PLoS ONE: N-Terminal Полипептид аннексина A2 Уменьшает Заражение Mycoplasma hyorhinis для клеток рака желудка

Абстрактный
<р> Mycoplasma инфекции у человека и его загрязнение в клеточных культурах во всем мире проблемы. Препараты, доступные в настоящее время для профилактики или лечения микоплазменной инфекции страдают от низкой чувствительности, сильным сопротивлением и высокой токсичностью. Наша предыдущая работа показала, что Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) инфекция была опосредована взаимодействием между P37 из M
. hyorhinis
и аннексина A2 (ANXA2) клеток-хозяев, однако поступательная значение этого механизма было неизвестно. При этом, мы синтезировали N-конец полипептида ANXA2 (A2PP) и обнаружили, что A2PP может уменьшить инфекции M
. hyorhinis
для клеток рака желудка и блока M
. hyorhinis
инфекции, вызванной миграции клеток. Кроме того, мы обнаружили, что A2PP может уменьшить M
. hyorhinis
загрязнение прохода клеток. Кроме того, по сравнению с коммерческими антибиотиками, обычно используемыми в культуре клеток, чтобы предотвратить M
. hyorhinis
инфекция, A2PP продемонстрировал более эффективность, но низкую токсичность на рост клеток. Таким образом, наше исследование впервые показало потенциал A2PP в области лечения и профилактики M
. hyorhinis
инфекция
<р> Образец цитирования:. Юань S, L Qu, Shou C (2016 г.) N-Terminal Полипептид аннексина A2 Уменьшает инфекция Mycoplasma hyorhinis
в клетках рака желудка , PLoS ONE 11 (1): e0147776. DOI: 10.1371 /journal.pone.0147776
<р> Редактор: Гернот Zissel, Universitätsklinikum Фрайбург, Германия
<р> поступила: 16 октября 2015 года; Принято 7 января 2016 г. Опубликовано: 26 января 2016
<р> Copyright: © 2016 Юань и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. Все соответствующие данные находятся в работе. Микрочипов данные были депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (присоединения) no.GSE73777
<р> Финансирование:. Финансируется Национального фонда естественных наук Китая (81572532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC получил финансирование. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что никакие конкурирующие интересы не существуют

Введение
<р> Патогенные микоплазмы, в том числе микоплазмы пневмонии ( M
. Пневмококк
), микоплазма hyorhinis ( M
. hyorhinis
), устные микоплазма ( M
. Orale
) и микоплазма гениталий ( M
. гениталий
), принадлежат к классу mollicutes, который является самым маленьким микроорганизмом живой по своей природе и могут дублировать независимо друг от друга [1-2]. Многие исследования показали, что заражение этими микоплазм была связана с развитием опухоли [3-8]. M
. Orale
вызывает хромосомных аномалий в диплоидных клетках человека и индуцирует трансформацию клеток [6]. Заражение M
. hyorhinis
или M
. гениталий
может увеличить миграцию и инвазивность простаты эпителиальных клеток [3]. M
. hyorhinis
инфекция была связана с артритом, серозитом, бесплодия и рака человека [9-12].
<Р> Кроме того, загрязнение микоплазмы в клеточной культуре является серьезной проблемой, и скорость прохождения клеток инфицированных микоплазмой высока. Клеточные культуры широко используется в науках о жизни, таких, как в области фундаментальных исследований, клинических исследований, экспериментальной разработки и производства биологических продуктов, а также в области биофармацевтических и вакцины производства. Предотвращение клетки от микробного загрязнения имеет решающее значение для обеспечения качества исследований. Загрязнение микоплазмы является наиболее распространенной проблемой в культуре клеток с частотой 30% -60% [1]. Было показано, что четыре вида микоплазмы составляют более 95% от инфекции в культуре клеток, в том числе M
. Orale
, аргинином микоплазма ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
, и Левин не Acholeplasma ( а
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Из-за небольшого размера, микоплазма вряд ли можно найти под световым микроскопом и легко игнорируется исследователями. В последние годы многочисленные антибиотики, используемые для лечения микоплазмы неоднократно приводило к возникновению резистентности микоплазм. По этим причинам, крайне важно разработать новые средства для предотвращения или уменьшения микоплазменной инфекции.
<Р> Наша предыдущая работа показала, что M
. hyorhinis
инфекции зависит от взаимодействия p37 (основного мембранного белка M
. hyorhinis
) и хост ANXA2 через их N-терминальными доменами. Мы также нашли поликлональные антитела к P37 может блокировать инфекцию M
. hyorhinis
и уменьшение M
. hyorhinis
-promoted миграция раковых клеток желудка [17]. На основании этих открытий, мы подняли гипотезу о том, что пептид, синтезированный в соответствии с аминокислотной последовательностью ANXA2 N-концевой области (от 1 ^{го по 30 й а.о., здесь мы назвали этот пептид в качестве A2PP), может блокировать M
. hyorhinis
инфекция через его конкуренции с ANXA2 и, возможно, будет использоваться в качестве лекарственного средства для профилактики M
. hyorhinis
инфекции в клеточной культуре. В этом исследовании мы проверили эту гипотезу, а также сравнивали эффекты A2PP с другими лекарственными средствами в предотвращении M
. hyorhinis
инфекция.}

Материалы и методы

Cell Culture
<р> AGS клетку рака желудка линия была из Американской коллекции типовых культур (АТСС). BGC823 желудка линия клеток рака была создана Пекинский университет Народной больницы и был куплен из клеточной культуры Центра Китайской академии медицинских наук (Пекин, Китай). АГС и BGC823 клетки культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, полученной от фирмы Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). тест Mycoplasma был осуществлен перед каждым новым экспериментом с помощью ПЦР-амплификации M
. hyorhinis p37
.

Mycoplasma Распространение и Ко-культура
<р> Распространение Mycoplasma и совместное культивирование проводили, как сообщалось ранее [17,18,19].

антитела и реагенты
<р> Анти-p37 моноклональное антитело PD4 был сгенерирован и охарактеризованы ранее [5,20,21]. Поликлональные анти-P37 антителом получали из иммунизацией кролика с GST-p37 гибридного белка в соответствии со стандартным протоколом. Анти-EGFR и анти-фосфо-EGFR, был приобретен у фирмы Cell Signaling Technology (CST, США). Анти-ANXA2 был от Novus биотехнологии (Novus биотехнологии, США). Анти-фосфо-ANXA2 был из Санта-Круз (Santa Cruz, CA, США). A2PP (1 ^{го по 30 й аа) и различные усеченные A2PP пептиды, включая A2PP-Nd4 (5 го по 30 й аа), A2PP-ND8 (9 го по 30 й аа), A2PP-Nd12 (13 й до 30 й аа), A2PP-Nd16 (17 го по 30 й аа), A2PP-Cd4 (1 й до 26 й аа), A2PP-CD8 (1 го по 22 й аа), A2PP-CD12 (1 го по 18 й аа), A2PP- CD16 (1 го по 14 й аа), вместе со случайными пептидами управления (CONP) были синтезированы Sbsbio (Пекин, Китай). Противомикробные микоплазма I (MYCO I) и микоплазма II (MYCO II) были приобретены у M &Amp; C GENE TECHNOLOGY (Пекин, Китай). Ципрофлоксацин (CIP) был от Double-Crane Pharm (Пекин, Китай).}

Обнаружение M
. hyorhinis
количественной ПЦР (КПЦР)
<р> ДНК экстрагировали из АГС или BGC823 клеток после M
. hyorhinis
инфицирование ДНК буфера для лизиса (50 мМ Трис, рН 8,5, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Tween-20 и 200 мг /л протеиназы К) в соответствии со стандартным протоколом. КПЦР проводили с 30 нг ДНК и SYBR Green ПЦР в реальном времени 2 × премикс комплект (Takara, Оцу, Япония), используя Step One систему из ABI (Фостер-Сити, штат Калифорния, США). Программы реакции и p37
-специфических праймеров (вперед: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'обратного: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3') были уже сообщалось ранее [22]. Для сравнения M
. hyorhinis
уровни ДНК в клетках, GAPDH
(вперед: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', обратный: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') был усилен в качестве контроля, и данные были проанализированы с использованием 2 -ΔΔCt метод. Праймеры были синтезированы Sangon (Шанхай, Китай).

вестерн-блоттинга
<р> Клетки собирали из чашки для культивирования с 2 × SDS загрузки буфера. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Вестерн-блоттинга были выполнены, как описано ранее [23].

Cell-ELISA
<р> 96-луночного засевали клетками (1 × 10 4 /а), с последующей обработкой указанных пептидов и инфекции M
. hyorhinis
в течение 24 часов. Клетки иммобилизовали с 0,05% глутаральдегида в течение 10 мин, затем клеточные ELISA проводили, как описано ранее [24].

твердофазных Анализ связывания и спускающее Анализ
<р> рекомбинантные GST-p37 и GST белки были получены и очищены, как описано ранее [17]. ГСТ-P37 и GST разводили в буфере (0,1 М Na <суб> 2СО <суб> 3, 0,1М раствором NaHCO <суб> 3, рН 9,6) и с покрытием в 96-луночные планшеты при 4 ° С в течение ночи. Планшеты отмывали с помощью PBS в течение трех раз и блокированы 5% обезжиренное молоко /PBS при комнатной температуре (КТ) в течение 2 часов. После промывания PBS, указано, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч концентрации биотин-конъюгированные A2PP (синтезированного Sbsbio) был. После промывки PBST в течение 3-х раз, стрептавидин-конъюгированные HRP (Baltimore Pike, Уэст-Гроув, штат Пенсильвания, США) добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После проявления цвета с орто-фенилендиамина (Sigma), оптической плотности при 490 нм (OD490) регистрировали с помощью микропланшет-ридера (Bio-Rad 550). Для выпадающим анализа, 100 нг GST-p37 или GST белок совместно инкубировали с 20 мкМ биотин-A2PP и стрептавидином бусин (GE Healthcare, Питтсбург, штат Пенсильвания, США) в буфере для связывания (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, и 1 × полные ингибиторы протеазы) при 4 ° С в течение ночи. Осадок промывали буфером для связывания, в четыре раза и анализировали с помощью вестерн-блоттинга.

Со-иммунопреципитации

М
. hyorhinis
зараженные клетки (BGC823 или AGS) гомогенизируют в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, и 1 × полные ингибиторы протеазы) при 4 ° С в течение 10 мин. После того, как 12, 000 г центрифугирование в течение 10 мин при температуре 4 ° С, надосадочную жидкость извлекали. Белковые лизаты (500 мкг) инкубировали с 20 мкМ A2PP или CONP, 1 мкг анти-ANXA2 плюс протеин G-сефарозы (GE Healthcare) при 4 ° С в течение ночи. Преиммунизированных IgG (1 мкг) использовали в качестве контроля. Осажденные гранулы промывали буфером для лизиса в четыре раза, элюировали в 2 × загрузочном буфере, вареное, и анализировали с помощью вестерн-блоттинга.

иммунофлуоресценции
<р> Клетки высевали на покровные и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали указанными пептидами и инфицировали M
. hyorhinis
в течение 24 часов. Затем клетки промывали охлажденным льдом PBS в течение трех раз, фиксировали в 4% параформальдегид в течение 15 мин при комнатной температуре. После блокировки в течение 1 ч в 5% BSA /PBS, клетки инкубировали с указанными антителами при КТ в течение 1 ч. Затем клетки были промыты 3 раза снова с помощью PBST и инкубировали с FITC или TRITC-меченых вторичными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания PBS и с counterstaining с DAPI, клетки были установлены на 50% глицерин /PBS. Цейса LSM780 конфокальный микроскоп (Zeiss Microsystems, Oberkochen, Германия) для наблюдения локализации указанных белков использовали.

Миграция клеток Анализ
<р> Transwell камера с 8,0 мкм мембранам (Corning, Нью-Йорк, США) использовали в анализе миграции клеток. Нижняя камера была заполнена 800 мкл среды, содержащей 10% FBS как хемоаттрактанту. Клетки ресуспендировали в среде без сыворотки, содержащей M
. hyorhinis
плюс A2PP или CONP, затем осторожно переносят на верхнюю камеру каждого аппарата Transwell при плотности 2 × 10 5 клеток /мл (120 мкл /камера). Клетки давали возможность мигрировать в течение 24 ч при 37 ° С. Верхняя поверхность каждой мембраны была очищена от клеток с помощью ватного тампона. Клетки проникшие к нижней стороне мембраны, фиксировали в холодном метаноле, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали в девяти случайно выбранных микроскопических полей на лунку. Каждый образец был подготовлен в трех экземплярах камер и каждый эксперимент повторяли в течение по крайней мере 3 раза.

пролиферации клеток пробирного
<р> желудочные раковые клетки были высеяны в 96-луночные культуральные планшеты при плотности 5 × 10 3/100 мкл /лунку в трех повторах, и обрабатывали указанными реагентами. Пролиферации клеток количественно путем слияния клеток с CloneSelect Imager (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США).

Microarray Анализ и в режиме реального времени RT-PCR

AGS и BGC823 клетки ( 1 × 10 ^{6 на 10 см 2 пластины) обрабатывали A2PP, CIP, MYCO I и II MYCO в течение 24 ч, промывали PBS, и собирают в реагенте Trizol. Образцы РНК исследовали в ОЕ биотехнологии (Шанхай, Китай) с помощью Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ человека массив экспрессии генов. Микрочипов данные были депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (присоединении no.GSE73777). Исходные данные регистрировали с помощью Affymetrix GeneChip командной консоли (версия 4.0, Affymetrix). Затем программное обеспечение GeneSpring (версия 12.5, Agilent Technologies) был использован для завершения базового анализа с исходными данными. Начнем с того, необработанные данные нормализовали с алгоритмом СМД. Дифференциально выраженные гены были затем идентифицированы с помощью кратном изменения. Порог, установленный для вверх и вниз регулируемых генов была складка изменение ≥ 2,0. Затем, GO и анализ KEGG были применены, чтобы выбрать из генов, связанных с клеточным циклом и апоптозом клеток. В режиме реального времени RT-PCR использовали для подтверждения результатов микрочипов и осуществляется в соответствии с инструкцией производителей (SYBR, TOYOBO). Уровни экспрессии генов, связанных с нормализовались через GAPDH
и 2 -ΔΔCT использовали для расчета относительного экспрессии генов. Праймеры для реального времени RT-PCR ( ATF
, вперед, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', обратный, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, вперед, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', обратный 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; <ЕМ> CEBPB
, вперед, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', обратный 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') были синтезированы Sangon <. BR>}

Статистический анализ
<р> Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Различия были проанализированы с помощью дисперсионного анализа с использованием SPSS 11.0 программного обеспечения и P ≪ 0,05 считалось статистически значимым.

Microarray инвентарный номер
<р> микрочипов данные были депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (присоединение нет. GSE73777).

Результаты <бр>

A2PP не имеет никакого эффекта на жизнестойкость или миграции клеток рака желудка

для того чтобы оценить роль N-концевого домена ANXA2 в в M
. hyorhinis
инфекции, мы в первую очередь синтезируют A2PP пептид, соответствующий N-концом ANXA2 (рис 1А). Биотин маркированы A2PP было показано, специфически взаимодействовать с GST-P37 в твердой фазе анализа связывания (рис 1B) и ниспадающий анализа (рис 1C). Мы заметили, что A2PP не влияет на морфологию AGS и BGC823 клеток (рис 1D). Кроме того, в концентрациях менее 20 мкм, A2PP не ингибирует пролиферацию клеток (рис 1E), предполагая, что A2PP имеет минимальную токсичность по отношению к клеткам. EGFR, участвует в регуляции ANXA2 фосфорилирование [17,25,26], в то время как A2PP не имели никакого влияния на фосфорилирований или уровней белка РЭФР и ANXA2 [Фиг.2А]. К тому же, A2PP не имели никакого влияния на миграцию AGS и BGC823 клеток (фиг.2В и 2С). Клеточная локализация ANXA2 регулируется его фосфорилирования, что имеет решающее значение для его функции [17,27,28]. Мы нашли A2PP не изменили внутриклеточную локализацию эндогенных ANXA2 (рис 2D). Эти результаты указывают на то, что в одиночку A2PP не имеет никакого влияния на злокачественных фенотипов или EGFR-ANXA2 сигнализации клеток рака желудка.

A2PP Понижает M
. hyorhinis
Заражение
<р> Наша предыдущая работа показала, что N-терминал ANXA2 опосредует M
. hyorhinis
инфекции [17]. Как показано в результате клеточного ELISA анализа, мы обнаружили, что M
. hyorhinis
инфекция была блокирована A2PP в зависимости от дозы в BGC823 и AGS клеток, но CONP-обработанные клетки были еще сильно заражены M
. hyorhinis
(рис 3А). Эти результаты были подтверждены анализами КПЦР (рис 3B). Последовательно, A2PP также пониженные уровни протеина p37 белка в Вестерн-блоттинга анализа (рис 3C и 3D). В то же время, уровни phophos-AXNA2 и phophos-EGFR в инфицированных клетках были подавлялась при обработке с A2PP (рис 3C и 3E), в то время как общий уровень AXNA2 и EGFR были относительно стабильными (фиг.3С). При анализе иммунофлуоресценции, A2PP было обнаружено, ингибирует M
. hyorhinis
инфекции, вызванной накоплением p37 и совместная локализация между P37 и ANXA2 (рис 4а). В анализе со-иммунопреципитации с белком лизатов из M
. Hyorhinis
инфицированные клетки, A2PP уменьшилось взаимодействие между P37 и ANXA2 (рис 4б). Вместе эти свидетельства поддерживают идею, что A2PP может уменьшить M
. hyorhinis
инфекции и подтвердили наше предыдущее открытие, что N-терминал ANXA2 требуется для опосредования M
. hyorhinis
инфекции [17].

A2PP Подавляет M
. hyorhinis
индуцированный миграции
<р> Наши предыдущие исследования показали, что M
. hyorhinis
инфекция может способствовать миграции клеток рака желудка [17, 23]. В данном исследовании мы заметили, что M
. hyorhinis
-promoted миграции клеток рака желудка была не влияет на CONP, но дозозависимо ингибировалась A2PP (рис 5А и 5В). Эти результаты свидетельствуют о том, что A2PP тормозится M
. hyorhinis
индуцированная миграция, которая была связана с его способностью уменьшать инфекции раскрученной фосфорилирование по EGFR и ANXA2 (рис 3C и 3E).

A2PP имеет существенные Motif для уменьшения M
. hyorhinis
Заражение
<р> Чтобы охарактеризовать критический мотив A2PP, мы стремились определить, уменьшает ли различных усеченных пептидов A2PP (фиг.6А) может M
. hyorhinis
инфекции. При анализе КПЦР, A2PP и усеченные пептиды A2PP-Nd4, ND8, Nd12, CD4, CD8, CD12 и уменьшенный M
. hyorhinis
инфекции в клетках рака желудка, но A2PP-Nd16 и A2PP-CD16 удалось уменьшить M
. hyorhinis
инфекция (рис 6В). Аналогичная картина торможения была получена из анализа Вестерн-блоттинга (фиг.6С). Эти результаты указывают на наличие специфического мотива A2PP имеет важное значение для его способности уменьшить M
. hyorhinis
инфекции. Для дальнейшего сопоставления основных последовательностей этого потенциального мотива, мы синтезировали две пептиды, соответствующие 11 й -20 й (аа называется, как A2PP-10aa) и 13 й -18 й аа (называется как A2PP-6AA) (рис 7А). В КПЦР анализе оба пептида может привести к уменьшению M
. hyorhinis
инфекция (рис 7В), которая была поддержана Вестерн-блоттинга анализа (рис 7С). Следует отметить, что ингибирующее действие A2PP-10aa были лучше, чем у A2PP-6AA, но эффекты обоих пептидов были менее надежными, как у A2PP (рис 7В и 7С). Thesefore, центральные последовательности (11 й -20 й) из A2PP может быть существенным мотивом для ингибирования M
. hyorhinis
инфекции.

Сравнение A2PP с другими лекарственными средствами в предотвращении M
. hyorhinis
Заражение

M
. hyorhinis
был одним из основных источников загрязнения клеточной культуры [13,14,15]. Лучший способ избавиться от M
. hyorhinis
инфекция отбрасывать клетки и быстро стерилизовать все контактировали сосуды, но некоторые инфицированные клетки не могут быть заменены в нескольких случаях. Следовательно, крайне важно использовать специфические антимикробные подходы для предотвращения или устранения M
. hyorhinis
инфекции. Там были различные противомикробные средства для предотвращения M
. hyorhinis
от заражения. Например, ципрофлоксацин (CIP) может уничтожить M
. hyorhinis
в подходящей концентрации [29]. Два антимикробные компоненты, названные, как микоплазмы I (MYCO I) и микоплазма II (MYCO II) может уменьшить M
. hyorhinis
инфекции путем блокирования его синтеза белка и нуклеиновых кислот. Тем не менее, некоторые проблемы, такие как низкая чувствительность, сильное сопротивление и высокую токсичность может ограничить их применение в клеточной культуре. Исходя из этих соображений, мы считаем, что необходимо сравнение эффективности A2PP, CIP, MYCO I и II MYCO в предотвращении M
. hyorhinis
инфекции. По Вестерн-блоттинга и анализы КПЦР, мы обнаружили, что тормозящее влияние A2PP по M
. hyorhinis
инфекция была аналогична MYCO I, но был лучше, чем у безразборной мойки и MYCO II (рис 8A и 8B). Интересно, что мы обнаружили, что A2PP также может эффективно устранить M
. hyorhinis
инфекции в сильно зараженных клетках в процессе переходов из P <югу> 1 до P <югу> 3 (рис 8C и 8D). Кроме того, по сравнению с MYCO I и II MYCO, A2PP имели менее ингибирующее действие на пролиферацию клеток (фиг.9а). Для того, чтобы исследовать механизмы A2PP, CIP, MYCO I и эффекты MYCO II, на пролиферацию клеток, мы провели анализ микрочипов и просеивают подмножество дифференцированно выраженных генов в A2PP, CIP, MYCO I и II MYCO обработанных клеток. Количественный анализ RT-PCR показали повышенную экспрессию связанных с апоптозом генов ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB
) с помощью MYCO I и лечения MYCO II, но небольшие изменения были наблюдается в A2PP и CIP групп (рис 9б). Эти результаты указывают на то, что A2PP имеет меньшую токсичность и более профилактический потенциал в блокировании M
. hyorhinis
инфекции в культуре клеток.

Обсуждение
<р> Mycoplasma инфекции и загрязнения по-прежнему широко распространены сегодня и приносят значительные риски для пациентов и качества исследований. В последние годы некоторые исследования показали, что микоплазменная инфекция была также связана с онкогенеза [3-8]. Микоплазмы инфекция может вызвать повреждение ДНК, влияют на экспрессию генов, и разрушают контрольную точку клеточного цикла и апоптотической реакции [30]. M
. hyorhinis
был обнаружен у 56% рака желудка, 55,1% случаев рака толстой кишки и 39,7% случаев рака молочной железы ткани [20]. Кроме того, серологические исследования показали, что 36% доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) и 52% раковые ткани простаты были M
. hyorhinis
положительный [4]. Эти исследования указывают на возможную связь между M
. hyorhinis
инфекции и возникновение опухолей [4,20]. Более того, в процессе культивирования клеток, наиболее распространенными источниками загрязнения являются микоплазмы, бактерии и плесень, но скорость загрязнения микоплазмы относительно выше [13]. Результаты различных групп показали, что скорость загрязнения микоплазмы колебалась от 15 до 80%, а некоторые даже достиг 100% [15,31]. Анализ последовательностей ДНК из 1000 геномов проекте подразумевалось, что 7% образцов были загрязнены микоплазмы [32]. Тем не менее, предотвращение микоплазма инфекции и загрязнения трудно. Во-первых, из-за плеоморфными, пластичность, фильтруемость и легкой растворимости, микоплазмы может проходить через мембрану микрофильтра легко, что делает их существование на поверхности клетки-хозяина или быть эндоцитоз клетками [1,13,33]. Во-вторых, микоплазм не хватает клеточных стенок, что делает их нечувствительными к антибиотикам, которые ингибируют синтез клеточными оболочками, такими как пенициллин. Эффективные антибактериальные препараты существуют, но их непрерывные применения в клеточной культуре не рекомендуется из-за токсичности для клеток. Наконец, микоплазма является атипичные бактерии, вызывая difficulities в правильной диагностики [34].
<Р> Многочисленные противотуберкулезные препараты микоплазмы были разработаны, такие как эритромицин, Leucomycin, рокситромицин, офлоксацин и ципрофлоксацин. Однако побочные эффекты, токсичность, и сопротивление по-прежнему приносят неприятности для борьбы с загрязнением [10,11,35-38]. Кроме того, непрерывное введение этих антибиотиков не может полностью устранить микоплазму в течение еще одного или даже недель [39,40]. Поэтому очень важно найти новые способы, которые могут устранить микоплазменную инфекции или контаминации эффективно и своевременно. Решение этой цели, вероятно, может быть найден с помощью описания молекулярных механизмов, лежащих в основе микоплазменной инфекции.
<Р> Наше предыдущее исследование показало, что взаимодействие белка P37 с AXNA2 опосредованной M
. hyorhinis
инфекции [17]. В этом исследовании мы во-первых, синтезировали N-концевой полипептид ANXA2 (A2PP) и подтверждено его специфическое взаимодействие с GST-p37 белка в связывании с твердой фазой и стрептавидин выпадающие анализы. Вдохновленный такого взаимодействия, мы задавались вопросом, может ли A2PP противодействуют инфекции M
. hyorhinis
. Мы обнаружили, что A2PP, в соответствующей концентрации (20 мкМ), снижение M
. hyorhinis
инфекция, инфекция тормозится раскрученной миграции, а также снижение инфекцией спровоцировали фосфорилирование РЭФР и ANXA2 в желудочном раковых клеток. Эти эффекты были связаны с уменьшением взаимодействия между P37 и ANXA2. Следует отметить, что A2PP в одиночку выставлены минимальное воздействие на пролиферацию клеток и фосфорилирований РЭФР и ANXA2, предполагая, что A2PP, вероятно, будет полезным реагентом для уменьшения M
. hyorhinis
инфекции. Это понятие было поддержано сравнений A2PP-х и эффектов коммерческих антибиотиков "на пролиферацию клеток и M
. hyorhinis
инфекция, которая показала, что A2PP действительно имел меньшую токсичность к клеткам, но сильная способность противостоять инфекции.
<Р> Несмотря на это A2PP, полипептид 30 аа, может привести к уменьшению M
, hyorhinis
инфекции эффективно, нам все еще нужно понять, является ли усеченные формы A2PP может добиться подобного анти- M
. hyorhinis
способность. Используя несколько укороченных пептидов A2PP, мы обнаружили, что центральные последовательности (11 й -20 й) из A2PP может быть существенным мотивом для ингибирования M
. hyorhinis
инфекции. Тем не менее, ингибирующее действие усеченных пептидов были все еще не так сильна, как и у полной длины A2PP, предполагая, что фланкирующие последовательности имеют важное значение для поддержания нормальной структуры для достижения эффективного связывания с P37. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти эффекты модификации и /или мутации этого мотива на ингибировании M
. hyorhinis
инфекция

Выражение признательности
<р> Мы благодарим и выражаем глубокую признательность Лин Мэн, доктор Чжихуа Тянь (все из Пекинского университетского госпиталя рака &Amp; Institute). Для обеспечения критических реагентов или техническая помощь.

• PLoS ONE: Никотин Угнетает Цисплатин-индуцированному апоптозу с помощью регулирования а5-Nachr /Akt сигнализации в кл…
• PLoS ONE: низкая частота синхронного или метахронного Опухоли после эндоскопическую подслизистую Вскрытие для р…