Ploche ONE: znížená expresie génu v ARID1A je spojená s horšou prognózou v primárnej rakoviny žalúdka

abstraktné

Pozadie

ARID1A
gén kóduje adenín-tymín (AT) bohatý interaktívny doménu obsahujúce proteín 1A, ktorý sa zúčastňuje chromatínu prerábanie. ARID1A
bol ukázal fungovať ako nádorový supresor v rôznych typov rakoviny. V súčasnej štúdii sme skúmali výrazu a prognóza hodnotu ARID1A
primárnej rakoviny žalúdka. Medzitým, biologická role ARID1A
bola ďalej skúmaná za použitia modelu buniek in vitro.

Metodika /hlavných zistení

Ak chcete skúmať úlohu ARID1A
gén v primárnom žalúdočnej rakoviny patogenézy, real-time kvantitatívnej PCR a western blotting bol použitý na skúmanie ARID1A
výraz v párových rakovinové a noncancerous tkanív. Výsledky odhalili znížila ARID1A
mRNA ( P
= 0,0029) a bielkovín ( P
= 0,0015) expresie vo väčšine tkanív nesúcich nádor v porovnaní s prispôsobeným priľahlým nenádorových tkaniva, a v žalúdočných nádorových bunkových línií. Ďalej skúmať klinicko a prognostické role ARID1A
prejavu, sme vykonali imunohistochemické analýzy 224 parafínových rakoviny žalúdka tkanivových blokov. Dáta ukázali, že strata ARID1A
expresie významne koreluje s T fáze ( P
= 0,001) a stupeň ( P
= 0,006). V súlade s týmito výsledkami sme zistili, že strata ARID1A
expresie bola signifikantne korelovala so zlou prežitia u pacientov s rakovinou žalúdka ( P
= 0,003). Cox regresnej analýzy vyplynulo, že ARID1A
výraz bol nezávislý prediktor celkové prežívanie ( P
= 0,029). Ďalej, funkcia ARID1A
v proliferáciu a tvorbu kolónií bunkových línií žalúdka boli analyzované prenos buniek s plnou dĺžkou ARID1A
expresný vektor alebo siRNA zacielenia ARID1A
, Obnovenie ARID1A
expresiu v rakovinových bunkách žalúdku významne inhibovala proliferáciu buniek a tvorba kolónií. Umlčanie ARID1A
výraz v žalúdku epitelové bunkové línie významne zvýšená rýchlosť bunkového rastu.

Závery /Význam

Naše údaje naznačujú, že ARID1A
môže hrať dôležitú role v karcinómu žalúdka a môže slúžiť ako cenný prognostický marker a potenciálny cieľ na génovú terapiu v liečbe rakoviny žalúdka

Citácia :. Wang dd, Chen Yb, Pán k, Wang W, Chen Sp, Chen Jg , et al. (2012) znížená expresia ARID1A
Gene je spojená s horšou prognózou v primárnej rakoviny žalúdka. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Prijaté: 19. januára 2012; Prijaté: 06.06.2012; Uverejnené: 13. júla 2012

Copyright: © 2012 Dandan et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (30973398) a Kuang-tung Natural Science Foundation (925100890). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou zhubný nádor po celom svete a druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou každý rok (10,4% úmrtí na rakovinu) [1]. Liečba rakoviny žalúdka zahŕňa kombináciu chirurgia, chemoterapia alebo rádioterapie. Avšak, takmer 60% pacientov postihnutých podľahne rakovine žalúdka aj po samotnej kuratívnu resekcii alebo po adjuvantnej terapie [2]. Už dlhú dobu je známe, že výsledky rakovinou žalúdka z kombinácie faktorov životného prostredia a hromadeniu všeobecných a špecifických genetických zmien. Mnoho z genetických alebo epigenetických zmien spojených s rakovinou žalúdka, vrátane straty heterozygotnosti, mikrosatelitních a chromozomálne nestability a hypermetylace boli hlásené [3]. Pochopenie týchto zmien a molekulárne mechanizmy zapojené do žalúdočnej karcinogenéze bude mať zásadný význam pre zlepšenie diagnózy, terapie a prognózy predikciu tejto choroby.

eukaryotically konzervovaný SWI /SNF chromatín-remodeláciu komplex hrá zásadnú úlohu v rôznych bunkových procesov, vrátane diferenciáciu, proliferáciu a opravy DNA [4]. Strata SWI /SNF podjednotiek bola hlásená vo väčšine nádorov, a veľké množstvo experimentálnych pozorovaní naznačujú, že tento komplex je dôležité pre potlačovanie nádorov [5]. Tieto komplexy obsahujú sedem alebo viac noncatalytic podjednotky, ktoré pravdepodobne pomáhajú modulovať zacielenia a aktivitu ATPázy [6]. Jedna podjednotka tohto komplexu, hSNF5 /Ini1 /BAF47, bola identifikovaná ako nádorový supresor [7], [8]. Druhý noncatalytic podjednotka, P270 /ARID1A /BAF250a (adenín-tymín AT-bohaté interaktívne doménu obsahujúce proteín 1A), bolo preukázané, že sú nevyhnutné pre normálnu zástave bunkového cyklu [9]. Vyradenie ARID1A
v leukemických buniek línie rezistenciu voči Fas-sprostredkované apoptosy [10].

V poslednej dobe, ARID1A
mutácií a stratu BAF250a proteínu sa zistilo, že silne korelujú s ovariálny karcinóm jasných buniek a maternice low-grade endometrioid karcinómu [11] - [13]. Tieto pozorovania ukazujú, že ARID1A
je potenciálnym kandidátom nádorový supresorový gén. Avšak klinický význam tohto rozdielna expresie a funkcie proteínu ARID1A zostávajú nedefinovaný kvôli nedostatku štúdiách s použitím čerstvých ľudských nádorových vzoriek. V tejto štúdii sme analyzovali ARID1A
hladinu expresie u karcinómu žalúdka pomocou real-time kvantitatívne RT-PCR, Western blotting a imunohistochémia. Zatiaľ sme identifikovali vzťah medzi ARID1A
prejavu a klinicko-funkcií a vyhodnotiť jej prognostickú hodnotu v post-resekčné prežitie pacientov s rakovinou žalúdka. Ďalej sme vyhodnotili funkčné úlohu ARID1A
pri vzniku nádorov primárnej rakoviny žalúdka tým, že skúma proliferácie a kolónií tvorbu in vitro v bunkových líniách žalúdku.

Výsledky

ARID1A
expresie mRNA analyzované v reálnom čase kvantitatívne RT-PCR

úroveň mRNA ARID1A
bola stanovená real-time kvantitatívne RT-PCR v 66 spárovaný rakovinové a je uzavreté priľahlé normálneho tkaniva žalúdočnej sliznice. ARID1A
Hladina expresie bola v 43 (65,15%) s nádorom tkanív podstatne nižšie v porovnaní so susednými nenádorových tkanív ( P
= 0,0029, obrázok 1).

ARID1A Protein Expression analyzované westernovým prenosom

Western blotting bolo vykonané na 25 vzorkách rakovinou žalúdka a zodpovedajúce priľahlé non-rakovinové tkanivá žalúdočnej sliznice z 66 párových vzoriek. Výsledky ukázali ARID1A pás pri očakávanej veľkosti 242 kDa a množstvo proteínu prítomného ARID1A bola ďalej meraná denzitometria. V súlade s kvantitatívnej real-time PCR výsledky, zníženie ARID1A expresie bola pozorovaná u 13 (52%) z žalúdočných nádorových tkanivách v porovnaní so susednými spárovaných nenádorových tkanív ( P
= 0,0015, a Obrázok 2A obrázok 2B). Rovnako tak výraz ARID1A proteínu sa značne znížila v žalúdočných rakovinové bunkové línie, SGC7901, AGS, a to najmä v MGC803, v porovnaní s normálnou bunkové línie žalúdočné GES1 (obrázok 2C).

Imunohistochemické analýza expresie ARID1A v žalúdočnej tkanive rakoviny vzorky a jeho vzťah k klinicko-parametre

Ak chcete ďalej skúmať klinicko a prognostické role ARID1A prejavu, Vykonali sme imunohistochemických analýz 224 parafínových rakoviny žalúdka tkanivových blokov. Celkovo 115 224 (51,3%) prípadoch ukázali negatívny ARID1A expresiu v rakovinových tkanív (Obrázok 3B), vzhľadom k tomu, 109 (48,7%) prípadoch boli pozitívne imunologické (obrázok 3C &D). Normálny žalúdočnej sliznice ukázala najsilnejšia ARID1A pozitívne farbenie (obrázok 3A). Korelácia medzi expresiou ARID1A a rôznych klinicko parametre sú uvedené v tabuľke 1. Dáta ukázali, že strata ARID1A expresie významne koreluje s hĺbkou nádorovú infiltráciou (T fáze, P
= 0,001) a nádoru trieda ( P
= 0,006), ale nie s vekom, pohlavím, veľkosť nádoru, vzdialené metastázy (M fáza) a nádoru oku alebo miestna lymfatických uzlín (N fáza).

Expression z ARID1A a klinickým výsledkom

5-ročné celkové prežívanie u pacientov s pozitívnym aj negatívnym ARID1A výrazu bolo 68,8% a 52,2%, resp. Celkové prežívanie pacientov s negatívnym ARID1A expresiou bol podstatne horší ako u pacientov ARID1A-pozitívna ( P
= 0,003, log-rank test, obrázok 4). Jednorozmerný Cox regresnej analýzy ukázali, že hĺbka nádorovú infiltráciou, lymfatických uzlín, vzdialené metastázy, veľkosť nádoru a ARID1A expresie boli významne spojené s celkovým prežitím (tabuľka 2). Okrem toho, multivariačný regresná analýza potvrdila Cox hĺbku nádorovú infiltráciou, lymfatických uzlín, vzdialené metastázy a ARID1A expresiu ako nezávislé prediktory celkového prežitia u pacientov s karcinómom žalúdka (tabuľka 2).

Role ARID1A
v bunkovej proliferácie a Colony formácie v MGC803 a GES1 bunkových línií

Ak chcete zhodnotiť dopady ARID1A
na proliferáciu buniek, ARID1A
expresný vektor a riadiace vektor bol transfekován do príslušne MGC803 buniek. ARID1A
expresie v transfekciou bunkách boli detekované westernovým prenosom (obrázok 5A). Test rastu buniek sa zistilo, že rast buniek v ARID1A
-transfected buniek karcinómu žalúdka boli výrazne nižšie ako kontrolné rakovinových buniek vektormi transfekovány žalúdka (obrázok 5c). Medzitým účinnosť tvorby kolónií bola významne ( P
= 0,0379) inhiboval v ARID1A
-transfected žalúdočné nádorové bunky v porovnaní s kontrolnými rakovinových buniek vektormi transfekovány žalúdka (obrázok 5D). Pre ďalšie potvrdenie funkcia potlačenia proliferácie ARID1A
umlčaný sme ARID1A
expresie v bunkovej línii GES1 s siRNA. ARID1A
expresie v transfekciou bunkách boli detekované westernovým prenosom (obrázok 5B). Zistili sme, že umlčanie expresie ARID1A
v GES1 podstatne lepšiu proliferáciu buniek v porovnaní s predstieraným siRNA liečby (obr 5E).

Diskusia

Napriek veľkým pokrokom v diagnostike a terapia, rakovina žalúdka zostáva jedným z najviac smrteľných nádorov, s neutešenou prognózu po radikálnej gastrektómii [14], [15]. Klinický výsledok karcinómu žalúdka je určená radom nádorových charakteristík, ako je lokoregionálnej nádorový rast a inváziu, s nižším stupňom diferenciácie, angiogenézy, vzdialených metastáz a progresie bunkového cyklu, ktoré sú regulované rôznymi súvisiacich génov, vrátane onkogénov a nádorový supresor gény. Preto, identifikácia biomarkerov žalúdočné karcinóm špecifického zapojených do týchto postupov je pre diagnózu, liečbu a predikcie prognóza v klinike veľmi dôležité.

ARID1A
, novo označené nádorový supresorový gén, ktorý kóduje člen komplexu SWI /SNF, má vysokú mutačné frekvenciu v rakoviny močového mechúra, maternice karcinómu vaječníkov, endometrioid endometrioid a karcinómu z jasných buniek [11] - [13], [16], [17]. Vaječníkov karcinómu z jasných buniek, je popísané, že ARID1A
mutácie je významne spojená s ARID1A imunoreaktivity [18]. V poslednej dobe, exome sekvenčné Štúdia odhalila, že ARID1A
je tiež často mutované u karcinómu žalúdka [19], [23]. Avšak, doteraz výrazu, klinický význam a biologických funkcií ARID1A
u karcinómu žalúdka neboli preskúmané. Z tohto dôvodu sme hodnotili expresiu ARID1A
u karcinómu žalúdka prostredníctvom real-time PCR, western blotting a imunohistochémia, okrem svojej klinicko a prognostický význam vo veľkej ľudskej vzorke. Okrem toho, použitie v modeli buniek in vitro, tiež skúmali nádorového supresor rolu ARID1A
v žalúdočných bunkách v detaile.

V súčasnej štúdii sme preukázali, že ARID1A
bol vyjadrený ako na spodnej mRNA a proteínové úrovni v žalúdočnej rakovinové tkanive ako zodpovedajúca Nerakovinový sliznicou. V súlade s týmito molekulárne biologických poznatkov, imunohistochemických chémie s anti-ARID1A protilátky ukázali, že ARID1A
bol kompletne umlčaný v 115 von 224 vzoriek od pacientov s rakovinou žalúdka, s pozitívnym výrazom v ďalších 109 pacientov. Naše pozorovania je v súlade s radom štúdií ukázať, že ARID1A
výraz je často stratená alebo obmedzená v počte rakovinových tkanív a bunkových línií, ako je rakovina prsníka, rakoviny maternice, vaječníkov endometrioid jasných buniek a karcinómu endometrioid [13,18,20 a 21].

K dnešnému dňu, príčiny ARID1A
umlčanie neboli plne objasnené. Existujúce štúdie sa zameriavajú na mutácií v ARID1A
, najmä v gynekologických nádorov. Uvádza sa, že nezmysel alebo INDEL mutácie ARID1A
korelovala so stratou alebo zníženie expresie proteínov v maternicovej endometrioid karcinómu vaječníkov, karcinómu endometrioid a karcinómu z jasných buniek [11] - [13], [18]. V integrovanej genómovej vyšetrovania Mamo et al
. len našiel jeden skrátený mutáciu ARID1A
v nádorových buniek línie T47D prsníka, a to bez akejkoľvek mutácie u vzoriek s karcinómom prsníka 11, ktoré ukazovali DNA kópie stratu číslo na 1p36.11 lokuse susediace s ARID1A
[22]. Osem z deviatich vzoriek DNA kópií stratou čísla v 1p36.11 tiež majú nízku expresiu ARID1A proteínu, čo ukazuje na zhodu medzi DNA kópií straty číslo a ARID1A
deaktiváciu. V štúdii exome sekvenovania Wang a kol
., Zistilo sa celkom 46 mutácií v 32 zo 109 (29%) vzoriek s karcinómom žalúdka, s 39 (85%) skrátené mutácií [19]. Dvadsaťštyri (75%) vzoriek 32 rakovinou žalúdka s ARID1A
mutácie ukazujú buď stratu alebo podstatne zníženú expresiu proteínu v porovnaní s tými, bez ARID1A
mutácie. Naproti tomu len 6 vzoriek žalúdočnej rakovina vykazujú nulovú alebo oslabené proteínu v neprítomnosti detekovateľné ARID1A
mutácií, čo naznačuje, že iné mechanizmy môžu prispievať k ARID1A
inaktiváciu. V poslednej dobe iný exome sekvenovania výskum Zang et al
. tiež ukázal, ARID1A
mutácie u 8% žalúdočných vzoriek, z ktorých 75% stratených alebo zníženej expresie proteínu [23]. Ďalšie zaujímavé je, že obe štúdie preukázali vyšší ARID1A
zmeny vo vzorkách rakovinou žalúdka s mikrosatelitních nestability (MSI), než tí s mikrosatelitov stability (MSS). Okrem toho mutácie spektrum ARID1A
sa líši medzi týmito dvoma genetických typov rakoviny žalúdka, s väčšinou indels na type MSI a viac variantov s jednou neucliotide v type MSS. MSI je definovaná ako mutácie v rámci nukleotidov INDEL repetície (známy ako mikrosatelitních oblastí) sa získa z génových opravy chyby replikácie DNA z nesúrodosti inaktivačných vyvolanej [24]. Navrhnuté ako iniciačných genomických udalostí rakoviny žalúdka, MSI často vedie k hromadeniu ďalších genetických nestabilít súvisiacich s rakovinou, ako sú alelické straty a posunovými mutáciami génov, podieľajúcich sa na regulácii bunkovej proliferácie, apoptózy a opravy DNA. Bolo oznámené, že MSI sa vyskytuje u 25% až 50% sporadických karcinómu žalúdka, definujúce jedinečný genetický typ ochorenia s rôznymi funkciami klinicko [24]. V štúdii Wang et al
., Miera INDEL mutácie (78%) ARID1A
v MSI rakoviny žalúdka je porovnateľná so situáciou TGFBR2
v hrubom čreve MSI rakovina, dobre zavedený a funkčne overené vodič gén inaktivuje MSI [25]. Tieto údaje naznačujú, že mutácia ARID1A
spolu s MSI môže hrať dôležitú úlohu v žalúdočnej karcinogenéze. Preto je vzťah medzi ARID1A
zmeny a MSI postavenie v rakoviny žalúdka, rovnako ako jeho klinickopatologické významu, si vyžaduje ďalšie skúmanie v budúcom výskume.

V štúdii Wang et spol.
, výrazom ARID1A
bola detekovaná iba v malej veľkosti vzorky (32 prípadov), a tam bol žiadny ďalší prieskum jeho klinický význam [19]. Tu, vo väčšom žalúdka populácie rakoviny (224 prípadov), sme zistili, že strata ARID1A
expresie významne koreluje s vyššou T štádiu rakoviny žalúdka, čo znamená, že neprítomnosť ARID1A
výraz môžu podporovať rast nádorov a invázie. Okrem toho sme zistili, nižšia ARID1A imunoreaktivitu v málo diferencovaných žalúdočné rakovinové tkanive, ako tie v dobre diferencovaných, čo naznačuje, že sa znížil ARID1A
expresie môže hrať úlohu v nádorovej dediferenciace. V súlade s našimi zisteniami, iní výskumníci tiež zistilo, že sa znížil ARID1A
expresie je významne spojená s vyšším stupňom rakoviny prsníka [22], ako aj vyššom stupni FIGO v vaječníkov karcinóm jasných buniek [21]. ARID1A podporuje tvorbu BRG1 alebo BRM-obsahovala SWI /SNF remodeláciu chromatínu komplexy, ktoré sú nevyhnutné pre normálnu zástave bunkového cyklu [9], [26].

Analýza prežitie Kaplan-Meier ukázala významnú koreláciu medzi strata ARID1A
prejavu a chudobnejšie klinický výsledok u pacientov s karcinómom žalúdka po radikálnej operácii. Cox pomer rizika regresnej analýzy ďalej preukázané, že ARID1A
hladina expresie bola nezávislým rizikovým faktorom pre prežitie, čo naznačuje, že to môže slúžiť ako cenný prognostického biomarkeru u pacientov s karcinómom žalúdka po chirurgickom zákroku a potenciálny cieľ pre génovú terapiu v liečba rakoviny žalúdka. V vaječníkov karcinóm jasných buniek, to bolo tiež hlásil, že pacienti s pozitívnymi ARID1A
prejave mal dlhšie prežitie bez progresie ako pacienti s negatívnym ARID1A
výraz [21]. Okrem toho, strata ARID1A
expresie významne koreluje s chemorezistence v vaječníkov karcinóm jasných buniek, ktorá je tiež spojená so zlou prognózou rakoviny. Tieto údaje naznačujú, že ARID1A
expresie a mutácie vyšetrenie užitočné pre vedenie klinickú liečbu. Dohromady, naše pozorovania, že strata ARID1A
expresie v karcinómu žalúdka je spojená s viacerými malígnych fenotypmi a horšiu prognózu naznačujú, že môžu hrať úlohu v tumor supresorové žalúdočnej karcinogenéze.

ďalej skúmané funkčné úlohu ARID1A
v bunkových líniách žalúdku. Obnovenie ARID1A
expresiu v rakovinových bunkách žalúdku významne inhibovala proliferáciu buniek a tvorba kolónií. Umlčanie expresie ARID1A
v žalúdočných buniek epitelu výrazne zvyšuje rýchlosť bunkového rastu. Tieto výsledky ukazujú, že ARID1A
môžu hrať úlohu pri dovoze inhibíciu rastu nádorových buniek. V poslednej dobe funkčné testy na ARID1A
v žalúdku rakovinových bunkových línií zo strany Zang et al
. navrhol, že ARID1A
vyvinúť tumor-supresorové aktivity [23]. Guan et al
. preukázali, že obnovenie expresiu divokého typu ARID1A
je dostatočná pre potlačenie proliferácie a tumorigenecity z xenoimplantátů sa ľudskej rakoviny vaječníkov bunkové línie nesúce ARID1A
mutácie, zatiaľ čo RNA interferencie sprostredkovaná ARID1A
umlčanie vylepšuje bunkovú proliferáciu a tumorigeničnosti v dvoch netransformovaných ľudských vaječníka epiteliálnych bunkových línií, IOSE-80PC a OSE4 [27]. Tieto údaje spolu s našimi, ukazujú, že strata ARID1A
môže hrať dôležitú úlohu v procese karcinogenézy.

Na záver sme preukázali stratu ARID1A
expresie v karcinómu žalúdka a jej koreláciu s viacerými malígneho fenotypu a horšie prognózou vo veľkom množstve klinických vzoriek. Okrem toho sa ukázalo, že ARID1A
môžu inhibovať rast nádorových buniek a tvorbu kolónií in vitro. Podľa nášho najlepšieho vedomia, že údaje získané v tejto štúdii predstavujú prvú správu korelujúce prítomnosť ARID1A
s klinicko-charakteristík a celkové prežívanie pacientov s rakovinou žalúdka. Dohromady s výsledkami Wang et al.
A Zang et al
. [19], [23], budeme ďalej potvrdili, že ARID1A
by mohlo slúžiť ako kandidát nádorový supresor a prognostického biomarkeru v žalúdku rakoviny.

materiáloch a metódach

Vyhlásenie etika

výskum bol schválený etickou komisiou zo Sun Yat-sen University Cancer Center a písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta zapojených do štúdie.

bunkové línie a kultivačné podmienky

žalúdočné rakovina bunkové línie, SGC7901, AGS, MGC803 a žalúdočnej sliznice epitelu bunkové línie GES1 boli získané z výboru Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Bunkové línie boli kultivované v médiu RPMI 1640 dodávané s 10% teplom-neaktívne fetálnym hovädzím sérom (FBS). Bunky boli inkubované pri 37 ° C vo vlhkej komore, obsahujúce 5% CO _2.

tkanivového vzorky s

celkom 66 párované rakovinové a prispôsobená priľahlé noncancerous žalúdočnej sliznice tkaniva boli získané od pacientov s karcinómom žalúdka podstupujúcich gastrektómii v Sun Yat-sen University Cancer Center v rokoch 2009 a 2011, a diagnóza bola potvrdená patologickým vyšetrením. 25 párované rakovinové a zodpovedajúce priľahlé nenádorové žalúdočnej sliznice tkaniva použité pre detekciu expresie proteínu v ARID1A westernovým prenosom boli vybrané z 66 párovaných vzoriek. Po chirurgickej resekcii, čerstvé tkanivá sa okamžite ponorí do RNAlater (Ambion, Inc., USA), aby sa zabránilo degradácii RNA, skladované pri teplote 4 ° C cez noc, aby umožnil dôkladné prenikanie RNAlater do tkaniva a potom sa zmrazí pri -80 ° C až do RNA a extrakcia proteínov bola vykonaná. Ďalších 224 samostatných vzoriek karcinómu žalúdka parafínu zaliate ktoré boli zhromaždené v rokoch 2003 a 2005, boli získané z Sun Yat-sen University Cancer Center. Žiadny z týchto pacientov dostalo rádioterapii alebo chemoterapii pred operáciou. Spojitosť údaje o pacientov s rakovinou žalúdka v tejto štúdii sú k dispozícii a úplné. Pooperačné sledovanie došlo v našej ambulancii a zahŕňali klinické a laboratórne vyšetrenie každé 3 mesiace po prvých 2 rokov, každých 6 mesiacov počas tretej až piaty rok, ročne po dobu ďalších 5 rokov alebo do smrti pacienta, podľa toho, čo sa prvýkrát objavila. Histopatologické typ a fázy rakoviny žalúdka boli stanovené v súlade s kritériami klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie a vo fáze TNM stanovenej Európskou úniou pre medzinárodný boj proti rakovine.

Extrakcia celkovej RNA a Real-time kvantitatívne PCR

Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) podľa protokolu výrobcu. Celková koncentrácia RNA bola stanovená meraním absorbancie pri 260 nm za použitia spektrofotometra NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Reverzný transkripcie (RT) syntetizovať z prvej vlákno cDNA bola vykonaná s 2 ug celkovej RNA ošetrené M-MLV reverznej transkriptázy (Promega, USA) podľa odporúčania výrobcu. Výsledná cDNA sa potom podrobí real-time kvantitatívne PCR pre hodnotenie úrovne relatívnej mRNA ARID1A stroje a GAPDH
(glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, ako vnútorná kontrola), s nasledujúce primery: ARID1A
vpred: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ', a reverzný: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3'; GAPDH
vpred: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', a reverzný: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. zosilnenie gén špecifický bola vykonaná za použitia real-time PCR systému ABI 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) s 15 ul PCR zmesi obsahujúce 0,5 ul cDNA, 7,5 ul 2 x SYBR Green master mixu (Invitrogen, Carlsbad , Kalifornia, USA), a 200 nM vhodných oligonukleotidových primérov. Zmes sa na teplotu 95 ° C (10 min) a potom amplifikovanej pri teplote 95 ° C (30 sekúnd) a 60 ° C (1 min) počas 45 cyklov. Rozlíšenie krivka bola meraná pri teplote 95 ° C počas 15 sekúnd, 60 ° C počas 15 sekúnd a 95 ° C počas 15 sekúnd. Hodnota Ct (cyklus prah) každej vzorky bola vypočítaná z prahových cyklov so softvérom prístroja (SDS 2.3) a relatívna vyjadrenie ARID1A
mRNA je normalizované na GAPDH
hodnote , Dáta boli analyzované s použitím porovnávacej prah cyklu (2 ^{-ΔCT) metódy.}

Western blotting analýza

Homogenizované vzorky žalúdočné rakovina, vrátane nádoru a nontumor tkanív, ako aj bunkových línií , boli lyžovanie v RIPA pufri pre lýzu a lyzáty boli zozbierané centrifugáciou (12000 otáčok za minútu) pri teplote 4 ° C počas 30 minút. Približne 50 ug proteínových vzoriek boli oddelené elektroforézou na 12% dodecylsulfát sodný polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membránu. Po blokovaní nešpecifických väzobných miest po dobu 60 minút s 5% netučného mlieka, boli membrány inkubované cez noc pri 4 ° C s myšou monoklonálnou protilátkou proti ARID1A (Abgent primárna protilátka Company, USA, pri 1: 1000 riedenie) , Membrány potom boli trikrát premyté TBST (tris-pufrovanom soľnom roztoku s Tween-20) počas 10 minút a testované s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou králičie anti-myšou IgG protilátkou (Immunology Consultants Laboratory, USA, na 1: 2000 riedenie) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po troch premytí membrány boli vyvinuté zvýšenou systému chemiluminiscencie (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Intenzita Kapela bola meraná pomocou denzitometrie pomocou softvéru Množstvo One (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Hladiny proteínov boli normalizované k tomu GAPDH detekovaná pomocou myšou anti-ľudský GAPDH monoklonálne protilátky (Shanghai Kangchen, Čína, pri 1: 10000 riedenie).

Imunohistochémia Analýza

Tkanivové rezy boli deparafinizovány dimetylbenzenem a rehydratuje cez 100%, 95%, 90%, 80% a 70% etanolu. Po troch premytí v PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok), bola sklíčka varí v antigénu vyhľadávacom pufri obsahujúcom 0,01 M citrátu sodného, ​​kyseliny chlorovodíkovej (pH = 6,0) po dobu 15 minút v mikrovlnnej rúre. Po opláchnutí PBS boli tkanivové rezy boli inkubované s primárnou protilátkou a sklíčka sa potom opláchne 3% roztokom peroxidázy zhášacej (Invitrogen) k zablokovaniu endogénnej peroxidázy. Rezy boli potom inkubované s myšou monoklonálnou protilátkou proti ARID1A (Abgent primárny protilátkou Company, USA, pri 1: 300 riedenie) pri teplote 4 ° C cez noc a potom sa inkubujú s chrenovou peroxidázou (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) pri izbovej teplote po dobu 30 min. Po premytí v PBS, vizualizácie signál bol vyvinutý s 3, 3'-Diaminobenzidine roztoku (DAB), a všetky snímky boli kontrastne hematoxylínom. Ako negatívne kontroly priľahlé rezy boli spracované ako je popísané vyššie, okrem toho, že boli inkubované cez noc pri 4 ° C v blokujúcom roztoku bez primárnej protilátky.

Celková ARID1A imunologické farbenie skóre bolo vypočítané ako súčet percenta pozitívne škvrny na nádorové bunky a intenzita farbenia. V stručnosti, percento pozitívneho farbenia bola hodnotená ako 0 (0-9%, negatívny), 1 (10% -25%, sporadické), 2 (26% -50%, kontaktný), alebo 3 (51% -100%, difúzna), a intenzita ako 0 (bez škvŕn), 1 (slabé farbenie), 2 (stredná farbenie) a 3 (tmavé sfarbenie). Celkové skóre bolo vypočítané imunologické s hodnotou percent pozitivity skóre x intenzita farbenia skóre, ktoré v rozmedzí od 0 do 9. Hladina expresie ARID1A bola definovaná nasledujúcim spôsobom: "-" (negatívny, skóre 0), "+" (slabo pozitívne, skóre 1-3), "++" (pozitívna skóre 4-6), "+++" (silne pozitívne, skóre 7-9). na úrovni ARID1A expresie na báze, pacienti s rakovinou žalúdka boli rozdelené do dvoch skupín :. negatívna ARID1A výrazom skupina (ARID1A-) a pozitívne ARID1A výrazom skupina (ARID1A +, ARID1A ++ alebo ARID1A +++)

expresného plazmidu a prechodné transfekcia

a eukaryotických expresné plazmid pCMV6-Entry obsahujúci plnú dĺžku ľudského ARID1A
cDNA bola získaná z Asbio Technology Company (Guangzhou, Čína). Prázdny vektor bol použitý ako negatívna kontrola. MGC803 Bunky boli kultivované v 6-jamkových doštičkách, až sa dosiahne 85-90% zhlukovania a potom prechodné transfekcia boli vykonávané za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Štyridsať osem hodín po transfekciu, génová expresia bola skúmaná metódou Western blot analýzou. A potom, boli vykonané proliferáciu buniek a tvorba kolónií.

RNA oligonukleotidy a buniek transfekcia

Vyradenie ARID1A
vyjadrenie, že siRNA boli syntetizované GenePharma Company (Shanghai, Čína). Sekvencia siRNA boli nasledujúce: siRNA- ARID1A
, zmysel: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 "antisencie: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3". Negatívna kontrola (NC), zmysel: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 'antisencie: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ". 400 pmol siRNA- ARID1A
alebo NC boli transfekovány do 2 x 10 ^{5 GES1 buniek s použitím Lipofectamine RNAi MAX činidlo (Invitrogen, USA) podľa protokolu výrobcu. Po tom, množenia buniek bola potom vykonaná.}

Test proliferácie

rast buniek z MGC803 alebo GES1 buniek bola zistená pomocou MTS testu bunkovej proliferácie. Bunky boli nasadené na 96-jamkové doštičky v hustote 5 x 10 ^{2 buniek na jamku. Rýchlosť rastu buniek bola detekovaná s použitím bunkovej proliferácie MTS kit podľa inštrukcií výrobcu (Promega, USA). Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}

Colony Formation Test

testu tvorby kolónií, ARID1A
Epidermal Growth Factor MGC803 buniek alebo kontrolu MGC803 bunky boli nanesené na 6-jamkové dosky v hustote 5 x 10 ^{2 buniek na jamku. Po 10 dňoch kultivácie, prežívajúce kolónie (viac ako 50 buniek na kolóniu) boli počítané s kryštalickej fialovej (0,5%) farbenie. Účinnosť tvoriacich kolónie (CFE%) bola definovaná ako pomer počtu kolónií vytvorených v kultúre k počtu buniek naočkovaných. Experiment bol vykonaný v triplikátech.}

Štatistická analýza

Rozdiely v mRNA a expresie proteínu medzi vzorkami nádorov a párovaných vzoriek okolitom normálnom tkanív boli hodnotené s spárovaných vzoriek-t-testu. Χ ^{2 test bol použitý na analýzu vzťahu medzi ARID1A prejavu a rôznych klinicko parametrov. Krivky prežitia boli vypočítané s použitím metódy Kaplan-Meier a porovnané pomocou log-rank testu. Proporcionálny nebezpečenstvo regresný model Cox bol použitý pre jednorozmerné a mnohorozmerné analýzy k štúdiu účinkov klinicko-premenných a ARID1A prejave na prežitie. t
testu dvojchvostý nepárového Studentovho bola použitá na posúdenie rozdielov v rýchlosti bunkového rastu a tvorby kolónií. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou štatistického balíčka pre spoločenských vied, verzia 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) a obojstranný P
hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významné.}

• Ploche ONE: rozdielne trendy v posledných plošnej miery prežitia v pažeráku a žalúdku Cancer
• Ploche ONE: Identifikácia HSA-MIR-335 ako prognostický podpis v žalúdku Cancer