PLOS ONE: E-caderina Contas desestabilização para a patogenicidade de missense mutações no difuso hereditário gástrica Cancer

Abstract

E-caderina é fundamental para a manutenção da arquitetura do tecido devido ao seu papel na adesão célula-célula. mutações caderina-E são a causa genética da difuso hereditário Câncer Gástrico (HDGC) e mutações missense representam um fardo clínico, devido à incerteza do seu papel patogênico. In vitro e in vivo, a maioria das mutações levam a perda de função, embora o factor causal é desconhecida para a maioria. Nossa hipótese é que a desestabilização poderia explicar a patogenicidade de mutações missense E-caderina em HDGC, e testou nossa hipótese usando in silico e em ferramentas in vitro. FoldX algoritmo foi utilizado para calcular o impacto de cada mutação de E-caderina-estabilidade estado nativo, e a análise foi complementada com a conservação evolutiva, por SIFT. Curiosamente, os pacientes que albergam hdgc linha germinal de E-caderina mutantes desestabilizando apresentar uma idade de diagnóstico ou morte, o que sugere que a perda de estabilidade de estado nativo de contas da caderina-E o fenótipo da doença. Para elucidar a importância biológica da desestabilização de E-caderina em HDGC, nós investigamos um grupo de mutações recentemente identificadas HDGC-associados (E185V, S232C e L583R), dos quais L583R está previsto para ser desestabilizador. Nós mostramos que esta mutação não é funcional in vitro, apresenta menor meia-vida e é incapaz de amadurecer, devido à degradação dependente de proteassoma prematuro, um fenótipo revertido pela estabilização com a mutação artificial L583I (estruturalmente tolerada). Aqui relatamos modelos estruturais de E-caderina adequados para prever o impacto da maioria das mutações de sentido trocado associados ao cancro e que mostram que a E-caderina desestabilização leva à perda de função in vitro e aumento da patogenicidade in vivo.

Citação: Simões Correia-J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-caderina Contas desestabilização para a patogenicidade de missense mutações no difuso hereditário câncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 09 de novembro de 2011; Aceito: 17 de fevereiro de 2012; Publicação: 21 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Simões-Correia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (ASTF comunhão de curto prazo 60- 2009) e da UE Perspectivas de subvenção (HEALTH-F4-2008-201648). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

e-caderina é uma glicoproteína de adesão célula-célula composta por cinco repetições do tipo caderina extracelulares, uma região transmembranar e uma cauda citoplasmática altamente conservado [1], [2]. E-caderina é expressa principalmente em células epiteliais e é o componente principal de Junções Aderentes (AJ). Estas junções de cluster, através de interacções homofílicas, através dos domínios extracelulares de moléculas de caderina-E dependentes de cálcio, sobre a superfície de células vizinhas homotípicos.

O papel da E-caderina no desenvolvimento do tumor é bem descrito, e os seus perda de expressão é uma característica marcante em carcinomas [3]. A evidência experimental apoia um papel para o complexo caderina-E tanto na supressão de invasão e metástase formação [4]. A perda da expressão de E-caderina está frequentemente associada a acontecimentos genéticos, tais como local de splicing e mutações de truncagem causadas por inserções, deleções e mutações nonsense, além de mutações missense [5]. No cancro gástrico difuso esporádica, alterações no gene que codifica E-caderina (CDH1) encontram-se, preferencialmente, em exons 7-9 [5], enquanto que em cancros da mama lobular eles estão espalhados ao longo do gene, sem ponto de acesso preferencial [6]. Mutações são encontradas nestes dois tipos de câncer esporádico e também no sarcoma sinovial [7].

A agregação familiar de Câncer Gástrico Difuso (DGC) representa 10% dos casos de câncer gástrico (GC), e só 1-3% são hereditários [8]. A partir desses casos familiares, difuso hereditário Câncer Gástrico (HDGC) é definida por critérios rigorosos que foram definidos pela Linkage Consortium Internacional de Câncer Gástrico (IGCLC) em 1999: (1) dois ou mais casos documentados de câncer gástrico difuso no primeiro segundo grau /parentes, com, pelo menos, uma diagnosticados antes dos 50 anos; ou (2) três ou mais casos de cancro gástrico difuso documentado em primeiro, segundo parentes /grau, independentemente da idade. Início precoce difusa Câncer Gástrico (EODGC) é considerado quando um indivíduo isolado é diagnosticado com DGC com menos de 45 anos de idade. mutações da linha germinativa CDH1 são encontrados em 30% dos casos hdgc [9]. A associação de mutações CDH1 e câncer gástrico familial foi primeiramente descrita por Guilford et al
em 1998 [10] e, desde então, muitos estudos relataram diferentes tipos de mutações CDH1 em HDGC [11], [12], [13 ]. Entre todos os CDH1
mutações germinativas relatados, 77,9% são nonsense, splice local e mutações frameshift (previstos para produzir códons prematuros de terminação) e 22,1% são mutações missense [9]. As mutações que geram PTC normalmente são deletérios, os pacientes são considerados portadores de alto risco, e são aconselhados a ter gastrectomia total profilática [14]. A patogenicidade de mutações missense não é simples, e essas alterações são comumente referidos como não Classificada Sequence variantes (USVs), devido à falta de critérios rigorosos para avaliar o seu impacto. Vários parâmetros foram tidas em conta para a classificação de USVs E-caderina em HDGC: 1) co-segregação da mutação com DGC (dentro de pedigrees); 2) frequência de mutação na população controle saudável; 3) recorrência mutação (em famílias independentes). A análise de segregação é muitas vezes impossível, com um pequeno número de casos afectados disponíveis para diagnóstico molecular [15], e a ausência de informação clínica é um passo limitante para inferir o significado patogénico desses mutações. Para contornar esta limitação, temos desenvolvido anteriormente in vitro
ensaios funcionais para avaliar o impacto funcional da E-caderina mutações germinativas missense [16], [17]. No entanto, estes estudos implicam condições experimentais específicas de laboratório, ou seja, ensaios de biologia celular, e eles são demorados para uso na rotina. In silico
previsões são fiáveis ​​e análise rápida que se pode usar para prever o impacto de mutações pontuais, especialmente quando a informação estrutural está disponível [18], [19].

Neste trabalho, exploramos o potencial da estrutura baseada em in silico
previsões para avaliar o impacto das mutações missense e-caderina, encontrados em câncer hereditário e esporádica. Nossa análise foi baseada no cálculo das alterações de estabilidade no estado nativo induzidos por cada variante (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut), obtida pelo algoritmo de proteína FoldX concepção [20], [21]. Curiosamente, o grupo de pacientes com mutações desestabilizando (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) é caracterizada por uma menor idade no momento do diagnóstico ou morte por DGC, sugerindo que a perda de E-caderina estabilidade em estado nativo contribui para o fenótipo da doença. Usando um modelo celular, analisou-se o fenótipo da desestabilização de E-caderina, e descobriram que, quando uma mutação induz diminuiu nativa-estado de estabilidade, a E-caderina for prematuramente degradado pelo proteassoma, exibe mais curta meia-vida, o que resulta na perda do adesivo função. Ao todo, os nossos resultados sugerem que a desestabilização explica a patogenicidade de mutações missense E-caderina encontrado em HDGC.}

Materiais e Métodos

Recolha de sequência E-caderina variantes e PDBs

variantes e-caderina associados à HDGC ou EODGC foram coletados a partir da literatura, e as variantes somáticas foram coletadas a partir do Catálogo do Somatic Mutações em Câncer (COSMIC) de banco de dados (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cósmico/). Três nova sequência de E-caderina variantes onde relatou para o nosso laboratório para a análise funcional: E185V, S232C e L583R. Recentemente, foi relatado L583R, com dados funcionais associados [22].

PDBs-E-caderina relacionados foram identificados através da busca automática com a Swiss repositório de modelos (http://swissmodel.expasy.org). Alinhamento de sequências de E-caderina humana e cada uma das sequências utilizadas para os diversos modelos foi realizada com M-café [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). As imagens foram preparadas com PyMOL. Após a análise de sequência e homologia estrutural, três PDBs foram seleccionados para utilização como modelos:. Ectodomínio de Xenopus C-caderina (APO 1L3W), prodomínio rato E-caderina (APO 1OP4) e o domínio de ratinho β-catenina interagindo (APO 1I7X)

FoldX cálculos e peneirar análise

Usando o comando FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
nós construímos três modelos diferentes (prodom�io, extracelular e citoplasmático); as três estruturas foram humanizados por substituição de cada aminoácido diferente. A estrutura resultante foi otimizado usando o comando RepairPDB Comprar e as energias foram analisadas com o Estabilidade
ou AnalyseComplex
comandos. As mutações associadas à doença foram gerados com o Buildmodel
comando, cada mutação repetido em cinco corridas. As energias são uma saída automática no FoldX, ea mudança estabilidade em estado nativo, ΔΔG, entre WT e mutante (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) também é gerado em um arquivo separado, com o padrão correspondente desvios, e todas as penalidades energéticos associados para cada mutação. Somente mutações com ΔΔG > 0,8 kcal /mol foram consideradas prejudiciais}

Nós usamos SIFT (http://sift.jcvi.org/, Classificação intolerante De Tolerant) para avaliar a conservação de cada substituição de aminoácidos, como anteriormente. descrito [25], usando o recurso de Blink de GI:. foram considerados 31073. Somente mutações com uma pontuação abaixo de 0,05 para ser intolerante

pROP (http://www.cbs.dtu.dk/services [26] /prop /) foi utilizado para avaliar se as mutações poderia ter um efeito sobre a clivagem prodom�io.

cultura celular e transfecções

e-caderina cDNA WT foi clonado em pIRES2-EGFP vector de acordo para a fabricação de instruções (Clontech, Takara Bio) e mutações E185V, S232C, L583R e L583I he-caderina foram induzidas por mutagénese dirigida, como descrito anteriormente [27]. O vector vazio (Mock) foi utilizado como controlo células

CHO (Ovário de Hamster Chinês) (número ATCC: CCL-61). Foram cultivadas em meio Alfa-MEM (Gibco, Invitrogen) suplementado com 10% de fetal de bovino soro (FBS; Gibco, Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). As células foram esporadicamente avaliadas quanto à contaminação mycoplasm pelos testes de imunofluorescência com DAPI. As células foram transfectadas com 1 ug de cada um dos vectores que codificam as diferentes formas de E-caderina (WT, E185V, S232C, e L583R L583I) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com o procedimento de fabrico. Para o estabelecimento linha celular estável, as células foram seleccionadas por resistência aos antibióticos para 5 ug /ml de blasticidina (Gibco, Invitrogen). Todas as linhas celulares foram mantidas num incubador humidificado com 5% de CO _{2 a 37 ° C}

Os ensaios funcionais

células de CHO transfectadas transientemente (Ovário de Hamster Chinês) (número ATCC:. CCL -61) foram sujeitas a citometria de fluxo, usando medição de fluorescência da GFP, para avaliar a eficácia de transfecção antes de cada experiência. Para o ensaio de agregação lenta, poços de 96 poços de placa foram revestidas com 50 ul de solução de ágar (100 mg de Bacto-Agar em 15 ml de PBS estéril). As células foram descoladas com tripsina e suspensas em meio de cultura. Uma suspensão de 1 × 10 ^{5 células /ml foi preparada e 2 × 10 4 células foram semeadas em cada poço. A placa foi incubada a 37 ° C numa câmara humidificada com 5% de CO _{2 durante 48 h. A agregação foi avaliada num microscópio invertido (ampliação de × 4) e fotografada com uma câmara digital.}}

Western blotting

Os lisados ​​celulares foram obtidos com tampão de lise Catenina (1% de Triton X-100, 1 % de Nonidet P-40 em PBS), suplementado com um cocktail inibidor de protease (Roche) e cocktail de inibidores de fosfatase (Sigma). quantificação de proteínas foi feito por um ensaio de Bradford modificado (Bio-Rad). Para cada amostra, 25 ug de proteína foi carregada, separados em 7,5% SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences). As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e 0,5% de Tween-20 em PBS. A imunotransferência foi realizada com anticorpos contra a E-caderina (1:1000; BD Biosciences), actina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), e α-tubulina (1:10000; Sigma). Sheep anti-rato (GE Healthcare Life Sciences) ou de burro anti-cabra (Santa Cruz Biotechnology) foram utilizados como anticorpos secundários, seguido por detecção ECL (GE Healthcare Life Sciences). As imunotransferências foram quantificadas em software Quantity One (Bio-Rad).

de células activadas por fluorescência (FACS)

As células foram cultivadas a uma monocamada confluente, individual com Versene (Gibco, Invitrogen) e ressuspensas em PBS gelado com 0,05 mg /ml de CaCl _{2. Uma suspensão de 5 × 10 ^{5 células foi centrifugada durante 5 minutos a 1500 rpm, 4 ° C, e lavadas em PBS com 0,05 mg /ml de CaCl 2 3% de BSA. As células foram incubadas durante 60 minutos com um anticorpo primário contra a E-caderina, HECD1 (Zymed Laboratories) em 1:100 diluição. As células foram lavadas duas vezes e depois incubadas com anti-ratinho biotinilado (Dako) a 1:100 diluição. As células foram lavadas duas vezes e, em seguida, incubadas com estreptavidina-PE CY5 (BD Pharmingen) em diluição 1:40. Finalmente, as células foram lavadas, ressuspensas em 500 ul de PBS, e 50000 células foram analisadas num citómetro de fluxo (Coulter Epics XL-MCL). Os dados foram analisados ​​com o software WinMDI.}}

imunofluorescente coloração

para imunofluorescência e microscopia, as células foram semeadas em lamelas de vidro e cultivadas até cerca de 80% de confluência, fixadas em metanol arrefecido com gelo durante 15 minutos, lavou-se 2 vezes com PBS, e incubadas com o anticorpo primário, diluído em PBS, BSA a 5%, durante 60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários utilizados: monoclonal anti-E-caderina (BD Biosciences); coelho anti-Calnexina (Stressgen). Os anticorpos secundários utilizados: Alexa Fluor 488 anti-rato (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-coelho (1:500; Invitrogen). As lamelas foram montadas em lâminas de vidro, utilizando Vectashield com DAPI para detecção nuclear (Vector Laboratories). A aquisição de imagens foi realizada em Carl Zeiss ApoTome Axiovert 200 M microscópio de fluorescência utilizando 40 × objetivos. As imagens foram adquiridas com câmara de Axiocam HRM e processados ​​pelo software Axiovison versão 4.8.

Os tratamentos com células

Para a inibição da síntese de proteína, as células foram tratadas com 25 mM de Cycloheximide por 8 h e 16 h, e a quantidade total de e-caderina foi analisada por WB como descrito anteriormente. Para o ensaio de inibição de proteassoma, as células foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas a cerca de 80% de confluência e foram incubadas durante 16 h com 10 uM MG132 (Calbiochem). lisados ​​celulares foram analisados ​​por WB como descrito anteriormente.

Resultados

1. modelos estruturais da caderina-E

Existem poucas estruturas humano E-caderina (HE-cad) disponíveis, e eles cobrem apenas pequenas porções da proteína (Tabela S1). Usando a pesquisa automática de Swiss repositório Modelo, descobrimos que PDB 1L3W, anotada para o domínio extracelular de comprimento total de Xenopus EP-caderina (EP-cad), é altamente homólogo ao mesmo domínio no E-caderina humana. Analisamos homologia da sequência de alinhamento usando M-café, um alinhamento múltiplo de sequências que combina a saída de vários vários pacotes de alinhamento de sequências (PCMA, Poa, mafft, músculo, T-café, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. A Figura 1A mostra o alinhamento das duas sequências de domínio extracelular. As regiões de tijolos vermelhos representam perfeita concordância entre os métodos utilizados, representando sequências altamente semelhantes. Para construir a estrutura do modelo, removemos regiões sem similaridade (Figura 1A, estrelas), e limitou o modelo para regiões com o alinhamento confiável (seta preta, Figura 1A). A estrutura de Xenopus foi humanizado, conforme descrito no Material e Métodos e Figura 1B mostra o alinhamento estrutural dos domínios EC1-EC2 He-cad (a partir de PDB 2O72) e domínios EC1-EC2 da Xenopus derivada do modelo estrutural. As duas estruturas são quase sobrepostos, o que indica que a similaridade entre os domínios extracelulares da E-caderina humana e Xenopus EP-caderina é não só ao nível da sequência, mas também ao nível estrutural. A estrutura do modelo de E-cad humano exibe energias compatíveis com a estrutura de Xenopus, com uma ligeira queda de energia livre (ΔG) obtido para o modelo (ΔG _{real = 559,99 kcal /mol e ΔG model = 531,77 kcal /mol), indicando que a humanização não introduz confrontos extra. Recentemente, uma estrutura do domínio extracelular do mouse foi lançado (PDB 3Q2V, Tabela S1), e também utilizado esta estrutura como um modelo, como uma forma de refinar os resultados obtidos com o modelo de Xenopus.}

Nós estabelecemos dois outros modelos, cobrindo o prodominio (APO 1OP4, a partir de N-caderina de rato) e o domínio citoplasmático β-catenina (APO 1I7X, de rato e-caderina), utilizando a mesma metodologia. Ao todo, os três modelos de cobrir a maior parte da estrutura da proteína (Figura 1C): o modelo prodom�io abrange as posições 28-117, os modelos extracelulares posições 155-697 e o domínio citoplasmático β-catenina abrange 782-838. Ao nível do domínio justamembrana, uma estrutura é anotada, que compreende a superfície de interacção entre a E-caderina e p120 [28]. Esta estrutura contém um pequeno peptídeo de 18 aminoácidos de comprimento (cobrindo posições 756-773 em He-cad), com muito baixo conteúdo estrutural, fatores que diminuem a confiabilidade dos cálculos de energia, de modo que nós descartamos essa estrutura da análise.

2. In silico
previsão do impacto dos associados ao câncer USVs E-caderina

mutações caderina-E não são apenas a causa genética da HDGC, mas eles também são freqüentemente encontrados em diferentes tipos de esporádica cancros. Analisamos in silico
o impacto de todas as mutações E-caderina missense associados ao câncer que localizam nas regiões abrangidas pelos modelos estruturais gerados: 22 mutações germinativas encontrados nas configurações do HDGC e EODGC, e 57 encontrados em cancros esporádicos. USVs-caderina E germinativas foram coletados a partir da literatura, e alguns são comunicações pessoais de nosso laboratório. Algumas mutações HDGC /EODGC não são possíveis para modelar, devido à falta de informação estrutural (por exemplo os localizados no domínio justamembrana de caderina-E), e não foram incluídos na análise. mutações somáticas foram coletadas a partir do banco de dados do Cancer Genome Project, e contêm mutações encontradas no cancro gástrico e lobular de mama (os dois únicos tipos de câncer associados à HDGC), mas também outros tipos de câncer, como o sarcoma sinovial ou carcinoma do ducto biliar (Tabela S2 ).

Usando os modelos estruturais descritas anteriormente, foram utilizados FoldX para gerar cada um dos USVs câncer associado, e avaliada a sua estabilidade em estado nativo, ΔG (comumente referido como energia total para simplificar) [20]. A diferença energética entre a referência WT e mutante correspondente (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) foi calculada para os 22 hdgc /EODGC USVs E-caderina localizadas nas regiões abrangidas pelas estruturas modelo, eo os resultados estão listados na Tabela 1. Quando ΔΔG é negativo, isto reflecte um aumento de estabilidade de estado nativo sob a forma mutante; quando é positivo, isso implica que o mutante é menos estável, em seguida, a referência WT. Estudos anteriores em outras proteínas têm mostrado que as alterações de estabilidade calculadas com algoritmo FoldX abaixo de 0,8 kcal /mol estão dentro do erro de alteração do software, e são, portanto, considerado não significativo [21]. mutações Nesse sentido, só consideradas desestabilizadoras quando induzir mudanças de energia acima de 0,8 kcal /mol. Na Figura 2A, as mutações acima do esquema são desestabilizador, enquanto os de fundo são estruturalmente tolerada. É claro que as mutações desestabilizando são spead ao longo da proteína, sem domínio preferencial afetados.}

O prodom�io de He-cad é clivada durante a maturação, e se isso não for feito, a função adesiva E-caderina é prejudicada [ ,,,0],29], [30]. Para as mutações localizadas nesse domínio, foi avaliado o impacto no total de energia com FoldX, a conservação com SIFT e também avaliou se a interferência com o local de clivagem prodom�io com PROP (detalhes em Materiais e Métodos). Descobrimos que tanto hereditária (G62V e T118R) e esporádica mutações localizadas no prodomínio E-caderina (P30T, G62D, H92Y, H121R e H123Y) são estruturalmente tolerado, como previsto por FoldX (Tabela S3). Quando analisamos o impacto baseado na conservação usando SIFT, também encontramos que nenhuma das mutações foi considerado prejudicial, porque o seu grau de conservação é baixa (Tabela S3). Estes resultados indicam que a patogenicidade de USVs E-caderina localizada no prodomínio não é provavelmente dependente de desestabilização. Também encontrou nenhum efeito sobre a clivagem do pró-péptido, como previsto por PROP (dados não mostrados). Dessa forma, acreditamos que a patogenicidade de mutações E-caderina neste domínio podem resultar da interferência com a ancoragem de proteínas envolvidas no processamento prodom�io, impossível prever in silico
.

hereditária E USVs -cadherin abrangem o comprimento total do domínio extracelular, enquanto que mutações pontuais são predominantemente encontrados em EC2 EC3-, como de acordo com o ponto de acesso previamente descrito em exons 7-9 [5]. Do total de 18 mutações da linha germinativa HDGC /EODGC localizadas neste domínio, verificou-se que 10 possuem um impacto estrutural significativa na proteína (Tabela 1). Aproximadamente metade das mutações pontuais são também desestabilizar (Tabela S3), independentemente do domínio CE onde elas são localizadas, o que sugere que a desestabilização do estado nativo pode ser associado a uma fracção substancial de cancros esporádicos, com a perda de E-caderina através de mutação pontual.

Apenas três mutações estão localizadas na região mapeada pelo modelo do domínio citoplasmático de ligação β-catenina (P799R, V832M, S838G): os primeiros dois identificados na configuração HDGC /EODGC e o outro um esporádica, encontrado em carcinoma dos ovários [31]. Por estas mutações foram analisadas a energia de ligação entre a E-caderina e β-catenina e descobriram que nenhum deles altera significativamente a afinidade de ligação de β-catenina, de acordo com a previsão FoldX. Isto está de acordo com o In vitro
resultados que mostram que a mutação hereditária V832M eficientemente se liga β-catenina e a sua patogenicidade parece ser dependente da incapacidade do complexo E-caderina /catenina β-se ligar α -catenina, [33] [32].

Foram coletadas todas as previsões e funcional in vitro
dados de mutações HDGC /EODGC e analisou a fiabilidade dos preditores utilizados (Tabela 1). Classificamos os resultados das previsões como: verdadeiro positivo (TP) quando a mutação está previsto como deletéria in silico
(seja por FoldX ou SIFT) e apresentam perda da função in vitro
; Verdadeiro negativo (TN), quando a mutação está previsto, conforme tolerado in silico
e é funcional in vitro
; Falso Positivo (FP), quando a mutação é previsto como deletéria in silico
mas é funcional in vitro
; e falso negativo (FN), quando a mutação está previsto, conforme tolerado in silico
mas exposições in vitro
perda de função. TP e TN são resultados positivos, o que significa que os preditores são capazes de detectar o impacto mutação em função; FP e FN representar o seu grau de deficiência. Verificou-se que ambos os algoritmos são capazes de prever o impacto funcional de até 70% da linha germinal mutações HDGC /EODGC (11 de 16 mutações), com as previsões de sobreposição para metade das mutações (Tabela 1, Figura 2B).

Foram analisados ​​os dados disponíveis para os germinal hdgc EODGC mutações portadores e /, embora a informação é limitada, descobrimos que o conjunto mais completo de dados é a idade de início ou morte associada a DGC. Quando box-plot esses dados, o agrupamento "Desestabilizar" e "Non-desestabilizar" portadores da mutação, observamos uma idade mais jovem evidente do início da doença (diagnóstico ou morte) para o primeiro grupo (Figura 2D), sugerindo que a desestabilização-estado nativo contas para o desenvolvimento anterior do DGC.

3. significado biológico de desestabilização E-caderina

Para determinar o significado biológico de desestabilização E-caderina, foi utilizado como sistema modelo três mutações missense da caderina-E germinativas recentemente identificados relatados para o nosso laboratório para caracterização funcional: E185V, S232C e L583R, a posterior recentemente descrito na literatura [22]. O in silico
análise descrita anteriormente foi realizada para estes três novas mutações e os resultados estão incluídos na Tabela 1 (abaixo da linha de escuro). As mutações E185V e S232C são estruturalmente tolerado, com ΔΔG = 0,29 kcal /mol e -0.9 kcal /mol, respectivamente (Tabela 1), considerado insignificante em relação ao impacto na estrutura. A mutação S232C promove a redução da energia, a estabilização da proteína, e isto é devido à perda de energia elevada de uma serina enterrado grupo OH, o que não está envolvido numa ligação-H, e para o alojamento da cadeia lateral de Cisteína. Mutação L583R induz desestabilização, com ΔΔG = 2,72 kcal /mol, refletindo a mudança dramática de um hidrofóbica para aminoácido hidrofílico, que resulta em uma arginina não são capazes de formar ligações de H, sendo desfavoravelmente enterrado.

n vitro
ensaios funcionais foram realizados para as mutações HDGC /EODGC acima mencionados, e encontramos uma correlação perfeita entre a funcionalidade in vitro
ea presença /ausência de impacto estrutural: E185V e S232C mantêm a função adesiva de e-caderina, e são capazes de formar agregados celulares apertadas, enquanto L583R exibe um padrão disperso clara, assemelhando-se células Mock (Figura 3A), o que indica que E185V e S232C é não patogénico e L583R é patogénica.

Quando se analisou a expressão de e-caderina nas diferentes linhas de células, observou-se que a quantidade total de L583R mutante é menor que a expressão WT sob as mesmas condições, enquanto que mutações E185V e S232C, manter níveis normais (Figura 3B). Curiosamente, a banda correspondente à L583R é retida no gel, indicando que L583R não é capaz de amadurecer adequadamente (forma imatura da E-caderina é 130 kDa, madura é de 120 kDa) e citometria de fluxo resultados mostram que é menos expresso na membrana plasmática (Figura 3C).

Quando a maturação da proteína falhar, isso geralmente resulta em retículo endoplasmático (ER) retenção de proteína imatura. Para testar se L583R foi efectivamente retido como imaturo, analisou-se se ele é retido no ER por co-imunofluorescência com a calnexina ER marcador (Figura 4A), e verificou que uma parte do sinal L583R é sobreposto com o marcador de ER, indicando um aumento retenção de ER.

Para entender se desestabilização podia ser detectado in vitro
, foi analisada a estabilidade do L583R na célula, avaliando o seu volume de negócios. Nós bloqueou a síntese de proteínas com ciclo-heximida e descobriram que L583R é rapidamente degradado, tal como avaliado pela sua expressão residual logo após 8 h de inibição da síntese de proteínas, ao contrário de WT e os outros mutantes que ainda são altamente expressos nas mesmas condições (Figura 4B) , indicando que L583R é instável na célula. A presença de banda imatura em amostras de E-caderina WT ou mutantes (banda superior, Figura 4B) é devido à sobrecarga de proteínas resultantes de transfecção transiente.

proteínas instáveis ​​ou deformadas são regulados por mecanismos de controle de qualidade Protein que protegem a célula por proteínas desdobradas dirigir sintetizadas de novo para a degradação no proteassoma [34]. Para resolver se este é o caso para L583R, que inibiu a actividade de proteassoma com MG132 e observou-se que, apesar dos diferentes níveis iniciais de E-caderina, a expressão de L583R mutante é completamente restaurado após tratamento (Figura 4C), indicando que é prematuramente degradado pelo proteassoma após a síntese, tal como anteriormente descrito para outras mutações de caderina-E-juxtamembranar associada hdgc [35]. Curiosamente, quando a degradação proteassoma é inibida, há uma acumulação de imaturos E-cad em todas as linhas de células, manifestando a importância do proteassoma na regulação do recém-sintetizado E-cad, independentemente de ser mutado ou não.

Para validar ainda mais o in silico
previsões, analisamos o fenótipo de uma mutação desestabilizado revertido pela indução de uma alteração estrutural tolerado na mesma posição da forma mutante de E-caderina. Usando FoldX, foi calculado o impacto de cada possível alteração na posição 583 e descobriu que a alteração induzir menos desestabilização foi L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, como previsto utilizando o modelo de rato, Tabela S3). Curiosamente, esta mutação retém a função adesiva de E-caderina, resultando em agregados celulares compactos (Figura 4D), e não é desestabilizada In vitro
, exibindo resistência cicloheximida comparável à forma WT (Figura 4E). Esses resultados reforçam a confiabilidade do in silico previsões
base de estabilidade E-caderina e a associação clara do desestabilização E-caderina com perda de função adesiva.

Discussão

e-caderina alterações (mutações, deleções e metilação) são a única causa genética do reconhecido HDGC [36], [37], [38]. A maioria das mutações identificadas em HDGC são do tipo de contra-senso, mas uma fracção significativa (20%) de mutações da linha germinal dar origem a substituições de aminoácidos individuais, de que a patogenicidade é difícil de avaliar e é muitas vezes pouco claro [39], [40]. A informação mais importante em termos de aconselhamento genético dos portadores da mutação missense germinativas é informação clínica familiar (análise de segregação, principalmente), mas esta informação é muitas vezes escasso, com o tamanho da pedigree comumente ser demasiado pequena para permitir estudos de segregação, e a avaliação da patogenicidade normalmente vem de in vitro
ensaios baseados em células funcionais [15], [17], que são demorado e tecnicamente exigente, e são, portanto, não é amplamente aplicável em laboratórios moleculares de rotina. Por conseguinte, existe uma necessidade de novos métodos para determinar a patogenicidade das mutações missense E-caderina associados a HDGC [40].

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