Plos ONE: Zmanjšana Izražanje ARID1A gena je povezana s slabo prognozo v osnovni želodca Cancer

Povzetek

Ozadje

ARID1A
gen kodira adenin-timin (AT ) -RICH interaktivno vsebujejo domene protein 1A, ki sodeluje pri kromatina preoblikovanje. ARID1A
je pokazala, da deluje kot supresorski tumorja pri različnih vrstah raka. V trenutni študiji smo raziskovali izraz in prognoze vrednost ARID1A
v primarnim rakom želodca. Medtem, biološka vloga ARID1A
je dodatno pregledajo s pomočjo modela celice in vitro.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Da bi raziskali vlogo ARID1A
gen v osnovnem želodca patogenezi raka, so v realnem času kvantitativne PCR in western-blot za raziskavo ARID1A
izraz v paru rakavih in noncancerous tkiva. Rezultati so pokazali, zmanjšal ARID1A
mRNA ( P
= 0,0029) in beljakovin ( P
= 0,0015) izraz v večini-tumorskih nosi tkiva v primerjavi z ujemajočo sosednjo zunaj tumorja tkiv in v želodcu raka celičnih linij. Po dodatni preiskavi clinicopathological in prognostičnih vloge ARID1A
izražanja, smo izvedli imunohistokemični analize blokov 224-parafin vgrajeni raka želodca tkiva. Podatki so pokazali, da je bila izguba ARID1A
izražanja močno povezana s stopnjo T ( P
= 0,001) in razred ( P
= 0,006). V skladu s temi rezultati, smo ugotovili, da je izguba ARID1A
izraz je pomembno povezana s slabim preživetje pri bolnikih želodca z rakom ( P
= 0,003). Cox regresija analize so pokazale, da je ARID1A
izraz je bil neodvisen napovedovalec celokupnega preživetja ( P
= 0,029). Poleg funkcije ARID1A
in tvorbe jedrskega orožja in kolonije celičnih linij želodca so bili analizirani s transfekcijo celic s polno dolžino ARID1A
izražanje vektor ali siRNA ciljanje ARID1A
. Obnavljanje ARID1A
izraz v želodčnih rakavih celic močno zaviral proliferacijo celic in nastanek kolonij. Utišati ARID1A
izraz želodčnega celični liniji epitela znatno povečala stopnjo rasti celic.

Sklepi /Pomen

Naši podatki kažejo, da je ARID1A
lahko igrajo pomembno vloga pri raku želodca in lahko služi kot dragocen prognostični označevalec in potencialne tarče za gensko terapijo pri zdravljenju raka želodca

Navedba. Wang dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen JG et al. (2012), zmanjšano izražanje ARID1A
Gene je povezana s slabo prognozo na primarnem želodca raka. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364

Urednik: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapur

Prejeto: 19. januar 2012; Sprejeto: 6. junij 2012; Objavljeno: 13. julij 2012

Copyright: © 2012 Dandan et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (30973398) in Guangdong Natural Science Foundation (925100890). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši malignom po vsem svetu, in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka vsako leto (10,4% smrti zaradi raka) [1]. Zdravljenje raka želodca vključuje kombinacijo operacijo, kemoterapijo ali obsevanjem. Vendar pa je skoraj 60% bolnikov, ki so tudi po samo kurativno resekcijo ali po adjuvantno terapijo [2] prizadeti podlegel raku želodca. Že dolgo je znano, da rezultati želodčnega raka iz kombinacije okoljskih dejavnikov in kopičenja splošnih in specifičnih genskih sprememb. Mnogi izmed genskih ali epigenetske spremembe, povezane z rakom želodca, vključno z izgubo heterozigotnosti, mikrosatelitno in kromosomsko nestabilnost in hypermethylation so poročali [3]. Razumevanje teh sprememb in molekularnih mehanizmov, ki sodelujejo pri želodčnem rakotvornost bo ključnega pomena za izboljšanje diagnostike, zdravljenja in prognoze napovedovanje te bolezni.

eukaryotically ohranja SWI /SNF-kromatin preoblikovanje kompleksna igra bistvene vloge v različnih celičnih procesov, vključno z diferenciacijo, proliferacijo in popravilo DNA [4]. Izguba SWI /SNF podenote so poročali v večini tumorjev in veliko število eksperimentalnih opazovanj kažejo, da je ta kompleks ključnega pomena za zatiranje tumorjev [5]. Kompleksi vsebuje sedem ali več noncatalytic podenote, ki domnevno pomagajo modulirajo ciljanje in aktivnosti ATPaze [6]. Eden podenote tega kompleksa, hSNF5 /Ini1 /BAF47, je bila opredeljena kot zaviralnih [7], [8]. Drugi noncatalytic podenote, P270 /ARID1A /BAF250a (adenin-timin AT bogate interaktivne domene, ki vsebujejo beljakovine 1A), je bilo dokazano, da je bistvenega pomena za normalno ustavitev celičnega cikla [9]. Rasklapanje za ARID1A
in levkemija celične linije daje odpornost na Fas posredovano apoptoze [10].

V zadnjem času, ARID1A
mutacij in izgube BAF250a beljakovine so ugotovili, da močno korelira z jajčnikov jasno karcinomom in maternice nizke kakovosti endometrioid raka [11] - [13]. Te ugotovitve kažejo, da je ARID1A
je potencialna kandidatka zaviralnih genov. Vendar pa je klinični pomen take diferencialne izražanja in funkcija ARID1A proteina ostane nedefiniran zaradi pomanjkanja študijah z uporabo svežih vzorcev človeških tumorjev. V tej študiji smo analizirali na ARID1A
nivoja izražanja z rakom želodca uporabo v realnem času kvantitativne RT-PCR, metodo Western blot in imunohistokemija. Medtem smo opredelili odnos med ARID1A
izražanja in clinicopathological funkcij in oceniti njegovo napovedno vrednost v post-resekcijo preživetje bolnikov z rakom želodca. Poleg tega smo ocenili funkcionalno vlogo ARID1A
v tumorigeneze primarnega raka želodca s preučevanjem in vitro tvorbo širjenja in kolonijo v celičnih linijah želodca.

Rezultati

ARID1A
mRNA izražanja, ki v realnem času kvantitativne RT-PCR

raven mRNA analiziranih ARID1A
je bila določena z realnem času kvantitativnih preskusih RT-PCR v 66 seznanjene rakavi in izravnana sosednji normalne želodčne sluznice tkiva. je ARID1A
nivo izražanja bistveno nižja v 43 (65,15%)-tumorskih nosi tkiva v primerjavi s sosednjimi ne-tumorskih tkivih ( P
= 0,0029, slika 1).

ARID1A Protein Expression Western blot
Analizirano

Western blot je bila izvedena na 25 želodca vzorcih raka in ustrezne sosednje niso rakave želodčne sluznice tkiva pri 66 parih vzorcev. Rezultati so pokazali ARID1A pas pri pričakovani velikosti 242 kDa in zneskom ARID1A proteina Trenutno je nadalje merjeno z denzitometrijo. V skladu s količinskimi realnem času rezultatov PCR, je bilo zmanjšanje ARID1A izražanja opazili pri 13 (52%) od želodca tumorskih tkivih, v primerjavi z ujemanjem sosednjih non-tumorskih tkivih ( P
= 0,0015, slika 2A in Slika 2B). Prav tako je izraz, katerega ARID1A beljakovine izredno zmanjšala v želodcu raka celičnih linijah, SGC7901, AGS, zlasti v MGC803, v primerjavi z običajnim želodca celične linije GES1 (slika 2C).

Imunohistokemično Analiza ARID1A izražanja v želodcu raka tkiva vzorci in njen odnos do clinicOpathological parametri,

za nadaljnjo raziskavo clinicopathological in prognostičnih vloge ARID1A izražanja, smo izvedli imunohistokemijske analize blokov 224-parafin vgrajeni raka želodca tkiva. Na splošno je 115 224 (51,3%) primerih so pokazali negativno ARID1A izraz v rakastih tkiv (slika 3B), medtem ko je 109 (48,7%) primerih so pokazali pozitiven imunskim barvanjem (slika 3C & D). Običajno želodčne sluznice je pokazala najmočnejši ARID1A pozitivno barvanje (slika 3A). Korelacije med izražanjem ARID1A in različnih clinicopathological parametrov so navedene v tabeli 1. Podatki so pokazali, da je bila izguba ARID1A izražanja bistveno povezana z globino tumorsko infiltracijo (fazi T, P
= 0.001) in tumor razred ( P
= 0,006), vendar ne na starost, spol, velikost tumorja, oddaljenih metastaz (M fazi) in tumorja locus ali lokalni bezgavkah metastaze (N fazi).

Expression za ARID1A in kliničnim izidom

splošne stopnje preživetja 5-letno pri bolnikih s pozitivnim in negativnim izrazom ARID1A je bilo 68,8% in 52,2%, v tem zaporedju. Celoten preživetje bolnikov z negativnim izražanja ARID1A je bistveno slabša kot pri bolnikih, ki ARID1A pozitivnih ( P
= 0,003, test log-rank, slika 4). Univariatne Cox regresijska analiza pokazala, da je globina tumorske infiltracije, lokalnih bezgavk metastaz, oddaljenih metastaz, velikost tumorja in ARID1A izražanja močno povezana s celokupno preživetje (tabela 2). Poleg tega je multivariatna Cox regresijska analiza je potrdila globine tumorske infiltracije, lokalnih bezgavk metastaz, oddaljenih metastaz in ARID1A izražanja kot neodvisni kazalcev celotnega preživetja bolnikov z rakom želodca (Tabela 2).

Vloga ARID1A
in celično proliferacijo in Colony formacije v MGC803 in GES1 celičnih linij

Za oceno učinkov ARID1A
na proliferacijo celic, ARID1A
izrazni vektor in kontrolni vektor sta bila transfektirali v MGC803 celice. ARID1A
izraz v transfekciji celice so odkrile zahodne blot analiza (slika 5A). Test rast celic je pokazala, da je stopnja rasti celic v ARID1A
-transfected želodca rakave celice so bile bistveno nižje od želodca rakavih celic kontrolnih vektorskih transfekcije (slika 5C). Medtem, pomembno je učinkovitost tvorbe kolonij ( P
= 0,0379) zaviral ARID1A
-transfected celice želodca raka v primerjavi z želodčnih rakavih celic kontrolnih vektorskih transfekcije (Slika 5D). Da bi še dodatno potrditev funkcije dušenje orožja za ARID1A
, smo utihnile ARID1A
izraz v skladu GES1 celic z siRNA. ARID1A
izraz v transfekciji celice so odkrile zahodne blot analiza (slika 5B). Ugotovili smo, da utišati izražanje ARID1A
in GES1 znatno povečala proliferacijo celic v primerjavi z modelnim siRNA zdravljenja (slika 5E).

Pogovor

Kljub velik napredek v diagnostiki in terapijo, želodčni rak ostaja eno najbolj smrtonosnih novotvorbe, s porazno prognozo po radikalni želodca [14], [15]. Klinični izid raka želodca, je določen z nizom značilnosti tumorja, kot Lokoregionalno rast tumorja in invazije, diferenciacijo razred, angiogenezo, daljni metastaz in napredovanje celičnega cikla, ki so urejene z različnimi sorodnih genov, vključno onkogenov in zaviralnih geni. Zato je identifikacija želodcu raka specifičnih biomarkerjev, ki sodelujejo v teh postopkih je zelo pomemben za diagnozo, terapijo in napoved prognoze na kliniki.

ARID1A
, na novo opredeliti tumor supresorski gen, ki kodira član kompleksa SWI /SNF, ima visoko frekvenco mutacij pri raku sečnega mehurja, maternice endometrioid karcinom, endometrioid jajčnikov in jasno karcinomom [11] - [13] [16] [17]. V jajčnikov jasno karcinomom, je poročala, da je ARID1A
mutacije je bistveno povezana z ARID1A radioinkorporacijo [18]. V zadnjem času študija exome zaporedja pokazala, da je ARID1A
je tudi pogosto mutirani z rakom želodca [19], [23]. Vendar pa doslej izraz, klinični pomen in bioloških funkcij ARID1A
in rakom želodca, niso bili raziskani. Zato smo ocenili izražanje ARID1A
pri raku želodca s PCR v realnem času, zahodni s sušenjem in imunohistokemijo, poleg tega, da clinicopathological in prognostični pomen v veliki človeški vzorec. Poleg tega se uporabljajo v modelu in vitro celic, smo raziskovali tudi vlogo za tumor dušenje v ARID1A
v želodčnih celic podrobno.

V sedanji raziskavi smo pokazali, da je ARID1A
izražena je bila tako na spodnjem mRNA in proteinov ravni v želodcu rakavih tkivih kot ustreza ne-rakavo sluznico. V dogovoru s temi molekularnih bioloških ugotovitev, immunohisto- kemija z protitelesa anti-ARID1A pokazala, da je ARID1A
je popolnoma utišan pri 115 od 224 bolnikov želodca vzorcih raka, s pozitivnim izražanja v drugi 109 bolnikov. Naša pripomba je v dogovoru z vrsto študij razkrivanju, ki je ARID1A
izraz pogosto izgubi ali zmanjša število rakavih tkiv in celičnih linij, kot so rak dojke, materničnega endometrioid karcinoma jajčnikov jasno celice in endometrioid karcinoma [13,18,20 in 21].

Do sedaj so vzroki ARID1A
utišanje niso bili v celoti pojasnjeni. Obstoječe raziskave se osredotočajo na mutacije v ARID1A
, zlasti v ginekoloških rakov. To je poročal, da je bil nesmisel ali Indel mutacija ARID1A
povezana z izgubo ali zmanjšanje izražanja proteinov v maternici endometrioid karcinoma jajčnikov endometrioid karcinoma in jasno karcinomom [11] - [13], [18]. V integrirani genomske preiskave, Mamo et al
. le našel eno skrajšano mutacijo ARID1A
in T47D dojke, rak celične linije, brez mutacije v vzorcih rakavih 11 na dojki, ki so pokazali DNK kopiranja izgubo številko na 1p36.11 lokusu, ki mejijo na ARID1A
[22]. Osem od devetih vzorcev z DNA kopijo izgubo številko na 1p36.11 imajo tudi nizko izražanje ARID1A beljakovin, kar kaže na skladnost med DNA kopijo izgubo številko in ARID1A
deaktivacijo. V študiji exome zaporedja Wang et al.
, Je bilo skupno 46 mutacij pri 32 od 109 (29%) vzorcev z rakom želodca, pri 39 (85%) okrnjenih mutacij [19]. Štiriindvajset (75%) od 32 želodca vzorcev raka s ARID1A
mutacije kažejo bodisi izgubo ali bistveno zmanjšano izražanje proteinov v primerjavi s tistimi brez ARID1A
mutacije. V nasprotju s tem je le 6 želodca vzorci z rakom, ki kažejo odsoten ali šibko beljakovin izraz v odsotnosti zaznavnega ARID1A
mutacijo, kar kaže, da lahko drugi mehanizmi prispevajo k ARID1A
deaktivacijo. V zadnjem času, še ena exome zaporedja raziskave, ki jih Zang et al
. je pokazala tudi, ARID1A
mutacije 8% želodčnih vzorcev, od katerih so bili izgubljeni ali zmanjšane ekspresije proteinov [23] 75%. Bolj zanimivo, oba študije so pokazale višje ARID1A
spremembe v vzorcih želodca z rakom, pri mikrosatelitnih nestabilnost (MSI) kot tisti s stabilnostjo mikrosatelitnih (MSS). Poleg tega je mutacija spekter ARID1A
se razlikuje med dvema genetskih vrst raka želodca, pri večini indels v vrsti MSI in več različic enim neucliotide v vrsti MSS. MSI je opredeljena kot INDEL mutacij v nukleotidnih ponovitev (znan kot mikrosatelitskih regije) posledica DNA neusklajenosti genskih popravljanje napak podvojevanje inaktivacije povzroča [24]. Predlagana kot začetnih genomskih dogodkov raka želodca, MSI pogosto vodi do kopičenja dodatnih povezane z rakom genetske nestabilnosti, kot so alelne izgube in premikom bralnega okvirja v genov, ki sodelujejo pri regulaciji celične proliferacije, apoptoza in popravilo DNA. Ugotovljeno je bilo, da se pojavi MSI v 25% do 50% sporadične raka želodca, ki opredeljuje edinstven genetski tip bolezni z različnimi clinicopathological značilnosti [24]. V študiji Wang et al.
, Stopnja Indel mutacije (78%) ARID1A
pri raku MSI želodca je primerljiv s TGFBR2
in MSI debelega črevesa rak, dobro uveljavljen in funkcionalno potrjeni voznik gene, ki jih MSI [25] inaktiviran. Ti podatki kažejo, da mutacija ARID1A
skupaj z MSI lahko igrajo pomembno vlogo pri želodca rakotvornost. Zato je razmerje med stanjem ARID1A
spremembe in MSI pri raku želodca, kot tudi njene clinicopathological pomena, je potrebno nadaljnje preiskave v prihodnje raziskave.

V študiji Wang et al.
, izraz ARID1A
je bila odkrita šele v majhni velikosti vzorca (32 primerov), in ker ni bilo nadaljnje raziskovanje njenega kliničnega pomena [19]. Tukaj, v večjem želodca prebivalstva raka (224 primerov), smo ugotovili, da je izguba ARID1A
izražanje je bistveno povezana z višjo stopnjo T raka želodca, kar pomeni, da odsotnost ARID1A
izraz lahko spodbudijo rast tumorjev in invazijo. Poleg tega smo ugotovili nižjo ARID1A radioinkorporacijo v slabo diferenciranih želodčnih rakavih tkivih kot v dobro diferenciranih, tiste, ki kažejo, da je zmanjšala ARID1A
izraz lahko igrajo pomembno vlogo pri tumorski de-diferenciacije. V skladu z našimi ugotovitvami, drugi preiskovalci tudi ugotovila, da je zmanjšala ARID1A
izraz je precej povezano z višjo stopnjo raka dojke [22], pa tudi višjo stopnjo FIGO v jajčnikih jasno karcinomom [21]. ARID1A pospešuje nastanek BRG1 ali BRM-vsebovale SWI /SNF kromatin remodeling kompleksov, ki so bistveni za normalno ustavitev celičnega cikla [9], [26].

Analiza preživetja po Kaplan-Meier je pokazala pomembno povezanost med izguba ARID1A
izražanja in slabše klinični izid bolnikov z rakom želodca po radikalni operaciji. Cox razmerje ogroženosti regresija analize nadalje pokazala, da je je ARID1A
nivo izražanja neodvisen dejavnik tveganja za preživetje, kar pomeni, da lahko služi kot dragocen prognostičnih biomarkerja za bolnike z rakom želodca po operaciji in potencialne tarče za gensko terapijo v zdravljenje raka želodca. V jajčnikov jasno karcinomom, so poročali tudi, da so imeli bolniki s pozitivnim ARID1A
izražanja daljše preživetje brez napredovanja bolezni, kot tiste, ki imajo negativen ARID1A
izraz [21]. Poleg tega je izguba ARID1A
izražanja bistveno povezana z chemoresistance v jajčnikih jasno karcinom, ki je povezana tudi s slabo prognozo raka. Ti podatki kažejo, da je ARID1A
izražanja in mutacija pregled lahko bilo koristno za vodenje kliničnega upravljanja. Skupaj, naše ugotovitve, da je izguba ARID1A
izražanje pri raku želodca je povezana z več malignih fenotipov in slabša napoved pomeni, da lahko igrajo vlogo tumor dušenje v želodcu rakotvornost.

nadalje raziskovali funkcionalno vlogo ARID1A
v celičnih linijah želodca. Obnavljanje ARID1A
izraz v želodčnih rakavih celic močno zaviral proliferacijo celic in nastanek kolonij. Utišati izražanje ARID1A
in epitelijskih celic želodca znatno povečala stopnjo rasti celic. Ti rezultati so navedeni ki ARID1A
lahko igrajo uvozno vlogo pri zaviranju rasti tumorskih celic. V zadnjem času, funkcionalne teste ARID1A
v želodcu rakavih celic linij s Zang et al
. Predlaga se, da ARID1A
produkcije tumor-dušenje dejavnost [23]. Guan et al
. je pokazala, da ARID1A
je obnovitev izraz divjega tipa zadostuje za zaviranje širjenja in tumorigenecity za presadkov z človekovih jajčnikov rakave celične linije zatočišča ARID1A
mutacije, medtem ko RNA interference posredovano ARID1A
utišanje izboljšuje celično proliferacijo in tumorjev v dveh človeških ovarijskih epitelnih celičnih linij, ki niso spremenili, IOSE-80PC in OSE4 [27]. Ti podatki, skupaj z našim, kažejo, da izguba ARID1A
lahko igrajo pomembno vlogo v procesu rakotvornosti.

Na koncu smo prikazali izgubo ARID1A
izraz raka želodca in korelacija z bolj maligni fenotip in slabšo prognozo v številnih kliničnih vzorcev. Poleg tega smo dokazali, da je ARID1A
lahko zavira rast tumorskih celic in nastanek kolonij in vitro. Kolikor nam je znano, so podatki, pridobljeni v trenutni raziskavi predstavljajo prvo poročilo korelacijo prisotnost ARID1A
z clinicopathological značilnosti in skupno preživetje bolnikov z rakom želodca. Skupaj z rezultati Wang et al.
In Zang et al
. [19] [23], smo dodatno potrdili, da ARID1A
lahko služi kot supresorski kandidat tumorja in prognostičnega biomarker v želodcu rakotvornost.

Izjava Etika materiali in metodami

raziskava je odobril Odbor za etiko Sun Yat-sen University Cancer Center, in pisno privolitev je bila pridobljena iz vsakega, ki sodeluje pri raziskavi bolniku.

Mobilni Lines in pogoji Kultura

na želodčni rak celične linije, SGC7901, AGS, MGC803 in želodca epitelijskih sluznica celična linija GES1 smo pridobili iz odbora Type Culture Collection kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). Celične linije smo kultivirali v RPMI 1640 medija dobavljene z 10% toplotno-neaktivna fetalni goveji serum (FBS). Celice smo inkubirali pri 37 ° C v navlaženi komori, ki vsebuje 5% CO _2.

Human Tissue Vzorec s

Skupno 66 seznanjene rakavi in ujema sosednji noncancerous želodčne sluznice tkiva so bili zbrani pri bolnikih želodca z rakom, ki želodca pri Sun Yat-sen University Cancer Center med letoma 2009 in 2011, in diagnoza je bila potrjena s patološkim pregledom. 25 v paru rakavi in ​​ustrezne sosednje noncancerous želodčne sluznice tkiv, ki se uporabljajo za odkrivanje izražanja v ARID1A beljakovin v zahodni blot so bili izbrani iz 66 parih vzorcev. Po kirurški odstranitvi smo sveže tkiva takoj potopljeni v RNAlater (Ambion, Inc., ZDA), da bi se izognili degradaciji RNA, shranjena pri 4 ° C preko noči, da se omogoči temeljito prodiranje RNAlater v tkivo in zamrznemo pri -80 ° C, dokler RNA in ekstrakcija protein smo izvedli. Še 224-parafin vgrajeni osnovni želodčni karcinom vzorci, ki so bili zbrani med letoma 2003 in 2005, so bili pridobljeni iz Sun Yat-sen University Cancer Center. Nobeden od teh bolnikov je prejela radioterapijo ali kemoterapijo pred operacijo. nadaljnji podatki bolnikov želodca raka v tej študiji so na voljo in popolna. Pooperativno spremljanje pojavili na naši ambulanti in so vključeni klinične in laboratorijske preiskave vsake 3 mesece za prvi 2 leti, vsakih 6 mesecev v obdobju od tretjega do petega leta, leto za dodatnih 5 let ali do smrti bolnika, kar je prej. Histopatološke vrsta in stopnja raka želodca so bili določeni v skladu z merili iz klasifikacije Svetovne zdravstvene organizacije in v fazi TNM določen Unije za mednarodni nadzor raka.

Pridobivanje Total RNA in v realnem času Kvantitativni PCR

Total RNA je bila vzeta s pomočjo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, California, ZDA) po protokolu proizvajalca. Skupna koncentracija RNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm z uporabo NANO DROP spektrofotometra a (ND-1000, Thermo Scientific, ZDA). Reverzna transkripcija (RT) za sintezo prve pramen cDNA smo izvedli z 2 ug celotne RNA obdelamo z M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, ZDA) v skladu s priporočili proizvajalca. Nastalo cDNK smo nato podvržemo realnem času kvantitativno PCR za ovrednotenje vsebnosti relativno mRNA ARID1A
in GAPDH
(gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaze, kot notranje kontrole) s po začetnih oligonukleotidov: ARID1A
naprej: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ", in obratno: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3 '; GAPDH
naprej: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ", in obratno: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3". Gene-specifično pomnoževanje smo izvedli z uporabo ABI 7900HT realnem času PCR sistem (Life Technologies, Carlsbad, California, ZDA) z 15 ul PCR mešanico, ki vsebuje 0,5 xl cDNA, 7,5 xl 2 x SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad , Kalifornija, ZDA) in 200 nM ustreznih oligonukleotidnih primerjev. Mešanica je bila ogreta na 95 ° C (10 min) in nato pomnožili pri 95 ° C (30 sek) in 60 ° C (1 minuto), za 45 ciklov. Krivulja resolucija smo izmerili pri 95 ° C 15 sekund, pri 60 ° C za 15 sekund in 95 ° C za 15 sekund. Vrednost Ct (prag cikel) vsakega vzorca je bila izračunana iz ciklov praga s programsko opremo instrumenta (SRS 2.3), in relativno izražanje ARID1A
mRNA je normalizirana na GAPDH
vrednosti . Podatki so bili analizirani s pomočjo primerjalne mejno cikel (2 ^{-ΔCT) metodo.}

Western blot analiza

homogenizirana želodca vzorcev raka, vključno s tumorjem in nontumor tkiv, kot tudi celičnih linij smo lizirali v RIPA liznega pufra, in lizate požanjemo s centrifugiranjem (12.000 rpm) pri 4 ° C 30 minut. Približno 50 mikrogramov proteinske vzorcev nato ločimo z elektroforezo na 12% natrijev dodecil sulfat poliakrilamidnem gelu in prenese na poliviniliden fluorida membrano. Po blokiranje non-specifična vezavna mesta za 60 min s 5% nemastnega mleka, smo membrane inkubirali preko noči pri 4 ° C z mišjega monoklonskega protitelesa proti ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, ZDA, pri razredčenju 1:1000) . Membrane smo nato trikrat sprali s TBST (-tris pufrom s Tween-20) za 10 minut in zaznati s hrenovo peroksidazo (HRP) označenih s kunčjega anti-miš IgG protitelesi (Imunologija svetovanje Laboratory, ZDA, na 1: 2000 razredčitev) pri 37 ° C 1 uro. Po treh pranjih, smo membrane razvili izboljšano kemiluminiscentnim sistema (Cell signalizacijo tehnologijo, Danvers, Massachusetts, ZDA). Intenzivnost skupina je bila merjena z denzitometrijo uporabo programske opreme Količina One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, ZDA). Ravni beljakovin so normalizirane tistemu GAPDH ugotavljamo z miško anti-človeški GAPDH monoklonsko protitelo (Shanghai Kangchen, Kitajska, pri redčenju 1:10000).

Imunohistokemija Analiza

odseki tkiva so bili deparaffinized z dimetilbenzen in hidracijo preko 100%, 95%, 90%, 80% in 70% etanola. Po treh izpiranjih v PBS (-fosfatnim pufrom), so drsi v vreli antigensko arhiviranje pufru, ki vsebuje 0,01 M natrijev citrat, klorovodikovo kislino (pH = 6,0) za 15 minut v mikrovalovni pečici. Po spiranju s PBS, so odseki tkiva inkubiramo s primarnim protitelesom in drsi nato splaknemo v 3% raztopini peroksidaza gašenja (Invitrogen), da blokira endogenega peroksidazo. Odseki smo nato inkubirali z mišjega monoklonskega protitelesa proti ARID1A (Abgent primarno protitelo Company, ZDA, pri 1:300 redčenju) pri 4 ° C preko noči in nato inkubiramo s hrenovo peroksidazo (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) pri sobni temperatura za 30 minut. Po spiranju v PBS, je vizualizacija signala razviti s 3 raztopino 3'-diaminobenzidine (DAB) in vse diapozitive smo jih nasprotno s hematoksilinom. Kot negativne kontrole so sosednji odseki obdelujejo kot je opisano zgoraj, razen da so inkubirali preko noči pri 4 ° C v blokirni raztopini brez primarnega protitelesa.

Skupna ARID1A imunskim barvanjem rezultat je bil izračunan kot vsota odstotkov pozitivno obarvajo tumorske celice in intenzivnost obarvanja. Na kratko, je odstotek pozitivnega obarvanja dosegel vrednost 0 (0-9% negativno), 1 (10% -25%, sporadično), 2 (26% -50%, goriščna) ali 3 (51% -100% difuzna) in jakost 0 (ni obarvanja), 1 (šibko obarvanje), 2 (zmerna obarvanja) in 3 (temni madeži). Skupna ocena imunskim barvanjem je bila izračunana z vrednostjo rezultata odstotkov pozitivnosti × rezultat intenzivnost obarvanja, ki so znašale od 0 do 9. Stopnja izraz ARID1A je opredeljen na naslednji način: "-" (negativna, rezultat 0), "+" (šibko pozitiven rezultat 1-3), "++" (pozitivno, ocena 4-6), "+++" (zelo pozitivno, ocena 7-9). Ki temelji na vrednostih ARID1A izražanja, so se bolniki z rakom želodca razdelimo v dve skupini:. Negativna ARID1A izraz skupina (ARID1A-) in pozitivni ARID1A izraz skupina (ARID1A +, ARID1A ++ ali ARID1A +++)

Izražanje plazmida in prehodne Transfekcije

evkariontska plazmidov pCMV6-Entry, ki vsebuje polno dolžino človeškega ARID1A
cDNA smo dobili od Asbio Technology Company (Guangzhou, Kitajska). Prazen vektor smo uporabili kot negativno kontrolo. MGC803 celice smo gojili v 6 vdolbinami, dokler ne doseže 85-90% strnjene, nato pa smo prehodno transfekcije izvedemo z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Oseminštirideset ur po transfekciji smo izražanje genov pregledal zahodni blot analizo. In potem je bilo opravljenih proliferacija celic in nastanek kolonij.

RNA oligonukleotide in celic Transfekcije

Za rasklapanje za ARID1A
izraz se siRNAs smo sintetizirali GenePharma Company (Shanghai, Kitajska). V siRNA sekvence so bili naslednji: siRNA- ARID1A
, občutek: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 "antisens: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3". Negativna kontrola (NC), občutek: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 "antisens: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3". 400 pmol siRNA- ARID1A
ali NC transfektirali v 2 x 10 ^{5 GES1 celice, ki uporabljajo Lipofectamine RNAi MAX reagenta (Invitrogen, ZDA) po protokolu proizvajalca. Po tem je bila celična proliferacija nato izvedli.}

Proliferation Vsebnost

rast celic iz MGC803 ali GES1 celic smo jih zaznali MTS testa celične proliferacije. Celice smo zasejali v 96 vdolbinicami z gostoto 5 x 10 ^{2 celic na vdolbino. Stopnja rasti Celica je bila odkrita s pomočjo proliferacije celic MTS komplet po navodilih proizvajalca (Promega, ZDA). Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}

Colony Formation Vsebnost

Pri preizkusu tvorbe kolonij, ARID1A
-izražanje MGC803 celice ali nadzor MGC803 celice zasadimo v 6-dobro plošča pri gostoti 5 x 10 ^{2 celic na vdolbino. Po 10 dneh kulture, preživelih kolonij (> 50 celic na kolonije) preštejemo s kristal vijoličnim (0,5%) obarvanje. Kolonije tvori izkoristek (CFE%) je definirana kot razmerje med številom kolonij nastalih v kulturi na število celic inokuliranih. Poskus smo izvedli v treh izvodih.}

Statistična analiza

Razlike v mRNA in proteina izraz med vzorci tumorjev in seznanjenih sosednjih vzorcev tkiva ni tumorskih so bili ocenjeni z paru-vzorce, t-test. 2. Preskus χ ^{je bila uporabljena za analizo razmerja med ARID1A izražanja in različnih clinicopathological parametrov. Krivulji preživetja smo izračunali po metodi Kaplan-Meier, in v primerjavi s testom log-ranga. Cox sorazmerna nevarnosti regresijski model smo uporabili univariatne in multivariatne analize, naj preuči učinke clinicopathological spremenljivk in ARID1A izražanja na preživetje. t
preizkus dvorepe Neparni študenta je bila uporabljena za oceno razlike v stopnji celične rasti in tvorbe kolonij. Statistične analize so bile izvedene s statističnim paketom za družbene vede, verzija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA), in dvostranski P
vrednost manjša od 0,05, je veljala za statistično pomembna.}

• Plos ONE: različni trendi v nedavni-Prebivalstvo Na preživetje tečajev v požiralnika in želodca raka
• Plos ONE: Identifikacija HSA-pokoj-335 kot prognostičnih Podpis želodčnega raka