Ploche ONE: Aktivácia mezenchymálnych kmeňových buniek makrofágy výzvu rakovina žalúdka u ľudí rastu prostredníctvom NF-kB Pathway

abstraktné

Hromadí sa dôkazy naznačujú, že makrofágy aktiváciu mezenchymálnych kmeňových buniek (MSCS) nadobúdať prozápalový fenotyp. Avšak role MSC aktivuje makrofágy v karcinómu žalúdka je stále do značnej miery neznáma. V tejto štúdii sme zistili, že MSC boli aktivované makrofágov produkujú zvýšené hladiny zápalových cytokínov. Cell tvorba kolónií a testy migrácie transjamkových odhalila, že supernatanty z aktivovaných MSC by mohla podporiť aj žalúdočné epitelu a proliferáciu buniek žalúdočnej rakovinových buniek a migráciu. Okrem toho, expresia epiteliálnych-mezenchýmových prechodu (EMT), angiogenézy, a gény stemness súvisiacich so v aktivovaných MSC zvyšuje. Fosforylovanej formy NF-kB, EKR a STAT3 v žalúdočných bunkách boli zvýšené o aktívnu MSC. Inhibícia NF-kB aktivácia PDTC blokoval účinok aktivovaných MSC na buniek karcinómu žalúdka. Ko-injekcie aktivovaných MSC sa buniek karcinómu žalúdka by mohlo urýchliť rast rakoviny žalúdka. Navyše ľudské periférne krvné monocyty odvodené makrofágy aktivuje tiež MSCS výzvu žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek a migráciu. Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú, že MSC aktivované makrofágy získať prozápalový fenotyp a rýchly rast rakovina žalúdka v NF-kB-závislým spôsobom, ktorý poskytuje nové dôkazy pre moduláciu MSC podľa mikroprostredie nádoru a ďalšie vhľad do úlohy stromálnych bunky v žalúdku karcinogenéze a progresii rakoviny

Citácia :. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) Aktivácia mezenchymálnych kmeňových buniek makrofágy výzvu rakovina žalúdka u ľudí rastu prostredníctvom NF-kB dráhy. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

prijatá: 18. februára 2014; Prijaté: 21.apríla 2014; Uverejnené: 13. mája 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený Major výskumného zámeru Národná prírodná Science Foundation Číny (Grant No. 91129718), Národná prírodná Science Foundation of China (Grant č. 81302119, 81201660, 81071421), provincia Ťiang-su za význačný Sci-tech inovácií tím v vysoké školy a univerzity (Grant č. SJK2013-10), provincii Jiangsu je projekt vedecké a technologické inovácie a úspechy transformácie (Grant no.BL2012055), provincii Jiangsu je vynikajúci Medical Academic Leader a Sci-tech Innovation Team Program (Grant no.LJ201117), Natural Science Foundation v provincii Ťiang-su (Grant no.BK2012709, BK20130540), doktorandský program Vznik štátneho ministerstva školstva (Grant č. 20113227110011), provincia Ťiang-su pre prírodné Scicence výskum Vysoké školy a univerzity (13KJB320001). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejšie sa vyskytujúcich nádorových ochorení a udržuje hlavnou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [1], [2]. V Číne existuje asi 360.000 jedincov zomiera na rakovinu žalúdka každý rok [3]. Hoci incidencia sa v posledných rokoch na západe klesla, prežitie je ešte horšia [4]. Počas posledných desaťročí veľké úsilie bol vyvíjaný pre objasnenie patogenézy rakoviny žalúdka. Avšak, zložitý mechanizmus žalúdočné karcinogenézy je stále odkrytý. Hromadia sa dôkazy naznačujú, že dlhodobý chronický zápal je jednou z hlavných príčin vzniku nádorov. Uvoľňovanie prozápalových mediátorov a zvýšenej miestnej úrovni druhov kyslíka a dusíka môžu prispieť k karcinogenézy [5]. Dysregulovaný produkcie cytokínov v zápalových mikroprostredie stimuluje expresiu génov spojených s vývojom rakoviny a modifikuje štruktúrne rysy z mikroprostredia k urýchleniu vzniku a progresii rakoviny [6] - [9].

mikroprostredie nádoru sa skladá z rôznych stromálne bunky vrátane infiltrujúcich imunitných buniek, karcinómu spojené s fibroblasty (CAFS), mezenchymálnych kmeňových buniek (MSCS), a krvi a lymfatického cievnych sietí. Tieto bunky na seba vzájomne pôsobia a tvoria zápalové mikroprostredie a prispievajú k tvorbe nádorov [10], [11]. Medzi stromálne bunky, makrofágy, ako dôležitých imunitných regulačných buniek, hrá dominantnú úlohu v riadení zápal v mikroprostredie nádoru. Napríklad makrofágy izolované z mikroprostredia nádoru pacientok s karcinómom prsníka tajných chemotaktické cytokíny k rozšíreniu metastáz karcinómu buniek [12]. Makrofágy boli tiež preukázané, že podporuje zápalové reakcie a tumorigeneze cez vplyv na expresiu zápalových cytokínov, a zmena molekulárnej onkogénnu programy v epiteliálnych buniek [13].

mezenchýmové kmeňové bunky (MSCS) sú ďalšie hlavnou zložkou nádoru mikroprostredie a sú považované za prekurzorové bunky karcinómu spojené mezenchýmových buniek a endoteliálnych buniek [14]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že mscs tajné rozpustné faktory, ktoré podporujú množenie rakovinových buniek a metastáz [10]. Na modeli rakoviny žalúdka zápalom spojené, MSC by mohol byť aktivovaný k CAFS zvýšiť chronický zápal a vývoj rakoviny [15]. Okrem toho, sa MSC boli hlásené pre nábor monocyty /makrofágy, aby podporovali rast nádoru v CCR2-depedent spôsobom [16]. Interakcia medzi makrofágy a MSC produkujú aktivovaný, prozápalový fenotyp s vysokou CXCL10 a sekréciu IL-6, ktorý môže mať vplyv na zápalovú mikroprostredie. [17]

Karcinóm žalúdka je klasický model chronického zápalu k rakovine. Avšak role MSC aktivovanými makrofágy v karcinómu žalúdka a podkladovým mechanizmu sú stále do značnej miery neznáma. V tejto štúdii sme zistili, že MSC boli silne aktivujú makrofágy za zápalový stav, za vzniku zápalovej cytokíny a faktory nádorové-propagáciu, čo vedie k zvýšeniu žalúdočnej epiteliálne proliferácie a migrácie buniek buniek a rakoviny prostredníctvom aktivácie NF-kB dráhy. Naše výsledky ukazujú, že makrofágy aktivované mscs podporovať rast rakoviny žalúdka a progresii pod zápalový stav.

Materiály a metódy

Cell Culture

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie HGC-27, ľudského žalúdka epitelové bunkové línie GES-1 a humánne akútna monocytární leukémie bunkové línie THP-1 boli zakúpené z ústavu biochémie a bunkovej biológie na Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Čína). GES-1 a THP-1 bunky boli kultivované v médiu RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) s 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS, Invitrogen), a bunky HGC-27 boli udržiavané vo vysoko glukózy DMEM (H -DMEM, Invitrogen) s 10% FBS. MSC boli odvodené z pupočnej šnúry a kultivované v nízkom-glukózy (DMEM L-DMEM, Invitrogen) s 10% FBS. Bunky boli všetky inkubované pri 37 ° C vo zvlhčenom inkubátore pre kultiváciu buniek s 5% CO _{2. Čerstvé pupočnej šnúry tkaniva boli získané od zdravých šestonedelí matiek potom, čo bol získaný písomný informovaný súhlas. MSC boli izolované a charakterizované ako bolo opísané skôr [18]. Všetky protokoly experimentu boli schválené etickou komisiou Jiangsu univerzity. MSC v kanáli 3 boli vybrané pre pokusy.}

Supernatant Príprava

Na prípravu makrofágov spojené MSCS supernatantu, MSC (3 x 10 ^{5) boli schovať dodržiavať. Bunky THP-1 (1:01 pomer) bolo pridané čerstvé médium v ​​prítomnosti alebo neprítomnosti LPS (1 ug /ml). Po súčasnej kultivácii počas 48 hodín sa médium odstráni a bunky boli opatrne premyté PBS, aby sa odstránili bunky THP-1. Supernatanty z aktivovaných MSC boli odobraté 24 hodín neskôr sa filtruje cez 0,22-um filter a uloží sa pri teplote -80 ° C až do použitia. Pri použití pre bunkové funkcie analýzy, supernatanty z aktivovaných MSC sa zmieša s rovnakým objemom 10% FBS-DMEM obsahujúcim H-alebo RPMI-1640. Pre signálne dráhy analýzy, boli bunky ošetrené supernatanty z aktivovaných MSC po dobu 1 hodiny}

Luminex Assay

ľudského cytokínu &.; chemokínu Magnetic Beads panel kit (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) bol určený na detekciu faktor stimulujúci kolónie granulocytov (G-CSF), doštičkový rastový faktor-BB (PDGF-BB), monocytární chemostatický protein- 1 (MCP-1), tumor nekrotizujúci faktor-α (TNF-α), vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 a IL-8 v supernatante z aktivovaných MSC. Všetky postupy boli spracované podľa inštrukcií výrobcu. boli detekované a analyzované signály pomocou Luminex200 systému (Millipore).

Transwell Assay migrácie

Po ošetrení supernatantu z aktivovaných MSC po dobu 48 h, GES-1 a HGC 27-buniek ( 1 x 10 ^{5 /jamka) boli vložené do hornej komory (8 um) (Corning, NY, USA) v médiu bez séra. Kompletné médium sa umiestni do dolnej komory. Po inkubácii po dobu 12 hodín, bunky zostávajúce v dolnej časti polykarbonátovú membránu boli zotreté vatovými tampónmi. Bunky migráciu na spodnom povrchu membrány potom boli fixované metanolom počas 30 minút. Migrované bunky boli zafarbené kryštálovou violeťou počas 15 minút a počítali za šesť náhodných polí v mikroskopu (x 100).}

Cell Colony Formation Test

Bunky boli zbierané po ošetrení supernatantu z MSC po dobu 48 hodín a vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek (1000 buniek /jamku) a kultivované po dobu 10 dní. Médium bolo menené každé tri dni. Na konci tohto obdobia rastu, bunky boli fixované metanolom počas 30 minút a zafarbené kryštálovou violeťou po dobu 15 minút. Bunkové kolónie boli fotografované a počet kolónií bol počítaný pre štatistickú analýzu.

RNA extrakčné a PCR v reálnom čase

Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu , Päť mikrogramov RNA bola použitá pre kvantitatívne real-time PCR analýzy. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. Sekvencie špecifických primérov boli všetky sú uvedené v tabuľke S1.

Western Blot

Bunky boli lyžovanie a homogenizované v pufri RIPA doplnenom kompletnú inhibítory proteázy. Rovnaké množstvo proteínov (200 ug) bol vyriešený v 12% SDS-PAGE. Proteíny boli potom prenesené na PVDF membrány po elektroforéze. Po blokované v 5% (w /v) odtučnené mlieko po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, boli membrány inkubované v príslušných vhodných riedeniach špecifických primárnych protilátok sa cez noc pri teplote 4 ° C. Zdrojom primárnych protilátok boli nasledovné: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-Vimentin a anti-fosfo-STAT3 (Signalway protilátky, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Čína), anti-E-cadherin, anti- ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 a anti-N-cadherin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kB, anti-fosfo-NF- kB, anti-CyclinD1, anti-VEGF a anti-C-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-c-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, USA).

Animal model

Tri až päť týždňov starých Balb /c nahých myší boli zakúpené od SLAC pokusného zvieraťa Center (Shanghai, Čína). Zvieratá bola udržiavaná v súlade s inštitucionálnou politiky a všetky štúdie boli vykonané so súhlasom Univerzity Výboru pre používanie a starostlivosť o zvieratá Jiangsu univerzity. Bunky HGC-27 (1 x 10 ^{6) a MSC (5 x 10 5) boli trypsinizovány, premyté a resuspendované v 200 ul PBS, resp. Potom boli bunky zmiešané a ko-injekcií do ľavého boku nahých myší. Nádory boli chirurgicky odstránené 20 dní po injekcii, vyfotografoval a zváži. Veľkosť nádoru bola stanovená meraním posuvným meradlom a vypočítava na základe modifikovaného elipsoidu vzorca (L x W x W /2), kde L predstavuje dĺžku, a W predstavuje šírku.}

Imunohistochémia

Formalin- pevné parafínových nádorové myšou tkanivové rezy boli najskôr zbavené parafínu v xyléne, rehydratované pomocou etanolové. Rezy sa varí po dobu 10 minút v citrátovom pufri (pH 6,0, 10 mM) na získanie antigénu. Endogénnej peroxidázy aktivita bola inhibovaná s expozíciou až 3% peroxidu vodíka po dobu 10 min. Potom boli rezy blokované 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, Čína) a inkubované pri správnom zriedeným PCNA alebo VEGF primárnej protilátky pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po premyté PBS boli rezy inkubované zriedenou sekundárnou protilátkou po dobu 20 minút. A konečne, rezy boli vizualizované s 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) a potom kontrastne hematoxylínom pre vyšetrenie vo svetelnom mikroskope (200 x).

Primárne Human Monocyty Izolácia

boli získané Ľudské monocyty z buffy coat periférnej krvi vzoriek darovanej zdravého darcu za použitia Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Čerstvým RPMI 1640 doplnené 10% FBS bolo menené každé 2 dni a neadherentní bunky sa odstránia a čistí. Monocyty sa inkubujú po dobu 7 dní a 50 ng /ml M-CSF bol pridaný k získaniu makrofágov (M). Potom 24 h supernatant vylučovaný makrofágy sa oddelí a filtruje sa. Priľnavé MSC boli ošetrené s makrofágov supernatantom v neprítomnosti alebo v prítomnosti LPS (1 ug /ml) počas 48 hodín a premyje. Supernatanty z aktivovaných MSC boli zbierané o 24 hodín neskôr a slúži k ďalšiemu štúdiu.

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softwaru SPSS Statistics 16.0. Dáta bola prezentovaná ako priemer ± SD. Rozdiely v jednotlivých skupinách boli analyzované jednocestnú ANOVA. Rozdiely medzi PDTC liečby boli testované pomocou t
testu. Štatistická P
hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za významnú

Výsledky

Co-kultúra s makrofágy Podľa zápalové ochorenie up-regulované expresiu zápalových cytokínov a Stemness génov. MSC

pre skúmanie účinku makrofágov na MSC za zápalový stav, sme spoločne kultivované s MSC THP-1 buniek v neprítomnosti alebo v prítomnosti LPS (1 ug /ml) po dobu 48 hodín. THP-1 bunky boli odstránené premytím PBS a adherentní MSC boli kultivované v čerstvom médiu na ďalších 24 hodín (obr S1). Luminex test bol vykonaný na stanovenie úrovne rôznych zápalových faktorov v supernatantu z MSC. Výsledky ukázali, že produkcia IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF a G-CSF bola významne v supernatantu sa zvýšila z MSC spoločne kultivované s bunkami THP-1 v prítomnosti LPS. Nízke alebo nedetegovateľné hladiny týchto cytokínov boli pozorované u MSC, ktoré neboli spoločne kultivované s THP-1 bunkách (obrázok 1a). Pre potvrdenie zvýšenú expresiu týchto zápalových cytokínov, sme vopred real-time PCR pre detekciu hladiny mRNA týchto cytokínov. Zistili sme, že v súlade s výsledkami testu Luminex (obrázok 1B), ko-kultúre s bunkami THP-1 up-regulované hladiny mRNA IL-6, IL-8 a TNF-a v MSC. Na určenie, či kokultivace s bunkami THP-1 ovplyvňuje stemness MSC, sme zistili expresiu Oct4 a Sox2 v MSC pomocou Western blot. Výsledky ukázali, že obe Oct4 a hladiny Sox2 proteínov boli v MSC, ktoré boli spoločne kultivované s THP-1 bunkách (Obrázok 1C) zvyšuje. Pre ďalšie potvrdenie tohto javu sme tiež skúmali hladiny mRNA Oct4 a Sox2 v MSC. Výsledky PCR v reálnom čase ukázala, že kokultivace s bunkami THP-1 up-regulovaná expresia Oct4 a Sox2 génov v MSCS (obrázok 1D). Všeobecne platí, že tieto výsledky naznačujú, že MSC bola významne aktivovaná produkujú vyššie hladiny zápalových cytokínov ko-kultivovaných THP-1 buniek v zápalu.

Makrofágy aktivované MSC zvýšila proliferácie a migrácie žalúdočné epiteliálnych buniek

makrofágy a MSC sú dôležitou súčasťou mikroprostredia nádoru. Pre demonštráciu funkčné role makrofágov aktivovaných MSC, sa vybralo supernatanty z aktivovaných MSC a inkubujú sa s žalúdočného epitelu línie GES-1 po dobu 48 hodín. Potom sme vykonali test tvorby kolónií buniek pre vyhodnotenie proliferáciu buniek GES-1. Ako je ukázané na obrázku 2A, bunky boli inkubované so supernatantom z aktivovaných MSC rástli rýchlejšie a tvorili väčšie a väčšie kolónie ako v iných skupinách. Okrem toho, inkubácia s supernatantu z aktivovaných MSC takisto zvýšili hladiny proteínovej PCNA a VEGF v GES-1 bunkách (Obrázok 2B). Výsledky testu ukázali, transwell migrácia, že počet migrovaných GES-1 buniek v aktivovaných MSC plus skupiny LPS bol viac než v iných skupinách (Obrázok 2C). Výsledky Western blot analýzy ukázali, že makrofágy aktivované MSC zvýšila expresiu mezenchymálnych bunkových markerov (N-cadherinu a vimentin) a zníženie expresie epiteliálnych buniek markeru (E-cadherin) v GES-1 bunkách (Obrázok 2D). Ďalej sme stanovili expresiu VEGF, MMP9 a TGF-beta pomocou real-time PCR. Ako je znázornené na obrázku 2E, inkubácie sa supernatant z aktivovať MSC plus skupiny LPS up-regulovaná expresia VEGF, MMP9 a TGF-beta v bunkách GES-1. Tak MSC aktivované makrofágy v zápalovom prostredí významne podporoval žalúdočné epitel proliferáciu buniek a migráciu.

Makrofágy aktivované MSC podporoval rast a migrácie na žalúdočné rakovinu buniek

Vzhľadom k tomu, makrofágy aktivované MSC ovplyvňovať žalúdočné epitelovej proliferácie buniek a migrácie, my next určuje vplyv makrofágov aktivovaných MSC o ochrane ľudských rakovinových buniek žalúdočnej HGC-27. Výsledky testu tvorby kolónií buniek ukázala, že HGC-27 bunky boli inkubované so supernatantom z makrofágov aktivovaných MSC rástli rýchlejšie a tvorili väčšie klony, než u ostatných skupín (obrázok 3A). Západné skrutku analýzy ukázali, že hladiny proteínové PCNA a VEGF v bunkách HGC-27 boli významne up-regulované supernatantu z aktivovaných makrofágov-MSC (obrázok 3B). Transwell migračné test ukázal, že počet migrovaných buniek HGC-27 bola výrazne zvýšená o supernatantu z aktivovaných makrofágov-MSC (obrázok 3C). Western blot analýzy ukázali, že makrofágy aktivované MSC indukuje expresiu markerov mezenchymálnych buniek (N-cadherinu a vimentin) a inhibujú expresiu epiteliálnych buniek markeru (E-cadherin) v HGC-27 bunkách (obrázok 3D). Hladiny mRNA VEGF, MMP9 a TGF-beta bola tiež zvýšená v bunkách HGC-27 po ošetrení supernatantu z aktivovaných makrofágov-MSC (obrázok 3e). Vzhľadom na to, že nádorové bunka stemness je silne spojené s ich migráciu, sme zistili expresiu génov v bunkách stemness HGC-27. Expresie Oct4 a Sox2 bol najmä up-regulovaná u supernatantu z aktivovaných makrofágov-MSC (obrázok 3F). V súlade s real-time PCR výsledky, hladiny proteínové Oct4 a Sox2 boli tiež zvýšená v bunkách HGC-27 od supernatantu z aktivovaných makrofágov-MSC (obrázok 3G). Stručne povedané, tieto výsledky naznačujú, že makrofágy aktivované MSC tiež podporoval žalúdočné rast rakovinových buniek, migráciu cez indukciu EMT a bunkovej stemness za zápalový stav.

Makrofágy aktivované MSC Akciové žalúdka proliferácie buniek a migrácie cez NF kB Pathway

s cieľom preskúmať mechanizmus zodpovedný za propagáciu úlohu makrofágov aktivovaných MSC v bunkovej proliferácii a migrácii, sme stanovili expresiu niekoľkých kľúčových signálnych meničov pre zápalu a rakoviny, vrátane STAT3 EKR a NF -κB, v žalúdočných epiteliálnych buniek a buniek karcinómu žalúdka. Výsledky Western blot analýzy ukázali, že hladiny p-STAT3, p-EKR a p-NF-kB bola významne vyššia u GES-1 buniek ošetrených supernatanty z aktivovaných MSC než v iných skupinách. Hladina proteínov NF-kB neboli žiadne zmeny, zatiaľ čo u EKR a STAT3 mierne znížil (obrázok 4A). Zvýšenie p-STAT3, p-EKR a na úrovni p-NF-kB proteínu boli tiež pozorované v bunkách HGC-27 po ošetrení supernatantu z aktivovaných MSC (obrázok 4B). potvrdila sme up-regulácia p-STAT3, p-EKR a na úrovni p-NF-kB proteínu supernatantu z aktivovaných MSC v inom žalúdočné rakovina bunkové línie SGC7901 (obr S2). Ak chcete zistiť, či následní cieľové gény boli aktivované v bunkách HGC-27 sme skúmali expresiu cyklin D1, C-myc a c-Jun proteíny. Ako je znázornené na obrázku 4C, hladiny proteínov cyklin D1 a c-Jun boli zvýšené po ošetrení supernatantu z aktivovaných MSC.

budúcnosti zistiť, či NF-kB hrá hlavnú úlohu v aktivovanú MSC bunky HGC-27 boli vopred ošetrené s PDTC inhibuje NF-kB fosforylácii a potom inkubované sa supernatanty z aktivovaných MSC. Zistili sme, že indukcia NF-kB fosforylácie aktivovanými MSC v bunkách HGC-27 sa výrazne inhibovaná PDTC (obrázok 4D). Výsledky tvorby kolónií buniek a testy migrácie transwell ukázali, že zvýšená proliferácie a migrácie buniek HGC-27 od aktivovaných MSC boli významne znížené v PDTC liečených skupín (Obr 4E a 4F). Ďalej, liečba PDTC inhibuje tiež up-regulácia VEGF, MMP9 a TGF-beta aktivovanými MSC v HGC-27 bunkách (Obrázok 4G). Dohromady tieto výsledky ukazujú, že aktivované MSC výzva žalúdočné epitelových buniek a proliferáciu buniek karcinómu žalúdka a migrácie prostredníctvom NF-kB.

Makrofágy aktivované MSC sponzorovaných karcinóm žalúdka rast in vivo

Vzhľadom k tomu, dôkaz, že makrofágy aktivované MSC by mohli zvýšiť žalúdočnej proliferáciu buniek in vitro
, sme si hovorili, či sú tieto MSC vyvíjaný propagáciu úlohu v žalúdku rast rakoviny in vivo
. Preto sme spoločne so vstrekovaním bunky HGC-27 s aktivovanými MSC do holých myší. Dvadsať dní neskôr, nádorové tkanivá boli odstránené, merané a zváži. Ako je znázornené na obrázkoch 5A a 5B, je xenografe nádory v aktívnom MSC čo-injekčne skupine boli väčšie ako v iných skupinách. Imunohistochemické analýzy boli vykonané na stanovenie expresie proteínov súvisiace s rastom a pre-angiogénnych faktorov v nádorových tkanivách. Silnejší pozitívne farbenie PCNA a VEGF bol pozorovaný v aktívnom MSC čo-injekčne skupine (obrázok 5C). Real-time PCR analýzy boli vykonané za účelom zistenia expresie VEGF, MMP9 a TGF-beta v nádorových tkanivách. Zistili sme, že expresie všetkých týchto génov v ko-injekcií skupiny boli vyššie ako v HGC-27 bunky samotné skupiny (obrázok 5D). Výsledky real-time PCR analýzy ukázali, že hladiny mRNA Oct4, Sox2 a Sall4 boli najvyššie v aktívnom MSC čo-injekčne skupine (obr 5E). Stručne povedané, tieto údaje naznačujú, že makrofágy aktivované MSC výzva žalúdka rast rakoviny in vivo
.

Primárne Monocyty Aktivované MSC výzvu žalúdka rakovinová bunka proliferácie a migrácie cez NF-kB

pre ďalšie potvrdenie o aktivácii MSC makrofágy výzvu žalúdočné množenie nádorových buniek a migráciu, budeme izolovať monocytmi z ľudskej periférnej krvi a vyberá supernatantu z monocytov diferencovanú makrofágy. Po inkubácii s supernatantu z monocytov diferencovaných makrofágy, MSC zozbieraného a celková RNA bola extrahovaná pre real-time PCR analýzy. Ako je znázornené na obrázku 6B, liečba sa supernatantom z monocytov diferencované makrofágy up-regulovaná hladiny mRNA IL-6, IL-8, MCP-1 a VEGF v MSC. potom sa inkubuje buniek karcinómu žalúdka sa supernatantom z aktivovaných MSC. Výsledky tvorby kolónií buniek a testy migrácie transwell ukázala, že supernatant z aktivovaných MSC zvýšiť proliferáciu a migráciu buniek HGC-27 (obr 6C a 6D). Ďalej sme preukázali, že inkubácie sa supernatanty z aktivovaných MSC zvýšil expresiu p-STAT3, p-EKR a p-NF-kB v HGC-27 bunkách (obrázok 6E). Dohromady tieto údaje naznačujú, že v súlade s THP-1 buniek, ľudských primárnych makrofágov aktivovať aj MSCS výzvu žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek a migráciu cez NF-kB.

Diskusia

Počas minulých desaťročiach odkaz zápalu na rakovinu priťahuje veľa pozornosti [5], [6]. Dlhodobá expozícia buniek epitelu zápalové mikroprostredie vedie k malígnej transformácii [9], [19]. Tieto stromálne bunky sa ukázali byť kriticky podieľa na progresiu zápalu z rakoviny moduláciou zápalové mikroprostredia [7], [8]. Makrofágy a MSC sú dve hlavné zložky nádorového strómy a podieľať sa na regulácii rozsah zápalové reakcie v priebehu karcinogenézy [16]. Avšak súhra medzi makrofágy a MSC u karcinómu žalúdka nebolo dobre charakterizovaná.

Karcinóm žalúdka sa vyvinuli z dlhodobej chronickej gastritídy a je klasický model rakoviny zápalom súvisiacich. Už skôr sme izolovali mscs rezidentný z ľudských nádorových tkanív žalúdka a ukázal, že rakovina žalúdka tkaniva odvodený MSC vylučovaný mnoho zápalových cytokínov a podporovať žalúdočné progresiu rakoviny. V priebehu zápalu, monocyty /makrofágy by mohol byť zaradený do dotovať MSCS s funkciami nádoru-podporovať [16]. Okrem toho, Helicobacter pylori
indukuje chronický zápal v žalúdočnej epiteliálne bunky uvoľnením LPS existujúcich vo svojich bunkových stenách. V tejto štúdii sme sa predčistená MSCS s makrofágy v prítomnosti LPS pre napodobenie rakovina žalúdka mikroprostredie a určiť, či makrofágy aktivované MSC prispievať k progresii rakoviny žalúdka. Preukázali sme, že MSC inkubované s makrofágy a LPS vylučuje vyššie hladiny zápalových cytokínov. Nedávna štúdia uvádza, že kontinuálne stimulácia makrofágov stabilizuje strednú indukované MSC získať prozápalový fenotyp [17]. V súlade s ich štúdii sme zistili, že krátka doba inkubácie s makrofágov aktivovať tiež mscs k docieleniu vyššej úrovne zápalových cytokínov.

epiteliálne-mezenchýmových-prechod (EMT) je významný proces, pri nádorových metastáz [20]. V priebehu rokov, vlastnosti vzťahujúce sa k preprogramovaniu EMT sa pripisuje zvýšenie bunkovej plasticitu v rakovinových bunkách. Rakoviny kmeňových buniek bola zavedená a preukázané, že prispievajú k tvorbe nádorov a nádorových metastáz [21] - [24]. Nedávne štúdie naznačujú, že subpopulácie kmeňové, ako je a mezenchymálnych buniek podobných zobrazená väčší tumorigeničnosti v žalúdočnej epiteliálne bunky in vitro a in vivo
[25]. V tejto štúdii sme zistili, že aktivované MSC, ktoré boli spoločne kultivované s makrofágy v prítomnosti LPS, by mohlo významne zvýšiť migráciu žalúdočných epiteliálnych buniek, rovnako ako buniek karcinómu žalúdka. Ďalej sme preukázali, že supernatanty z aktivovaných MSC indukovanú EMT v žalúdočnej epiteliálnych a buniek karcinómu žalúdka. Pre ďalšie vysvetlenie týchto výsledkov sme zistili expresiu stemness génov v nádorových bunkách žalúdka. Zistili sme, že expresie Oct4 a Sox2, dva hlavné gény stemness súvisiace zrejme zvýšená o aktivovaných MSC. Angiogenézy je rozhodujúci pre nádorových metastáz a expresie VEGF je úzko súvisí s rakovinou žalúdka prognózou [26], [27]. Zistili sme, že expresia VEGF bola významne zvýšená po ošetrení supernatantu z aktivovaných MSC vo buniek karcinómu žalúdka obaja in vitro stroje a in vivo
. Na základe týchto poznatkov sme navrhli, že makrofágy aktivované MSC vylučovaný viac zápalové cytokíny a podporoval proliferáciu a migráciu buniek karcinómu žalúdka indukciou EMT a bunkovej stemness.

Niektoré štúdie ukázali, že MSC podporovať rakovinu žalúdka rast cez rôzne dráhy [28], [29] a Nedávna štúdia ukázala, že expresia VEGF je úzko spojený s NF-kB pri karcinóme žalúdka [30]. Okrem toho TGF-β hrá dôležitú úlohu v regulácii bunkovej proliferácie, apoptózy, diferenciáciu, migráciu a rozvoj extracelulárnej matrix [31], [32]. Nedávne výskumy ukázali, že TGF-β aktivuje NF-kB a hrá dôležitú úlohu v priebehu synergického aktivácie rôznych dráh [33], [34]. TGF-β-sprostredkovanú indukciu matrix metaloproteinázy 9 (MMP9) bolo hlásené, ktoré majú byť regulované NF-kB a JNK dráhy [35]. Výroba MMP9 TNF-stimulovanej tiež aktivuje NF-kB a EQF signálnych dráh [36]. Navyše, priebeh žalúdočných epiteliálnych buniek do buniek karcinómu žalúdka bolo preukázané, že byť regulovaná expresia cytokínov a NF-kB signálne dráhy [37]. Ďalšia správa naznačuje, že inhibícia ako proliferáciu a angiogenézu s intervenciu drog v rakoviny žalúdka súvisí s potlačením NF-kB [38]. V tejto štúdii sme ukázali, že makrofágy aktivované MSC up-regulované fosforylácii NF-kB a expresiu VEGF, TGF-beta, a MMP9 v žalúdočných bunkách. Súbežné zvýšenie STAT3 a ERK fosforylácia môže mať za následok aktiváciu NF-kB, pretože NF-kB bola už skôr preukázané, že regulujú STAT3 a EQF signálne dráhy [39], [40].

Na záver, nám preukázala v tejto štúdii, že MSC aktivované makrofágy, získané pre-zápalový fenotyp a podporoval žalúdočné epiteliálne proliferáciu a migráciu buniek a buniek rakoviny prostredníctvom aktivácie NF-kB. Naše nálezy poskytujú nový dôkaz pre moduláciu žalúdočných epiteliálnych buniek a nádorových buniek tým, MSC pod zápalové prostredie a ďalšie vhľad do úlohy stromálnych buniek v progresii chronické zápaly k rakovine.

Podporné informácie
Obrázok S1.
kokultivace MSC s bunkami THP-1. Reprezentatívne obrazy THP-1 buniek a MSC v systéme priameho ko-kultúry pred (vľavo) a po (vpravo) umývanie PBS. Zväčšenie, x 100, Mierka = 50 um
doi :. 10,1371 /journal.pone.0097569.s001
(TIF)
Obrázok S2.
Makrofágy aktivované MCSS indukovanú aktiváciu NF-kB v SGC-7901 bunky. SGC7901 bunky boli ošetrené supernatanty z makrofágov aktivované MSC a expresie p-STAT3, STAT3, p-EKR, EKR, boli detekované p-NF-kB, a NF-kB proteíny SGC-7901 buniek pomocou Western blot .
doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s002
(TIF)
tabuľke S1.
Zoznam sekvencií primerov
doi :. 10,1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC)

• Ploche ONE: Normálny fibroblasty Induce E-cadherinu Loss a zvýšiť metastáz do lymfatických uzlín v rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: prognosticky hodnota pomeru uzlina v stupni III rakovina žalúdka u pacientov podstupujúcich radikálnu Resection