica do cancro do estômago humano por transcrição reversa-qPCR
Resumo
fundo
A transcrição reversa quantitativa PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) é um método poderoso para a análise da expressão do gene. os níveis de expressão do gene alvo são geralmente normalizados para um gene expresso de forma consistente referência também conhecido como padrão interno, na mesma amostra. No entanto, muito esforço não tem sido dispendido até agora na busca de genes de referência adequados para o estudo do cancro do estômago usando RT-qPCR, embora a seleção de genes de referência ideais é fundamental para a interpretação dos resultados.
Métodos
Nós avaliadas a adequação dos seis genes de referência possíveis, beta-actina (ACTB), desidrogenase glyceraldehydes-3-fosfato (GAPDH), da hipoxantina-fosforibosil-transferase 1 (HPRT1), beta-2-microglobulina (B2M), subunidade ribossómica L29 (RPL29) e 18S RNA ribossômico (18S rRNA) em 20 pares de tecido normal e estômago tumor de pacientes com câncer de estômago e 6 linhas celulares de cancro do estômago, por RT-qPCR. . Empregando estabilidade expressão análises usando NormFinder e geNorm algoritmos que determinou a ordem de desempenho destes genes de referência e seus valores de variação

Resultados Este estudo RT-qPCR mostraram que não são estatisticamente significativos (p Art < 0,05 ) diferenças nos níveis de expressão de HPRT1 e 18S rRNA em 'normalidade' Versus 'tecidos do estômago tumor'. analisa a estabilidade por geNorm sugerem B2M-GAPDH, como melhor combinação de genes de referência para 'linhas celulares de cancro de estômago "; RPL29-HPRT1, pois "todos os tecidos do estômago '; e ACTB-18S rRNA, pois "todas as linhas de células do estômago e tecidos". NormFinder também identificou B2M como o melhor gene de referência para "linhas celulares de cancro de estômago", RPL29-B2M para 'todos os tecidos do estômago ", e 18S rRNA-ACTB para' todas as linhas de células do estômago e tecidos". As comparações de expressão normalizado do gene alvo, GPNMB, mostrou uma interpretação diferente de expressão do gene alvo dependem melhor único gene de referência ou combinação.

Conclusão Este estudo validou RPL29 e RPL29-B2M como referência os melhores genes individuais e combinação, para a análise de RT-qPCR de "todos os tecidos do estômago ', e B2M e B2M-GAPDH como o melhor gene de referência única e de combinação, para' linhas celulares de cancro de estômago '. A utilização destes genes de referência validados deverá proporcionar interpretação mais exata da expressão dos genes diferenciais a nível da transcrição em câncer de estômago.
Fundo
A transcrição reversa quantitativa em tempo real reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR) é uma ferramenta poderosa para a validação do diferenças de expressão gênica observados, por causa de sua maior sensibilidade e especificidade. Em estudos de expressão génica tradicionais, um "gene de referência", também chamado de "padrão interno" ou "gene de manutenção 'é utilizado para a normalização. A expressão da beta-actina (ACTB) e desidrogenase glyceraldehydes-3-fosfato (GAPDH), utilizados na maioria dos estudos [1], foi relatada a variar com as condições experimentais [2] e o estado clínico do tecido estudado (por exemplo,
asma), tornando estes genes inadequados como padrões internos para utilização na normalização da expressão do gene [3]. . Assim, a validade do gene de referência escolhida para a análise estatística é crucial para se evitar o risco de má interpretação dos dados e conclusões inválidos [4]
Sugeriu-se que pelo menos três considerações devem ser tidas em conta na escolha de um gene de referência: 1) constância da sua expressão em toda a intervenção, 2) a sua eficiência de amplificação e 3) a sua abundância, que deverá ser semelhante à dos genes de interesse [5]. Além disso, para garantir a relevância, precisão e exatidão das interpretações de RT-qPCR, recomenda-se que as orientações precisas para RT-qPCR MIQE (Informações mínima para Publicação de Quantitative Tempo Real-Experiment PCR) devem ser respeitados [6] . Várias ferramentas para a análise estatística, tais como NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] foram desenvolvidos para ajudar na escolha de genes de referência apropriados. Estas ferramentas avaliar as variações na expressão de um certo número de genes de referência potenciais e sugerem que gene de referência (s) é adequada para a normalização dos dados de expressão de genes num dado estudo.
Cancro do estômago é o quarto cancro mais comum em todo o mundo, com a uma relatados 934.000 casos em 2002 [10]. Sobrevivência de câncer de estômago é pobre já que os pacientes são muitas vezes diagnosticados somente depois que a doença já avançou significativamente [11], o que torna a detecção precoce muito importante. Triagem visando a detecção precoce envolve exame endoscópico. Para confirmar a presença de cancro, são tomadas biópsias de tecidos suspeitos e submetido a RT-qPCR para confirmar a expressão anormal de genes relacionados com o cancro. Mas genes de referência adequados têm de ser identificados para comparações válidas entre expressões de normal versus genes do cancro. genes de referência foram descritas para os estudos de RT-qPCR em vários cancros de outros tecidos [1, 12-21]. No entanto, parece haver consenso sobre genes de referência para estudos de expressão gênica em câncer de estômago. Por isso, procurou PubMed com os termos MeSH "câncer gástrico", "em tempo real", e "PCR". Em uma avaliação de 115 artigos publicados entre maio de 2007 a novembro de 2009, verificou-se que GAPDH (53 casos; 46,1%) e ACTB (41 casos; 35,7%) foram os genes de referência mais frequentemente utilizados em estudos de câncer gástrico; seguido de rRNA 18S (8 casos; 7,0%), beta-2-microglobulina (B2M; 3 casos; 2,6%), da hipoxantina-fosforibosil-transferase 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), proteína de ligação a TATA (TBP; 1 caso; 0,9 %), e beta-tubulina (TUBB; 1 caso; 0,9%). Em cinco casos (4,3%), curva padrão externo foi utilizado para a quantificação absoluta (AQ) em vez de valor normalizado pelo gene de referência.
O presente estudo, portanto, foi projetado para encontrar as melhores genes de referência para os estudos de expressão gênica em câncer de estômago . Neste estudo, foram investigados os cinco genes de referência que têm sido mais utilizados genes em estudos de câncer de estômago (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, e HPRT1) e para comparação, RPL29, um gene de referência utilizado em outros estudos de câncer, em "linhas não-estômago de células cancerígenas", "linhas celulares de cancro do estômago», «tecidos normais do estômago" e "tecidos do estômago tumorais" (Tabela 1). A fim de escolher o gene de referência mais apropriado a partir da lista acima, nós comparamos as expressões de NMB glicoproteína (GPNMB), o nosso gene alvo, com os da lista acima mencionada de uma possível "referência" genes.Table 1 genes de referência potenciais avaliadas este estudo.
símbolo do gene
de acesso GenBank
Gene nome
localização Genomic
Descrição
ACTB
NM_001101
Beta-actina
7p15-12
Citoesqueletal proteína estrutural
GAPDH
NM_002046
gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase
12p13
Oxirredutase na glicólise e gliconeogênese
HPRT1
NM_000194
hipoxantina fosforribosil transferase 1

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