Финансирование:. Эта работа была поддержана Fundação п Ciencia е Tecnologia, Португалия (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (краткосрочное общение АСТФ 60- 2009) и ЕС грант перспективы (HEALTH-F4-2008-201648). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Коллекция последовательности Е-кадгерина варианты и PDB-файлы FoldX расчеты и анализ SIFT С помощью команды FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel культура клеток и трансфекцию Функциональные анализы 1. E-кадгерина структурные модели 2. В силикомарганца только три мутации локализованы в области, отображаемой модели цитоплазматической β-катенин-связывающего домена (P799R, V832M, S838G): первые два были определены в настройке HDGC /EODGC, а другой спорадической, найдено в карциномы яичника [31]. Для этих мутаций мы проанализировали энергию связи между Е-кадгерина и бета-катенина и обнаружили, что ни один из них существенно не изменяет сродство связывания -катенина, в соответствии с предсказанием FoldX. Это в соответствии с в пробирке мы проанализировали данные, доступные для зародышевых HDGC /EODGC мутации носителей и, хотя информация ограничена, мы обнаружили, что наиболее полный набор данных является возраст начала или смерти, связанной с DGC. Когда мы Бокса-сюжет этих данных группировка "дестабилизирующих" и "Non-дестабилизирующий" носителей мутации, мы наблюдаем явное младшего возраста начала заболевания (диагноз или смерть) для первой группы (рис 2D), предполагая, что на родном государственную дестабилизацию счета для более ранней разработки. 3. Биологическое значение E-кадгерина дестабилизации Для того, чтобы понять, если дестабилизация может быть обнаружен в пробирке
<р> Е-кадгерина представляет собой межклеточную адгезию гликопротеин состоит из пяти внеклеточных повторами кадгерин типа, один трансмембранный регион и высококонсервативной цитоплазматического хвоста [1], [2]. Е-кадгерин выражается прежде всего в эпителиальных клетках и является основным компонентом слипчивых соединений (AJ). Эти узлы кластера, с помощью гомофильной взаимодействий, через внеклеточные домены молекул Е-кадгерина кальций-зависимой, на поверхности гомотипических соседних ячеек.
<Р> Роль Е-кадгерина в развитии опухоли хорошо описывается, и ее потеря экспрессии является отличительной чертой в карцином [3]. Экспериментальные данные подтверждают роль для Е-кадгерина комплекса как в подавлении инвазии и метастазированию образование [4]. Потеря экспрессии Е-кадгерина часто связан с генетическими событиями, такими как сайт сплайсинга и усечение мутаций, вызванных инсерций, делеций и нонсенс-мутации, в дополнение к миссенс мутации [5]. В спорадического диффузного рака желудка, изменения в гене, кодирующем Е-кадгерина (CDH1) находятся преимущественно в экзонов 7 до 9 [5], в то время как дольковых случаев рака молочной железы, они распространяются вдоль гена, без преимущественной точки доступа [6]. Миссенс мутации встречаются в этих двух типах спорадического рака, а также в синовиальной саркомы [7].
<Р> Семейную агрегации диффузного рака желудка (DGC) составляет 10% случаев рака желудка (GC), и только 1-3% являются наследственными [8]. Из этих семейных случаев, наследственная Диффузный Рак желудка (HDGC) определяется строгими критериями, которые были определены Международным Желудочный Cancer Linkage Consortium (IGCLC) в 1999 году: (1) два или более задокументированных случаев диффузного рака желудка в первой /второй степени родственники, по крайней мере с одной диагностированной в возрасте до 50 лет; или (2) три или больше случаев документально диффузного рака желудка в первой /второй степени родства, независимо от возраста. Раннее начало диффузного рака желудка (EODGC) считается, когда изолированный индивидуум с диагнозом DGC с менее чем 45 лет. Зародышевой линии мутации CDH1 встречаются в 30% случаев HDGC [9]. Ассоциация CDH1 мутаций и семейной рака желудка была впервые описана Гилфорд и др
в 1998 году [10] и с тех пор многие исследования сообщили различные типы CDH1 мутаций в HDGC [11], [12], [13 ]. Среди всех зарегистрированных CDH1
зародышевых мутаций, 77,9% являются нонсенс, сплайсинга и сайт (мутации со сдвигом рамки предсказанные для получения преждевременной терминации кодона) и 22,1% являются миссенс мутации [9]. Мутации, которые генерируют PTC, как правило, вредны, пациенты считаются носителями высокого риска, и рекомендуется иметь профилактическое тотальной гастрэктомии [14]. Патогенность миссенс мутаций не является простым делом, и эти изменения обычно называют в качестве Unclassified вариантов последовательностей (USVs) из-за отсутствия строгих критериев для оценки их воздействия. Несколько параметров были приняты во внимание при классификации Е-кадгерина USVs в HDGC: 1) совместно сегрегации мутации с DGC (в пределах родословных); 2) частота мутаций в здоровой контрольной популяции; 3) мутация рецидивы (в независимых семей). Анализ Сегрегация часто невозможно, с небольшим количеством доступных для молекулярной диагностики [15], пострадавших случаях, а также отсутствие клинической информации является лимитирующей стадией выводить патогенный значение этих мутаций. Для того, чтобы обойти это ограничение мы ранее разработанный в пробирке
функциональные тесты для оценки функционального воздействия E-кадгерина зародышевой миссенс мутаций [16], [17]. Тем не менее, такие исследования вовлекают лабораторные специфические условия эксперимента, а именно клеточной биологии анализы, и они требуют много времени для использования в рутину. В силикомарганца
предсказаниями надежны и быстрый анализ, который можно использовать для прогнозирования влияния точечных мутаций, особенно, когда структурная информация доступна [18], [19].
<Р> В этой работе, мы исследовали потенциал структуры на основе в силикомарганца
предсказаний, чтобы оценить влияние E-кадгерина миссенс мутаций, обнаруженных в наследственной и спорадической рака. Наш анализ основан на расчете изменений нативной состояния стабильности, индуцированные каждого варианта (ΔΔG = ΔG <суб> WT-ΔG <суб> Мут), полученные с помощью алгоритма белка дизайн FoldX [20], [21]. Интересно отметить, что в группе больных, несущих дестабилизирующих мутации (ΔΔG &GТ; 0,8 ккал /моль) характеризуется более молодом возрасте на момент постановки диагноза или смерти от DGC, предполагая, что потеря E-кадгерина нативной государственной стабильности способствует фенотипа заболевания. С помощью клеточной модели, мы проанализировали фенотип E-кадгерина дестабилизации, и обнаружили, что, когда мутация индуцирует уменьшилась нативной состояние стабильности, Е-кадгерин преждевременно разрушается протеасоме, демонстрирует более короткий период полураспада, что приводит к потере клея функция. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что дестабилизация составляет патогенностью E-кадгерина миссенс мутаций найден в HDGC.
Материалы и методы
<р> варианты Е-кадгерина, связанные с HDGC или EODGC были собраны из литературы, и соматические варианты были собраны из каталога соматической мутации в раковых заболеваний (COSMIC) базы данных (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/~~HEAD=pobj космическая /). Три новых последовательность Е-кадгерин варианты, в которых сообщалось в нашу лабораторию для функционального анализа: E185V, S232C и L583R. В последнее время L583R сообщалось, с связаны функциональными данными [22].
<Р> E-кадгерина связанных с PDB-файлы были идентифицированы с использованием автоматического поиска со швейцарским Model Repository (http://swissmodel.expasy.org). выравнивание последовательности Е-кадгерина человека и каждой из последовательностей, используемых для различных моделей осуществляли с помощью М-кофе [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Изображения были получены с PyMOL. После анализа последовательности и структурной гомологии, три PDB-файлы были выбраны для использования в качестве моделей:. Xenopus C-кадгерина эктодомен (PDB 1L3W), мышь E-кадгерина продомен (PDB 1OP4) и мышь β-катенин, взаимодействующий домен (PDB 1I7X) <бр>
мы построили три различные модели (продомен, внеклеточным и цитоплазматическим); три структуры были гуманизировать путем замены каждого из различных аминокислоте. Полученная структура была оптимизирована с помощью команды RepairPDB
и энергии, где анализируются при
Стабильность или команды AnalyseComplex
. Болезнь-ассоциированные мутации были получены с Buildmodel
команды, каждая мутация повторяется в пяти трасс. Энергии автоматический выход в FoldX, а изменение нативной состояния стабильности, ΔΔG между WT и мутант (ΔΔG = ΔG <суб> WT-ΔG <суб> Мут) также генерируется в отдельном файле, с соответствующим стандартом отклонения, и все энергичные меры наказания, связанные с каждой мутации. Только мутации с ΔΔG &GТ; 0,8 ккал /моль считаются безвредности
<р> Мы использовали Просеять (http://sift.jcvi.org/~~HEAD=dobj, сортировка Нетерпимый От Устойчив) оценить сохранение каждого аминокислотного замещения, как и ранее. описанные [25], с помощью функции мерцании GI:. 31073. только мутации со счетом ниже 0,05 считались Нетерпимый
<р> проп (http://www.cbs.dtu.dk/services /проп /) [26] был использован для оценки, если мутации могут оказывать влияние на продомен расщепления.
<р> Е-кадгерин WT кДНК клонировали в pIRES2-EGFP вектор в соответствии для изготовления инструкции (Clontech, Takara Bio) и мутации E185V, S232C, L583R и L583I хэ-кадгерина вызывались сайт-направленного мутагенеза, как описано ранее [27]. Пустой вектор (Mock) использовали в качестве контроля
<р> ЧО (клетки яичника китайского хомячка) клеток (номер АТСС: CCL-61). Выращивались в Альфа-MEM среде (Gibco, Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Gibco, Invitrogen) и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco, Invitrogen). Клетки спорадически оценивали микоплазма загрязнения imunofluorescence с DAPI. Клетки трансфицировали 1 мкг каждого из векторов, кодирующих различные формы Е-кадгерина (WT, E185V, S232C, L583R и L583I) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen), в соответствии с процедурой производства. Для получения стабильной создании клеточной линии, клетки были отобраны по устойчивости к антибиотикам до 5 мкг /мл бластицидин (Gibco, Invitrogen). Все клеточные линии поддерживали в увлажненном инкубаторе с 5% CO <суб> 2 при 37 ° C
<р> трансфицированы ЧО (клетки яичника китайского хомячка) клетки (АТСС номер:. CCL -61) были подвергнуты потоку citometry, используя измерение флуоресценции GFP, чтобы оценить эффективность трансфекции перед каждым экспериментом. Для медленного анализа агрегации, лунки 96-луночного планшета покрывали 50 мкл раствора агара (100 мг бактоагар в 15 мл стерильной PBS). Клетки отделяли с помощью трипсина и суспендировали в культуральной среде. Суспензию 1 × 10 5 клеток /мл готовили и 2 × 10 4 клетки высевают в каждую лунку. Планшет инкубировали при 37 ° С в увлажненной камере с 5% CO <суб> 2 в течение 48 часов. Агрегация оценивали в инвертированным микроскопом (4-кратным увеличением) и фотографировали с помощью цифровой камеры.
вестерн-блоттинга
<р> Клеточные лизаты получали с катенин буфера для лизиса (1% Тритон Х-100, 1 % Нонидет Р-40 в PBS), с добавлением ингибиторов протеаз (Roche) и ингибитор фосфатазы коктейль (Sigma). Количественную оценку белка было сделано с помощью модифицированного Бредфорда (Bio-Rad). Для каждого образца 25 мкг белка был загружен, отделенный в 7,5% SDS-PAGE, и электроблоттингу на нитроцеллюлозной мембране (GE Healthcare Life Sciences). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком и 0,5% Tween-20 в PBS. Иммуноблотинга проводили с антителами против E-кадгерина (1:1000; BD Biosciences), актин (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), и α-тубулина (1:10000; Сигма). Овцы против мышиного (GE Healthcare Life Sciences) или осла анти-козел (Santa Cruz Biotechnology) были использованы в качестве вторичных антител, с последующим обнаружением ЭХЛ (GE Healthcare Life Sciences). Иммуноблоты количественно Количество Одно программное обеспечение (Bio-Rad).
флуоресценция активированных сортировки клеток (FACS)
<р> Клетки выращивали на сливающийся монослой, удаленные с версеном (Gibco, Invitrogen) и ресуспендировали в охлажденном льдом PBS с 0,05 мг /мл CaCl <югу> 2. Суспензию 5 × 10 5 клеток центрифугировали в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту 4 ° C, и промывали в PBS с 0,05 мг /мл CaCl <суб> 2 3% БСА. Клетки инкубировали в течение 60 минут с первичным антителом против E-кадгерина, HECD1 (Zymed Laboratories) при 1:100 разведении. Клетки дважды промывали и затем инкубировали с анти-мышиного biotinilated (Dako) в 1:100 разведении. Клетки дважды промывали и затем инкубировали со стрептавидин PE-Cy5 (BD Pharmingen) при разбавлении 1:40. Наконец, клетки промывали, ресуспендировали в 500 мкл PBS, и 50000 клетки анализировали в проточном цитометре (Coulter EPICS XL-MCL). Данные анализировали с помощью программного обеспечения WinMDI.
иммунофлуоресцентного окрашивания
<р> Для иммунофлуоресценции и микроскопии клетки высевали на покровные стекла и выращивали до около 80% слияния, фиксированный в охлажденном льдом метаноле в течение 15 минут, 2 раза промывали PBS, и инкубировали с первичным антителом, разведенного в PBS 5% БСА, в течение 60 минут при комнатной температуре. Первичные антитела используются: мышиные моноклональные анти-Е-кадгерин (BD Biosciences); кролика против калнексину (Stressgen). Вторичные антитела использовали: Alexa Fluor 488 анти-мышь (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 анти-кроличий (1:500; Invitrogen). Покровные были установлены на стеклах, используя Vectashield с DAPI для обнаружения ядерных (Vector Laboratories). Видеосъемка проводилась на Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M флуоресцентный микроскоп с использованием 40 × цели. Изображения были получены с AxioCam HRM камерой и обрабатываются программным обеспечением Axiovison версии 4.8.
Клеточные Обработки
<р> Для ингибирования синтеза белка, клетки обрабатывали 25 мкМ циклогексемида в течение 8 ч и 16 ч, и количество общего E-кадгерина анализировали WB, как было описано ранее. Для анализа ингибирования Протеасома клетки высевали в 6-луночные планшеты, выращивали до приблизительно 80% слияния, и инкубировали в течение 16 ч с 10 мкМ MG132 (Калбиохем). Клеточные лизаты анализировали с помощью ВБ, как описано выше.
Результаты
<р> Там находятся несколько человек Е-кадгерин (хэ-хама) структуры доступны, и они охватывают лишь небольшие порции белка (таблица S1). Использование автоматического поиска швейцарской модели Repository, мы обнаружили, что PDB 1L3W, аннотированный для полной длины внеклеточного домена Xenopus EP-кадгерина (EP-хама), является высоко гомологичны к тому же домену в Е-кадгерина человека. Мы анализировали гомологию последовательности выравниванием с помощью M-кофе, множественного выравнивания последовательности, которая сочетает в себе выход из нескольких нескольких пакетов выравнивания последовательностей (PCMA, Роа, Mafft, мышцы, Т-Кофе, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. На фиг.1А показано выравнивание двух последовательностей внеклеточных доменов. Красные кирпичные регионы представляют собой идеальное соглашение между методами, используемыми, представляющие весьма сходные последовательности. Для того, чтобы построить структуру модели, мы удалили регионы, без сходства (рис 1А, звезды), и ограничили модель для регионов с надежным выравниванием (черная стрелка, рис 1А). Структура Xenopus была гуманизировать, как описано в материалах и методах и Фигура 1В показывает структурную выравнивание хэ-Cad EC1-EC2 доменов (с PDB 2O72) и EC1-EC2 домены Xenopus производного структурной модели. Обе структуры почти накладываются, что указывает на сходство между внеклеточными доменами Е-кадгерина человека и Xenopus EP-кадгерин не только на уровне последовательностей, но и на структурном уровне. Модель структура человеческого E-хама проявляет совместимые энергии со структурой из Xenopus, с небольшим уменьшением свободной энергии (ΔG), полученные для модели (ΔG <суб> реального = 559,99 ккал /моль и ΔG <югу> Модель = 531.77 ккал /моль), что указывает, что гуманизация не вносит дополнительных столкновений. В последнее время структура мыши внеклеточного домена был выпущен (PDB 3Q2V, таблица S1), и мы также использовали эту структуру как модель, как способ уточнить результаты, полученные с помощью модели Xenopus.
<Р> Мы установили две другие модели, охватывающие продомен (PDB 1OP4, от мыши N-кадгерин) и β-катенин цитоплазматический домен (PDB 1I7X, от мыши E-кадгерина), используя ту же методологию. В общей сложности три модели, покрывают большую часть белковой структуры (рис 1C): модель продомен охватывает позиции 28-117, внеклеточные модели позиции 155-697 и β-катенин цитоплазматический домен охватывает 782-838. На уровне домена околомембранной, одна структура имеет аннотацию, содержащую взаимодействующую поверхность между Е-кадгерина и P120 [28]. Эта структура содержит небольшое, 18 аминокислот длинный пептид (охватывающий позиции 756-773 на хэ-хама) с очень низким структурным содержанием, факторы, которые снижают надежность энергетических расчетов, поэтому мы отказались от этой структуры из анализа.
прогнозирования влияния рака-ассоциированной Е-кадгерин USVs
<р> Е-кадгерин мутаций не только генетическая причина HDGC, но они также часто встречаются в различных типах спорадические раковые заболевания. Мы проанализировали в силикомарганца
влиянии всех раковых ассоциированных Е-кадгерин миссенс мутаций, которые локализуются в области, охваченной структурные модели генерируются: 22 зародышевых мутаций, обнаруженных в настройках HDGC и EODGC, и 57 находятся в спорадические виды рака. Зародышевой линии Е-кадгерин USVs были собраны из литературы, а некоторые из них личные связи нашей лаборатории. Некоторые мутации HDGC /EODGC не представляется возможным моделировать, из-за отсутствия структурной информации (например те, локализованных в области околомембранной Е-кадгерина), и не были включены в этот анализ. Соматические мутации были собраны из базы данных генома рака проекта и содержат мутации, найденные в желудочном и очаговая раком молочной железы (только два типа рака, связанные с HDGC), но и другие типы рака, такие как синовиальной саркомы или желчных протоков карциномы (Таблица S2 ).
<р> с помощью структурных моделей, описанных ранее, мы использовали FoldX для создания каждого из раковых ассоциированных USVs, и оценивали их нативной состояния стабильности, ΔG (обычно называют полной энергии для простоты) [20]. Энергетическая разница между ссылкой WT и соответствующего мутанта (ΔΔG = ΔG <суб> WT-ΔG <суб> Мут) была рассчитана для 22 HDGC /EODGC E-кадгерина USVs локализуется в регионах, охваченных модельных структур, и результаты приведены в таблице 1. Когда ΔΔG отрицательна, это отражает усиление нативный состояния стабильности в мутантной форме; когда она положительна, то это означает, что мутант менее стабильна, то ссылка WT. Предыдущие исследования в других белков показали, что изменения устойчивости, вычисленные с помощью алгоритма FoldX ниже 0,8 ккал /моль находятся в пределах изменения ошибки программного обеспечения, и, таким образом, считается незначимым [21]. Соответственно, мы рассматривали только мутации, чтобы стать дестабилизирующим фактором, когда они вызывают изменения энергии выше 0,8 ккал /моль. На фигуре 2А, мутации выше схемы являются дестабилизирующим, в то время как нижние структурно терпимо. Очевидно, что дестабилизирующие мутации spead вдоль белка, без преимущественной домена пострадавших
. <Р> продомен Хэ-хама расщепляется во время созревания, и если это не будет выполнено, Е-кадгерин клей функция нарушается [ ,,,0],29], [30]. Для мутаций, локализованных в этой области, мы оценивали влияние в полной энергии с FoldX, сохранения с SIFT, а также оценивали, если помехи с сайта продомен расщепления с проп (подробнее в материалах и методах). Мы обнаружили, что как наследственная (G62V и T118R) и спорадически (P30T, G62D, H92Y, H121R и H123Y) мутации, локализованные в Е-кадгерина продомен структурно переносится, как и предсказывал FoldX (таблица S3). При анализе воздействия, основанный на сохранение с использованием просеять, мы также обнаружили, что ни одна из мутаций не считалось вредным, так как их степень сохранения низка (таблица S3). Эти результаты указывают на то, что патогенность Е-кадгерина USVs локализованы в продомен, скорее всего, не зависит от дестабилизации. Мы также не обнаружили никакого эффекта на расщепление пропептида, как предсказано проп (данные не показаны). Соответственно, мы считаем, что патогенность E-кадгерина мутаций в этой области может быть результатом интерференции с стыковке белков, участвующих в обработке продомен, невозможно предсказать, в силикомарганца
.
<Р> Наследственные E -cadherin USVs охватывают всю длину внеклеточного домена, в то время как спорадические мутации преимущественно в EC2-EC3, как в соответствии с ранее описанной точки доступа в экзонов 7-9 [5]. Из общего числа 18 зародышевых HDGC /EODGC мутаций, локализованных в этой области, мы обнаружили, что 10 имеют значительное структурное воздействие в белке (таблица 1). Примерно половина спорадических мутаций также дестабилизирует (таблица S3), независимо от домена EC, где они локализованы, предполагая, что нативный состояния дестабилизация может быть связана с существенной долей спорадических видов рака, связанных с потерей E-кадгерина по точечной мутации.
результаты, показывающие, что наследственная мутация V832M эффективно связывает бета-катенин, и его патогенность, кажется, зависит от неспособности Е-кадгерин /β-катенина комплекса связывать α -catenin [32], [33].
<р> Мы собрали все прогнозы и функциональные в пробирке
данные HDGC /EODGC мутаций и анализировали надежность предсказателей, используемых (таблица 1). Мы классифицировали результаты от предсказаний, как: истинно положительный (TP), когда мутация предсказывается наносящей в силикомарганца
(либо FoldX или SIFT) и демонстрируют потерю функции в пробирке
; Правда Отрицательные (TN), когда мутация предсказывается как допустимое в силикомарганца
и функционально в пробирке
; Ложные Положительный (FP), когда мутация предсказывается наносящей в силикомарганца
но функционально в пробирке
; и ложный отрицательный результат (FN), когда мутация предсказывается как допустимое в силикомарганца
но экспонаты в пробирке
потеря функции. TP и TN положительные результаты, а это означает, что предсказатели способны обнаружить влияние мутации в функции; FP и FN представляют степень их выхода из строя. Мы обнаружили, что оба алгоритма способны предсказывать функциональное воздействие до 70% зародышевой HDGC /EODGC мутаций (11 из 16 мутаций) с предсказанием перекрытием на половину мутаций (таблица 1, рис 2В).
DGC
<р> Для определения биологической значимости E-кадгерина дестабилизации, мы использовали в качестве модельной системы трех новых выявленных Е-кадгерин зародышевых миссенс мутации сообщили в нашей лаборатории для функциональной характеристики: E185V, S232C и L583R, позже недавно описаны в литературе [22]. <ЕМ> в силикомарганца
анализа описывалось ранее проводили в течение этих трех новых мутаций, и результаты представлены в таблице 1 (ниже темной линии). Мутации E185V и S232C структурно переносится с ΔΔG = 0,29 ккал /моль и -0,9 ккал /моль соответственно (таблица 1), считается незначительным относительно влияния в структуре. Мутация S232C способствует снижению энергии, стабилизирующий белок, и это происходит из-за потери высокой энергии серин погребенного ОН группу, которая не участвует в Н-связи, а также к размещению боковой цепи цистеина. Мутация L583R вызывает дестабилизацию, с ΔΔG = 2,72 ккал /моль, что отражает резкое изменение из гидрофобного и гидрофильного аминокислоте, что приводит к Аргинин не способны образовывать водородные связи, будучи похоронен в неблагоприятную.
<Р> I н пробирке
функциональные анализы были проведены для вышеуказанных мутаций HDGC /EODGC, и мы нашли идеальное соотношение между функциональностью в пробирке
и наличие /отсутствие структурного воздействия: E185V и S232C сохранить функция клея Е-кадгерина, и способны образовывать плотные клеточные агрегаты, в то время как L583R показывает четкую рассеянную узор, напоминающий Mock клетки (рис 3, а), что указывает, что E185V и S232C являются непатогенные и L583R является патогенным.
<р> Когда мы анализировали экспрессию Е-кадгерина в различных клеточных линиях, мы обнаружили, что общее количество мутантного L583R ниже, что выражение БТ в тех же условиях, в то время как мутации E185V и S232C, сохраняют нормальные уровни (рис 3б). Интересно отметить, что полоса, соответствующая L583R удерживается в геле, что указывает, что L583R не может должным образом созревают (незрелых форма Е-кадгерин 130 кД, зрелый составляет 120 кДа) и проточной цитометрии результаты показывают, что оно менее выражено в плазматическая мембрана (рис 3C).
<р> Когда белок созревание выходит из строя, это обычно приводит к эндоплазматический ретикулум (ER) удержания незрелого белка. Для того, чтобы проверить, был ли L583R в самом деле сохранен как незрелые, мы проанализировали, если она удерживается в ER путем совместного иммунофлюоресценции с ЭР-маркера калнексину (фиг.4А), и обнаружили, что часть сигнала L583R накладывается с ER маркером, что указывает на увеличение удержание ER.
, мы проанализировали стабильность L583R в клетке, оценивая свой оборот. Мы блокировали синтез белка с циклогексемида и обнаружили, что L583R скоро деградирует, оцениваемое по его остаточной экспрессии вскоре после 8 ч ингибирования синтеза белка, в отличие от WT и других мутантов, которые до сих пор с высоким уровнем экспрессии в тех же условиях (4В) , указывая, что L583R нестабилен в клетке. Наличие незрелой группы в WT или мутантных образцов E-кадгерина (верхняя полоса, 4Б) связано с перегрузкой белка в результате временной трансфекции.
<Р> Нестабильные или Неправильно свернутые белки жестко регулируется с помощью механизмов контроля качества белка которые защищают клетки, направляя вновь синтезированные развернутые белки для деградации в протеасомы [34]. Для того, чтобы решить, если это имеет место для L583R, мы подавляли активность протеасомы с MG132, и отметил, что, несмотря на различные начальные уровни Е-кадгерина, экспрессия мутантного L583R полностью восстанавливается после обработки (рис 4C), указывая, что преждевременно разлагаются протеасоме после синтеза, как описано выше для других juxtamembranar HDGC ассоциированных с Е-кадгерин мутаций [35]. Интересно, что когда деградация Протеасома ингибируется, происходит накопление незрелых E-хама во всех клеточных линиях, проявляющиеся важность протеасоме в регуляции вновь синтезированной E-хама, независимо от того мутировали или нет.
<Р> Для дальнейшей проверки в силикомарганца
предсказаний, мы проанализировали фенотип Откачено дестабилизированном мутации, вызывая структурно переносимую изменения в том же положении мутантной формы Е-кадгерина. Используя FoldX, мы рассчитали влияние каждого возможного изменения в положении 583 и обнаружили, что изменение индукции меньше дестабилизацию был L583I (ΔΔG = 0,56 ккал /моль, как было предсказано с использованием модели мыши, таблица S3). Интересно, что эта мутация сохраняет функцию клеевой Е-кадгерина, в результате чего в компактных агрегатов клеток (рис 4D), и не дестабилизировали в пробирке
, проявляя устойчивость к cicloheximide, сравнимое с формой WT (рис 4д). Эти результаты подчеркивают надежность в силикомарганца
на основе предсказания устойчивости E-кадгерина и четкой ассоциации E-кадгерина дестабилизации с потерей функции клеевой.
Обсуждение
<р> Е-кадгерин изменения (мутации, делеции и метилирование) являются единственной признанной генетической причиной HDGC [36], [37], [38]. Большинство мутаций, выявленных в HDGC относятся к типу нонсенс, но значительная часть (20%) зародышевые мутации приводят к одиночными аминокислотными заменами, из которых патогенность трудно оценить и часто неясна [39], [40]. Наиболее важная информация, с точки зрения генетического консультирования зародышевых носителей мутации Миссенс является семейной клинической информации (анализ сегрегации, в основном), но эта информация часто не хватает с размером родословной обычно было слишком маленьким, чтобы позволить исследования сегрегации, а оценка патогенность обычно происходит из клеток на основе в пробирке
функциональных анализов [15], [17], которые много времени и технически сложные, и поэтому они не широко применяются в обычных молекулярных лабораториях. Следовательно, существует потребность в новых способах для определения патогенности Е-кадгерин миссенс мутаций, ассоциированных с HDGC [40].
Качество сна может быть индикатором для более позднего исследования болезни Альцгеймера
Исследования показывают, что пробиотики помогают бороться с тревогой и депрессией.
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Тиопурины могут помочь остановить репликацию вируса в коронавирусах человека
Иммунные клетки восстанавливают поврежденный кишечник у детей с ВЗК
Perfectus Biomed примет участие в конференции IPS в Ливерпуле
Качество сна может быть индикатором для более позднего исследования болезни Альцгеймера
Новое исследование ученых из Калифорнийского университета, Беркли показал, что постепенно ухудшающееся качество сна у людей в возрасте от 50 до 60 лет может указывать на белковые клубки в их мозгу, ко
Западная диета может увеличить риск «смертельного сепсиса»,
предупредить экспертов Новое исследование, проведенное в Государственном университете Портленда, предполагает, что западная диета может увеличить риск тяжелого сепсиса и смертности от инфекции.
Подробная карта микробиома человеческого языка
Новое исследование, опубликованное в журнале Отчеты по ячейкам в марте 2020 года сообщает об использовании передовых и быстрых методов спектральной визуализации для разработки подробной карты микроб