PLoS ONE: уменьшение экспрессии гена ARID1A ассоциируется с плохим прогнозом в первичном Желудочный Cancer

Абстрактный

Фон
<р> ARID1A
ген кодирует аденин-тимин (AT ) -богатой интерактивный домен-содержащий белок 1А, который участвует в хроматина. ARID1A
было показано, чтобы функционировать в качестве супрессора опухоли в различных типах рака. В текущем исследовании, мы исследовали экспрессию и прогноз значение ARID1A
в первичном раке желудка. В то же время, биологическая роль ARID1A
дополнительно исследовали с использованием модели клеток в пробирке.

Методология /Основные выводы
<р> Для того, чтобы исследовать роль ARID1A
гена в первичной желудочной патогенезе рака, в режиме реального времени количественный ПЦР и вестерн-блоттинга были использованы для изучения ARID1A
выражение в спаренных раковых и нераковых тканей. Результаты показали, уменьшились ARID1A
мРНК ( P
= 0,0029) и белка ( P
= 0,0015) выражение в большинстве несущих опухоль тканей по сравнению с согласованной смежной неопухолевой тканей, и в желудочном линиях раковых клеток. Для дальнейшего изучения и клинико-прогностические роли ARID1A
выражения, мы провели иммуногистохимический анализ блоков ткани рака желудка 224 залитых парафином. Данные показали, что потеря ARID1A
выражение значимо коррелировали с Т стадии ( P
= 0,001) и степени ( P
= 0,006). В соответствии с этими результатами, мы обнаружили, что потеря ARID1A
выражение было достоверно коррелирует с плохой выживаемостью в рака желудка пациентов ( P
= 0.003). Кокс регрессионный анализ показал, что ARID1A
выражение было независимым предиктором общей выживаемости ( P
= 0,029). Кроме того, функции ARID1A
в пролиферации и колонии формирования желудка клеточных линий анализировали с помощью трансфекции клеток с полноразмерным ARID1A
выражение вектор или миРНК ориентации ARID1A
, Восстановление ARID1A
экспрессия в клетках рака желудка значительно ингибирует пролиферацию клеток и образование колоний. Глушащий ARID1A
выражение в желудочном линии эпителиальных клеток значительно повышена скорость роста клеток.

Выводы /Значение
<р> Наши данные свидетельствуют о том, что ARID1A
может играть важную роль при раке желудка и может служить в качестве ценного прогностического маркера и потенциальной мишенью для генной терапии в лечении рака желудка
<р> Образец цитирования:. Ван Dd, Чэнь Yb, Пан K, Ван W, Чэнь Sp, Чэнь Jg , и другие. (2012) Снижение экспрессии ARID1A
ген ассоциируется с плохим прогнозом в первичном рака желудка. PLoS ONE 7 (7): e40364. DOI: 10.1371 /journal.pone.0040364
<р> Редактор: Патрик Тан, Duke-Национальный университет Сингапура Высшей медицинской школы, Сингапур
<р> Поступило: 19 января 2012 года; Принято: 6 июня 2012 года; Опубликовано: 13 Июля, 2012
<р> Copyright: © 2012 Dandan и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (30973398) и Гуандун фонд естественных наук (925100890). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенным злокачественным во всем мире и второй наиболее распространенной причиной смерти от рака, связанных с каждым годом (10,4% смертей от рака) [1]. Лечение рака желудка включает комбинацию хирургии, химиотерапии или лучевой терапии. Тем не менее, почти 60% пациентов, пострадавших поддаться рака желудка даже после того, как только лечебной резекции или после адъювантной терапии [2]. Давно известно, что желудочных результаты рака от комбинации факторов окружающей среды и накопления обобщенных и специфических генетических изменений. Многие из генетических или эпигенетических изменений, связанных с раком желудка, включая потерю гетерозиготности, микросателлитных и хромосомной нестабильности и гиперметилированием, сообщалось [3]. Понимание этих изменений и молекулярные механизмы, участвующие в желудочном канцерогенезе будет иметь решающее значение для улучшения диагностики, терапии и прогнозирования прогноз этого заболевания.
<Р> eukaryotically законсервированы SWI /SNF хроматин-переделанный комплекс играет существенную роль в различных клеточных процессов, в том числе дифференцировки, пролиферации и репарации ДНК [4]. Потеря SWI /SNF субъединиц было сообщено в большинстве опухолей, а также большое количество экспериментальных наблюдений был сделан вывод, что этот комплекс имеет решающее значение для подавления опухоли [5]. Комплексы содержат семь или более некаталитического субъединиц, которые предположительно помогают модулировать адресно и активность АТФазы [6]. Одна субъединица этого комплекса, hSNF5 /Ini1 /BAF47, был идентифицирован как подавитель опухоли [7], [8]. Другой некаталитический субъединица, P270 /ARID1A /BAF250a (аденин-тимин АТ-богатые интерактивный домен-содержащий белок 1А), было продемонстрировано, что необходимо для нормального остановки клеточного цикла [9]. Нокдаун ARID1A
в лейкозных клеток линии устойчивость к Fas-опосредованного апоптоза [10].
<Р> В последнее время, ARID1A
мутации и потери белка BAF250a Было обнаружено, что сильно коррелируют с раком яичников четко клеток и матки низкосортного эндометриоидной карциномы [11] - [13]. Эти наблюдения указывают на то, что ARID1A
является потенциальным кандидатом ген-супрессор опухолей. Тем не менее, клиническое значение такого дифференциального выражения и функции белка ARID1A остаются неопределенными из-за отсутствия исследований с использованием свежих образцов опухолей человека. В настоящем исследовании мы проанализировали ARID1A
уровень экспрессии при раке желудка с использованием в режиме реального времени количественный RT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. В то же время, мы определили связь между ARID1A
выражения и клинико-патологическими особенностями и оценивали ее прогностическое значение в Пострезекционные выживаемости больных раком желудка. Кроме того, мы оценивали функциональную роль ARID1A
в онкогенеза первичного рака желудка путем изучения пролиферации и колоний образование в пробирке в желудочном клеточных линиях.

Результаты

ARID1A
экспрессия мРНК проанализирован с помощью в режиме реального времени количественного RT-PCR

уровень мРНК ARID1A
определялась в реальном времени количественного анализа RT-PCR в 66 парных и злокачественными совпавшие соседние нормальные ткани желудка слизистой оболочки. ARID1A
уровень экспрессии был значительно ниже в 43 (65,15%), несущих опухоль тканей по сравнению с окружающими тканями неопухолевыми ( P
= 0,0029, рисунок 1).

ARID1A Экспрессия белка анализировали с помощью Вестерн-блоттинга
<р> Вестерн-блоттинг проводили на 25-желудочных образцов рака и соответствующими смежными нераковых желудочные ткани слизистую оболочку от 66 парных выборок. Результаты показали ARID1A полосу при ожидаемым размером 242 кДа, и количество присутствующего протеина ARID1A дополнительно измеренным с помощью денситометрии. В соответствии с количественными в режиме реального времени результатов ПЦР, снижение экспрессии ARID1A наблюдалось у 13 (52%) из желудка тканей опухоли по сравнению с окружающими тканями совпавших неопухолевых ( P
= 0,0015, рис 2А и Рисунок 2B). Кроме того, экспрессия ARID1A белка заметно уменьшилось в желудочном линиях раковых клеток, SGC7901, AGS, особенно в MGC803, по сравнению с нормальной желудочной клеточной линии GES1 (рис 2С).

Иммуногистохимическое Анализ ARID1A экспрессии в ткани рака желудка Образцы и его взаимоотношения с клинико-патологическими Parameters

Для дальнейшего изучения и клинико-прогностические роли выражения ARID1A, мы провели анализ иммуногистохимического блоков ткани рака желудка 224 залитых парафином. В целом, 115 из 224 (51,3%) случаях показали отрицательную экспрессию ARID1A в раковых тканях (рис 3B), а 109 (48,7%) больных показали положительную иммуноокрашивания (3в &Amp; D). Нормальная слизистая оболочка желудка показала сильный ARID1A положительное окрашивание (рис 3А). Корреляции между экспрессией ARID1A и различных клинико-патологических параметров приведены в таблице 1. Данные показывают, что потеря экспрессии ARID1A была достоверно коррелирует с глубиной опухолевой инфильтрации (T стадии, P
= 0,001) и опухоли оценка ( P
= 0,006), но не с возрастом, полом, размер опухоли, отдаленных метастазов (М стадия), а также опухоли локуса или метастазов местного лимфатических узлов (N этап).

Выражение из ARID1A и клинического результата
<р> 5-летняя общая выживаемость у пациентов с положительным и отрицательным выражением ARID1A были 68,8% и 52,2%, соответственно. Общая выживаемость пациентов с отрицательным выражением ARID1A была значительно хуже, чем у ARID1A-положительных пациентов ( P
= 0,003, лог-ранговый тест, Рисунок 4). Одномерный Cox регрессионный анализ показал, что глубина опухоли инфильтрации, метастаз локального лимфатических узлов, отдаленных метастазов, размер опухоли и экспрессии ARID1A были значимо связаны с общей выживаемости (таблица 2). Кроме того, многофакторный регрессионный анализ Кокса подтвердил глубину опухолевой инфильтрации, метастаз локального лимфатических узлов, отдаленных метастазов и экспрессии ARID1A в качестве независимых предикторов общей выживаемости больных раком желудка (таблица 2).

Роль ARID1A
в пролиферации клеток и колонии формирования в MGC803 и GES1 клеточных линий
<р> Для того, чтобы оценить эффекты ARID1A
на пролиферацию клеток, то ARID1A
выражение вектор и вектор управления были соответственно трансфицировали в MGC803 клетки. ARID1A
экспрессии в трансфицированных клетках были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга (фиг.5А). Анализ роста клеток показали, что скорость роста клеток <ЕМ> ARID1A
-transfected Клетки рака желудка, были значительно ниже, чем контрольные вектор трансфицируют клеток рака желудка (рис 5в). В то же время, эффективность образования колоний значительно ( P
= 0,0379) ингибируется в ARID1A
-transfected Клетки рака желудка по сравнению с контрольными векторными-трансфецировали клеток рака желудка (рис 5D). Для дальнейшего подтверждения функцию подавления пролиферации на ARID1A
, мы замолчать ARID1A
выражение в клеточной линии GES1 с миРНК. ARID1A
выражение в трансфицированных клетках были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга (фиг.5В). Мы обнаружили, что глушение выражение ARID1A
в GES1 значительно улучшена пролиферации клеток по сравнению с притворным обработкой миРНК (Рисунок 5E).

Обсуждение
<р> Несмотря на большие успехи в диагностике и терапия, рак желудка остается одним из самых смертоносных новообразованиями, с плохим прогнозом после радикальной гастрэктомии [14], [15]. Клинический исход рака желудка определяется рядом характеристик опухоли, такие как рост локорегионального опухоли и инвазии, степени дифференцировки, ангиогенез, отдаленными метастазами и прогрессии клеточного цикла, которые регулируются с помощью различных родственных генов, в том числе онкогенов и опухолевых супрессоров генов. Таким образом, выявление рака желудка специфических биомаркеров, участвующих в этих процедурах очень важно для диагностики, терапии и прогнозирования прогноза в клинике.

ARID1A
, недавно выявленный ген-супрессор опухоли, который кодирует элемент комплекса SWI /SNF, имеет высокую частоту мутаций при раке мочевого пузыря, матки эндометриоидной карциномы, эндометриоидного яичников и ясно-клеточной карциномы [11] - [13], [16], [17]. В яичников ясной клеточной карциномы, сообщается, что ARID1A
мутации в значительной степени связано с ARID1A иммунореактивности [18]. В последнее время секвенирование экзома исследование показало, что ARID1A
также часто мутирует при раке желудка [19], [23]. Тем не менее, до сих пор выражение, клиническое значение и биологические функции ARID1A
при раке желудка не были изучены. Таким образом, мы оценивали выражение ARID1A
при раке желудка с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии, в дополнение к его клинико-патологическими и прогностическое значение в большом человеческом образце. Кроме того, использование в лабораторных условиях клеточной модели, мы также исследовали подавителя опухоли роль ARID1A
в клетках желудка подробно.
<Р> В настоящем исследовании мы показали, что ARID1A
было выражено как при более низкой мРНК и белка уровень в желудочном раковых тканей, чем соответствующие незлокачественный слизистую оболочку. В соответствии с этими выводами молекулярно-биологических, иммуногистохимического химия с анти-ARID1A антител показало, что ARID1A
был полностью подавлен в 115 из 224 пациентов с раком желудка образцов, с положительным выражением в еще 109 пациентов. Наше наблюдение согласуется с серией исследований выявления, что ARID1A
выражение часто теряется или уменьшается в ряде раковых тканей и клеточных линий, таких как рак молочной железы, матки эндометриоидной карциномы яичников, ясном клетки и эндометриоидной карциномы [13,18,20 и 21].
<р> на сегодняшний день причины ARID1A
глушителей не были полностью выяснены. Существующие исследования сосредоточены на мутации в ARID1A
, особенно в гинекологических раковых заболеваний. Сообщается, что нонсенс или INDEL мутация ARID1A
коррелировало с потерей или снижением экспрессии белка в маточных эндометриоидной карциномы яичников, эндометриоидной карциномы и ясно-клеточной карциномы [11] - [13], [18]. В комплексной геномных исследований, Мамо и др
. можно найти только одну секущую мутацию ARID1A
в линии клеток рака молочной железы T47D, без каких-либо мутаций в образцах 11 раком молочной железы, которые показали копию ДНК потери номера в 1p36.11 локуса, примыкающей к ARID1A <бр> [22]. Восемь из девяти образцов с копией ДНК потери номера в 1p36.11 также имеют низкую экспрессию ARID1A белка, что указывает на соответствие между копией ДНК потери числа и ARID1A
инактивация. В исследовании секвенирование экзома Ван и др
., В общей сложности 46 мутаций было обнаружено в 32 из 109 (29%) образцов желудочного рака, с 39 (85%) усеченных мутаций [19]. Двадцать четыре (75%) из 32 образцов желудочного рака с ARID1A
мутации показывают либо потерю или существенно уменьшенную экспрессию белка по сравнению с пациентами без ARID1A
мутации. В отличие от этого, есть только 6 желудка образцы рака, показывающие отсутствуют или слабы экспрессии белка в отсутствие выявляемой ARID1A
мутации, которая предполагает, что другие механизмы могут внести свой вклад в ARID1A
инактивация. Недавно другой секвенирование экзома исследование Занг и др
. также показал ARID1A
мутации в 8% образцов желудочного, из которых 75% утерянных или снижала экспрессию белка [23]. Более интересно, оба исследования показали выше ARID1A
изменения в образцах рака желудка с нестабильностью микросателлитных (MSI), чем те, с устойчивостью микросателлитных (MSS). Кроме того, мутация спектр ARID1A
отличается между двумя генетическими типами рака желудка, при этом большинство вставкам в типе MSI и более вариаций одного neucliotide в типе MSS. MSI определяется как INDEL мутации в нуклеотидных повторов (известный как микросателлитных областей) в результате несоответствия ДНК ошибок генов ремонт инактивация-индуцированной репликации [24]. Предложено в качестве инициирующих геномных событий рака желудка, MSI часто приводит к накоплению дополнительных связанных с раком генетических неустойчивостей, таких как аллельные потери и мутации в сдвигом рамки генов, участвующих в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза и репарации ДНК. Сообщалось, что компания MSI имеет место в 25% до 50% от спорадического рака желудка, определение уникального генетического заболевания типа с различными клинико-патологическими особенностями [24]. В исследовании Wang и др
., Частота мутаций INDEL (78%) ARID1A
в категории MSI рака желудка сравнима с TGFBR2
в категории MSI толстого кишечника рак, хорошо налаженные и функционально подтверждено ген драйвер MSI инактивируется [25]. Эти данные указывают на то, что мутация ARID1A
вместе с MSI может играть важную роль в желудочном канцерогенезе. Таким образом, отношения между ARID1A
изменений и MSI статуса при раке желудка, а также его значимость, клинико-патологическими требует дальнейшего изучения в дальнейших исследованиях.
<Р> В исследовании Wang и др и др.
, выражение ARID1A
была обнаружена только в образце малого размера (32 случая), и не было дальнейшее изучение его клиническое значение [19]. Здесь, в большом желудочной популяции рака (224 случаев), мы обнаружили, что потеря ARID1A
выражение было достоверно коррелирует с более высокой Т стадии рака желудка, подразумевая, что отсутствие ARID1A
выражение может способствовать росту опухоли и инвазии. Кроме того, мы обнаружили более низкую ARID1A иммунореактивности в плохо дифференцированной желудка раковых тканей, чем в хорошо дифференцированных из них, предполагая, что снижение ARID1A
выражение может играть определенную роль в опухолевой де-дифференциации. В соответствии с нашими данными, другие исследователи также обнаружили, что снижение ARID1A
выражение в значительной степени связано с более высокой степени рака молочной железы [22], а также более высокую ступень FIGO яичников ясной клеточной карциномы [21]. ARID1A способствует образованию BRG1 или BRM-SWI содержала /SNF ремоделирования хроматина комплексов, которые имеют важное значение для нормального остановки клеточного цикла [9], [26].
<Р> Анализ выживаемости Каплана-Мейера показал существенную корреляцию между потеря ARID1A
выражения и хуже клинические исходы у больных раком желудка после радикальной операции. Кокс отношение рисков регрессионный анализ далее показал, что ARID1A
уровень экспрессии был независимым фактором риска для выживания, предполагая, что она может служить ценным прогностическим биомаркером для больных раком желудка после операции и потенциальной мишенью для генной терапии лечение рака желудка. В яичников ясной клеточной карциномы, также сообщалось, что у пациентов с положительными ARID1A
выражение было больше выживаемость без прогрессирования заболевания, чем те, с отрицательными ARID1A
выражение [21]. Кроме того, потеря ARID1A
выражение достоверно коррелирует с химиорезистентности яичников ясном клеточного рака, который также связан с плохим прогнозом рака. Эти данные свидетельствуют о том, что ARID1A
выражение и мутации исследование может быть полезным для руководящих клинического лечения. Взятые вместе, наши наблюдения, что потеря ARID1A
выражение рака желудка связано с более злокачественными фенотипами и худший прогноз означает, что он может играть определенную роль подавителя опухоли в желудочном канцерогенезе.
<Р> Мы дополнительно исследовали функциональную роль ARID1A
в желудочном клеточных линиях. Восстановление ARID1A
экспрессия в клетках рака желудка значительно ингибирует пролиферацию клеток и образование колоний. Глушащий выражение ARID1A
в эпителиальных клеток желудка значительно повышало скорость роста клеток. Эти результаты показывают, что ARID1A
может играть роль импорта в подавлении роста опухолевых клеток. В последнее время функциональные анализы ARID1A
в желудочном линиях раковых клеток с помощью Занг и др
. предположил, что ARID1A
оказывают опухоль-супрессора [23]. Гуань и др
. Показано, что восстановление экспрессии дикого типа ARID1A
достаточно, чтобы подавить пролиферацию и tumorigenecity ксенотрансплантатов с линии яичников раковых клеток человека укрывательство ARID1A
мутации, в то время как РНК-интерференция-опосредованных ARID1A
глушителей усиливает клеточную пролиферацию и онкогенность в двух нетрансформированных эпителиальные клеточные линии человека, IOSE-80pc и OSE4 [27]. Эти данные, вместе с нашими, позволяют предположить, что потеря ARID1A
может играть важную роль в процессе канцерогенеза.
<Р> В заключение, мы продемонстрировали потерю ARID1A <бр> выражение в раке желудка и его корреляция с более злокачественный фенотип и неблагоприятным прогнозом у большого числа клинических образцов. Кроме того, мы доказали, что ARID1A
может ингибировать рост опухолевых клеток и образование колоний в пробирке. Насколько нам известно, данные, полученные в настоящем исследовании, представляют первый отчет, коррелирующий наличие ARID1A с услугой клинико-патологическими характеристиками и общей выживаемости больных раком желудка. Взятые вместе с результатами Ван и др.
И Занг и др
. [19], [23], мы еще раз подтвердил, что ARID1A
может служить в качестве подавителя опухоли кандидата и прогностический биомаркер рака желудка.

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> исследование было одобрено Комитетом по этике Сунь Ят-сеном университет онкологического центра по письменное информированное согласие было получено от каждого пациента, участвующего в исследовании.

Клеточные линии и условия культивирования <бр> <р> желудочные клеточные линии рака, SGC7901, AGS, MGC803 и желудочный эпителиальной слизистой оболочки клеточная линия GES1 были получены из Комитета коллекции типовых культур китайской академии наук (Шанхай, Китай). Линии клеток культивировали в среде RPMI 1640, поставляемые с добавлением 10% прогретой неактивными эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Клетки инкубировали при 37 ° С в увлажненной камере, содержащей 5% CO <югу> 2.

Человеческий образец ткани s

<р> В общей сложности 66 парных и злокачественными совпадающая смежных доброкачественное желудка ткани слизистой оболочки были собраны у больных раком желудка, подвергающихся гастрэктомию на Сунь Ят-сена университета онкологического центра в период между 2009 и 2011 годах, и диагноз был подтвержден гистологического исследования. 25 парных злокачественными и соответствующими смежными нераковых тканей слизистой оболочки желудка, используемые для определения экспрессии ARID1A белка в Вестерн-блоттинга были отобраны из 66 парных выборок. После хирургической резекции, свежие ткани были немедленно погружены в RNAlater (Ambion, Inc., США), чтобы избежать деградации РНК, хранили при 4 ° С в течение ночи, чтобы обеспечить полное проникновение RNAlater в ткань и затем замораживали при -80 ° С до тех пор, РНК и экстракции белка проводили. Еще 224 парафином желудка образцы первичной карциномы, которые были собраны в период с 2003 по 2005 год, были получены из Сунь Ят-сена университета онкологического центра. Ни один из этих пациентов не получал лучевой терапии или химиотерапии до операции. В последующие данные о больных раком желудка в данном исследовании доступны и полной. Послеоперационный наблюдение произошло в нашей поликлинике и включены клинические и лабораторные обследования каждые 3 месяца в течение первых 2-х лет, через каждые 6 месяцев в течение третьего по пятый годы, ежегодно в течение еще 5 лет или до смерти пациента, в зависимости от того имели место в первую очередь. Гистопатологическая тип и стадия рака желудка были определены в соответствии с критериями классификации Всемирной организации здравоохранения и стадии TNM выставленного Союзом по международному контролю рака.

Добыча тотальной РНК и в режиме реального времени Количественная ПЦР
<р> Суммарную РНК экстрагировали с использованием TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Общая концентрация РНК оценивали путем измерения оптической плотности при 260 нм с использованием спектрофотометра НАНО DROP (ND-1000, Thermo Scientific, США). Обратной транскрипции (RT) для синтеза первой цепи кДНК осуществляли с помощью 2 мкг тотальной РНК, обработанной M-MLV обратной транскриптазы (Promega, США) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Полученную кДНК затем подвергали в реальном времени количественной ПЦР для оценки уровня относительной мРНК <ЕМ> ARID1A
и GAPDH
(глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, в качестве внутреннего контроля) с следующие праймеры: ARID1A
вперед: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 'и обратный: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3'; GAPDH
вперед: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 'и обратный: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. амплификации гена специфических проводили с использованием ПЦР в реальном времени системы ABI 7900HT (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) с 15 мкл ПЦР-смеси, содержащей 0,5 мкл кДНК, 7,5 мкл 2 х SYBR Green мастер-микс (Invitrogen, Карлсбад , штат Калифорния, США), и 200 нМ соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Смесь предварительно нагревали при 95 ° С (10 мин), а затем усиливается при 95 ° С (30 сек) и 60 ° С (1 мин) в течение 45 циклов. Кривая разрешающая способность была измерена при 95 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 15 сек и 95 ° С в течение 15 сек. Значение Ct (пороговый цикл) каждого образца рассчитывали из пороговых циклов с программным обеспечением прибора (SDS 2.3), и относительное выражение ARID1A
мРНК нормализовали к значение GAPDH
, Данные были проанализированы с использованием сравнительного порогового цикла (2 -ΔCT) метод.

Западная блоттинга
<р> гомогенизированные образцов желудочного рака, включая опухоли и nontumor тканей, а также клеточные линии , лизируют в RIPA буфере для лизиса, и лизаты собирали центрифугированием (12000 оборотов в минуту) при 4 ° с в течение 30 мин. Примерно 50 мкг Образцы белка затем разделяли с помощью электрофореза в 12% додецилсульфатом натри в полиакриламидном геле и переносили на мембрану из поливинилиденфторида фторидов. После блокирования неспецифических сайтов связывания в течение 60 мин с 5% молока обезжиренного, мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° С с помощью мышиных моноклональных антител против ARID1A (Abgent первичный гуморальный Company, США, при разведении 1:1000) , Затем мембраны промывали три раза TBST (трис-буферный солевой раствор с Tween-20) в течение 10 мин и зондировали с пероксидазой хрена (HRP) кролика против мышиного антитела IgG (Иммунологические Consultants лаборатория, США, в 1: 2000 разбавление) при 37 ° С в течение 1 часа. После трех промывок, мембраны были разработаны по усовершенствованной системы хемилюминесценции (Cell Signaling Technology, Danvers, штат Массачусетс, США). Интенсивность полосы была измерена с помощью денситометрии с помощью одного программного обеспечения Количество (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Уровни белка были нормализованы к тому, что из GAPDH обнаружены с помощью мыши против человеческого GAPDH моноклональное антитело (Shanghai Kangchen, Китай, в 1:10000 разбавления).

Immunohistochemistry Анализ

срезы ткани были депарафинировали диметилбензолом и регидратации через 100%, 95%, 90%, 80% и 70% этанола. После трех промывок в PBS (фосфатно-солевой буфер), слайды кипятили в антигенной поиска взаимосвязанного буфере, содержащем 0,01 М цитрата натрия-соляной кислотой (рН 6,0) в течение 15 мин в микроволновой печи. После промывки PBS, срезы ткани инкубировали с первичным антителом, и предметные стекла промывают в 3% растворе закалочной пероксидаза (Invitrogen), чтобы блокировать эндогенной пероксидазы. Затем срезы инкубировали с мышиными моноклональными антителами против ARID1A (Abgent первичный гуморальный Company, США, при 1:300 разведении) при 4 ° С в течение ночи, а затем инкубируют с пероксидазой хрена (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Обнаружение Kit) в комнате температура в течение 30 мин. После промывания в PBS, сигнал визуализации была разработана с 3, 3'-диаминобензидина раствора (DAB), и все слайды были контрастно гематоксилином. В качестве негативного контрол, смежные секции обрабатывали, как описано выше, за исключением того, что они инкубировали в течение ночи при 4 ° С в блокирующем растворе без первичного антитела.
<Р> Общая ARID1A иммунным оценка была рассчитана как сумма процентов положительно окрашенных опухолевых клеток и интенсивность окрашивания. Если коротко, то процент положительного окрашивания оценивали как 0 (0-9%, отрицательное), 1 (10% -25%, спорадический), 2 (26% -50%, очаговый) или 3 (51% -100%, диффузный), и интенсивность, как 0 (отсутствие окрашивания), 1 (слабое окрашивание), 2 (умеренное окрашивание) и 3 (темное окрашивание). Общий балл иммунное был рассчитан с величиной процента положительности балла × показатель интенсивности окрашивания, которое колебалось от 0 до 9. Уровень экспрессии ARID1A был определен следующим образом: "-" (отрицательный, 0 баллов), "+" (слабо положительный, оценка 1-3), "++" (положительный, оценка 4-6), "+++" (сильно положительным, оценка 7-9). На основании уровней экспрессии ARID1A, что у больных раком желудка были разделены на две группы:. Отрицательное выражение ARID1A группа (ARID1A-) и положительное выражение ARID1A группа (ARID1A +, ARID1A ++ или ARID1A +++)

Выражение плазмиды и Переходные Трансфекция
<р> эукариотической экспрессии плазмиду pCMV6-запись, содержащая полнометражную человек ARID1A
кДНК была получена из Asbio Technology Company (Гуанчжоу, Китай). Пустой вектор был использован в качестве отрицательного контроля. MGC803 клетки культивировали в 6-луночных планшетах, пока они не достигли 85-90% сплошности, а затем временной трансфекции проводили с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Через сорок восемь часов после трансфекции, экспрессии генов исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. А потом, осуществляли пролиферацию клеток и образование колоний.

РНК олигонуклеотиды и клеточных Трансфекция
<р> Для нокдауна ARID1A
выражение, миРНК были синтезированы GenePharma Company (Шанхай, Китай). Последовательности миРНК были следующими: siRNA- ARID1A
, смысл: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ', антисмысловая: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3'. Отрицательный контроль (NC), смысл: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ', антисмысловая: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'. 400 пмоль siRNA- ARID1A
или NC трансфицировали в 2 × 10 5 GES1 клеток с использованием Липофектамин RNAi MAX реагента (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. После этого, пролиферации клеток затем выполняется.

Анализ пролиферации
<р> скорость роста клеток MGC803 или GES1 клеток определяли с помощью анализа клеточной пролиферации MTS. Клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 5 × 10 2 клеток на лунку. Скорость роста клеток определяли с помощью MTS пролиферации клеток набора в соответствии с инструкцией производителя (Promega, США). Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.

Colony Формирование анализа
<р> Для анализа образования колоний, ARID1A
-expressing MGC803 клетки или управление MGC803 клетки высевали в 6-хорошо планшет при плотности 5 × 10 2 клеток на лунку. Через 10 дней культивирования, выживающих колоний (≫ 50 клеток на колонии) были подсчитаны с кристаллическим фиолетовым (0,5%) окрашивания. Колониеобразующих эффективности (CFE%) определяли как отношение числа колоний, образованных в культуре к числу клеток, инокулированных. Эксперимент был проведен в трех экземплярах.

Статистический анализ
<р> Различия в мРНК и экспрессию белка между образцами опухолей и парными соседних образцов неопухолевой ткани оценивали с спаренные-образцов Т-тест. Χ 2 тест использовали для анализа отношений между выражением ARID1A и различными клинико-патологическими параметрами. Кривые выживаемости были рассчитаны с использованием метода Каплана-Мейера и сравнивались с помощью теста лог-ранга. Пропорционального риска регрессионной модели Кокса была использована для однофакторного и многофакторного анализа для изучения влияния на клинико-патологическими переменных и выражения ARID1A на выживание. Двухстороннюю вероятность непарный Стьюдента т
тест был использован для оценки различий в скорости роста клеток и образование колоний. Статистический анализ проводился с применением статистического пакета для социальных наук, версия 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США), а также двусторонний значение меньше 0,05 P
считали статистически значимыми.

• PLoS ONE: дивергенция Тенденции последних населения на основе выживаемости в пищеводных и желудочных рака
• PLoS ONE: Идентификация HSA-MIR-335 в качестве прогностического подписи в рака желудка