Ploche ONE: Zacielenie CDH17 Potláča progresiu nádorov v žalúdku rakovinu Downregulating Wnt /beta-katenin Signaling

abstraktné

Účel

rakovina žalúdka zostáva jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu po celom svete. Pacienti zvyčajne neskoro s miestnymi inváziou alebo metastáz, pre ktoré neexistujú žiadne účinné terapie k dispozícii. V nadväznosti na predchádzajúce štúdie, ktoré zistené adhézny molekulu Cadherin-17 (CDH17) ako potenciálny marker karcinómu žalúdka, sme vykonali proof-of-zásadou štúdie o rozvoji racionálne terapeutické prístupy zamerané na CDH17 pre liečbu tohto ochorenia.

Metódy

Imunohistochémia bola použitá na štúdium expresie CDH17 vo 156 žalúdočných karcinómov, a vzťah medzi prežitím a expresiou CDH17 bola študovaná viacrozmerné analýzy. Vplyv RNA interferencie sprostredkovanej Vyradenie CDH17 na proliferáciu bunkových línií karcinómu žalúdka bola skúmaná in vitro a in vivo, rovnako ako účinky na signalizácia downstream od imuno-blottingom.

Výsledky

CDH17 bola trvale up-regulovaný v ľudských karcinómov žalúdka a celkové prežívanie u pacientov s CDH17 up-reguláciu bol horší ako u pacientov bez expresie tohto génu (celkovo 5 yrs prežitia 29,0% verzus 45,0%, P 0,01). Funkčné testy preukázali, že CDH17 knockdown inhibuje proliferáciu buniek, adhézia, migrácia, invázia, clonogenicity a vyvolať G0 /G1 zastaviť. U myší, zhrnie sprostredkované CDH17 knockdown výrazne inhibuje rast nádoru; intratumorální injekcie CDH17 shRNAs má za následok významné protinádorové účinky na transplantovaných nádorových modeloch. Tieto protinádorové mechanizmy inhibíciu CDH17 zahŕňať inaktiváciu Wnt /β-katenin.

Záver

Naše výsledky identifikovať CDH17 ako biomarker karcinómu žalúdka a atraktívny terapeutický cieľ pre tento agresívny malignity.

Citácia: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Targeting CDH17 Potláča progresiu nádorov v žalúdku rakovinu Downregulating Wnt /β-katenin. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, United States of America

Prijaté: 22. októbra 2012; Prijaté: 16. január 2013; Uverejnené: 15. Marca 2013

Copyright: © 2013 Qiu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená National Foundation prírodných vied (30672408 až RHX). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete. Hoci sa výskyt rakoviny žalúdka dramaticky poklesol v niektorých vyspelých krajinách v poslednom desaťročí, celkovo jeden milión nových prípadov sa odhaduje, že každým rokom diagnostikuje [1]. Pacienti s týmto ochorením majú často zlú perspektívu, čo predstavuje 10% z celkového počtu úmrtí na rakovinu [2]. Dokonca aj po radikálnej operácii, viac ako polovica pacientov opakovať. Zapojenie lymfatických uzlín, hĺbka invázie tumoru a umiestnenie nádoru boli identifikované ako najvýznamnejšie patologickým prognostických faktorov [3], [4].

Miestne invázie a vzdialených metastáz sa bežne vyskytujú v pokročilom karcinómu žalúdka. Proces invázie a metastáz je zložitý a vyžaduje dysregulácia rôznych bunkových elementov, vrátane kritických adhéznych molekúl. Cadherin patrí k jednej z molekúl rodiny adhéznych a hrá kľúčovú úlohu pri vytváraní interakcie bunka-bunka [5]. Cadherin-17 (CDH17), ktorý je tiež nazývaný pečene-črevo (LI) cadherin alebo ľudský peptidový prenášač-1 (HPT-1), je konštrukčne unikátny členom superrodiny cadherinu [6], [7]. Vzhľadom k tomu, takzvané klasické kadheriny, ako E-, N- a P-cadherinu, päť cadherin looping vnútri extracelulárnej domény, CDH17 sa skladá zo siedmich cadherinových opakuje. Okrem toho, CDH17 má iba 20 aminokyselín v cytoplazmatickej doméne, zatiaľ čo klasické kadheriny majú vysoko konzervatívny cytoplazmatickej doméne sa skladá z aminokyselín 150-160. CDH17 je exprimovaný v myší a človeka takmer výlučne v epitelových bunkách ako embryonálne a dospelých tenkého a hrubého čreva, bez detekovateľné expresie v žalúdku a pečene [8].

Využitie integračnej genomických a proteomických prístupov, výskumníci začali identifikáciu nových onkogény a nádorové supresormi u karcinómu žalúdka. Predchádzajúce štúdie klinických kohorty identifikovaný CDH17 ako potenciálneho markera chorobe u karcinómu žalúdka [9], [10]. Cez tieto významných klinických nálezov, molekulárnej funkcie CDH17 zostávajú neznáme, a jeho úloha v tumorigénny karcinómu žalúdka ešte nebola potvrdená. Tu sme sa zamerali pitvať onkogénne signálne mechanizmy CDH17 v žalúdočnej kontexte karcinómu a hodnotili vplyv cielenie CDH17 ako potenciálny terapeutický prístup pre rakovinu žalúdka.

metódami

Pacienti

Súbor pacientov tvorilo zo 156 po sebe idúcich pacientov (106 mužov a 50 žien) plánovaných na operáciu od 1. januára 2002 do 31. decembra 2006 v Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, Čína. Všetci pacienti zaradení do tohto klinického mali histologicky potvrdené diagnózy primárneho karcinómu žalúdka, ktorý bol ďalej analyzovaný patologicky po operácii. Chirurgia pozostávala z medzisúčtu alebo totálnej gastrektómii u všetkých pacientov; štandardizovaný technika bola použitá pre chirurgické resekciu a lymfadenektómia, ako je popísané na inom mieste [3]. Pacientov, ktorí podstúpili non-resekčných operáciách, a tie s typom Siewerta Aj kardia adenokarcinóm boli zo štúdie vylúčení. veľkostí vzorky a nádorové boli zaznamenané patológov. Boli vybrané reprezentatívne oblasti tumoru a snap-zmrazené. pTNM klasifikácia nasledoval kritériá 6. vydanie UICC [11] .v Priemerný vek pacientov bol 57,2 yrs (rozmedzie 27-78 rokov) vek, pohlavie, typ operácie, umiestnenie nádoru, TNM štádiu, chemoterapia, vzor dĺžka, veľkosť nádoru, a histologické diferenciácie, boli zaznamenané pre každého pacienta v databáze. Všetci pacienti, ktorí podstúpili akýkoľvek typ chemoterapie boli na 5-FU, platina alebo taxolu na báze režimy. Všetci pacienti, po prepustení z nemocnice, vstúpil nadväzujúci program podľa štandardného protokolu [12]. Následná bola uzavretá v apríli 2010. Štúdia bola schválená etickou komisiou v Sun Yat-sen University Cancer Center, všetci účastníci predpokladu, že ich písomný informovaný súhlas s účasťou v tejto štúdii.

bunkových línií a CDH17 protilátka

karcinóm žalúdka bunkové línie, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 a SGC-7901 boli získané z American Type Culture Collection (Manassas, VA), Cancer Research japonskej zdroje Bank (Tokyo, Japonsko) a Peking lekárska univerzita (Peking, Čína). Bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Sigma), doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (Invitrogen) a 1% penicilín-streptomycín (Invitrogen). Myš monoklonálna protilátka proti CDH17 (ab54511) bol od abca (Cambridge, MA).

CDH17 krátka vlásenka RNA (zhrnieme)

pLKO.1 Puro (7 kb) lentivirový konštrukt obsahuje U6 promótor a HIV-1 obalový signál RNA s pruomycin- a ampicillin- etalonovéhodnoty klonovaný 3 'vzhľadom k promótorom ľudskej fosfoglycerát kinázy (hPGK). CpptCTE bol vložený 5 'od promotora hPGK. Ľudské CDH17 Zhrnieme konštrukty boli vytvorené ligácia nasledujúcich žíhané oligomérov do jedinečných miest Agel a ECOR pLKO.1 Puro: CDH17 zhrnieme vpred (5 'CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3) a reverznej (5'-AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3 "). Lentivirové preparáty boli produkované čo-transfekcia pLKO.1 puro prázdnym vektorom s CDH17 zhrnie, a pomocný vírus balenie plazmidy pCMVΔR8.9 a pMG.G (v pomere 10: 10: 1) do buniek 293T. Transfekcia sa uskutočňuje za použitia lipofektaminu a PLUS činidlo (Invitrogen). Lentiviry boli zozbierané po 24, 36, 48 a 60 hodín po transfekciu. Dva ovládacie prvky boli vytvorené, v ktorom sa žalúdočné rakovinové bunky buď neboli liečené, alebo boli transfekovány miešaná necielenej RNAi vektor (Mock). Infekcia bola vykonaná v prítomnosti 8 ug /ml polybrenu. Po infekcii, AGS a MKN-45 bunky boli vybrané pre stabilné expresiu shRNAs za použitia 2 ug /ml puromycin. Bunky sa lyžovali na analýzu western blot 10 dní po infekcii.

imuno-blottingom a subcelulárnu frakcionácie

Proteínové lyzáty boli pripravené z bunkovej línie s použitím monovrstev lyzačného pufru (1% NP-40,50 mM Tris -HCl, pH 8,0, 100 mM fluoridu sodného, ​​30 mM pyrofosfát sodný, 2 mM molybdenan sodný, 5 mM EDTA, 2 mM orthovanadičnan sodný) obsahujúce inhibítory proteázy (10 mg /ml aprotinínu, 10 mg /ml leupeptinu, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid ). Koncentrácie proteínu boli stanovené pomocou proteínového testu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Fragmenty buniek boli podrobené sodík dodecyl sulfacte-elektroforézou na polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE) a separované proteíny boli elektroforeticky prenesené na Immobilon-P membrány (Millipore). Po blokovaní pomocou netučného mlieka, boli membrány inkubované nezávisle na primárnej protilátky P53 (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), cyklin D1 (Santa Cruz SC-753 ), R (Cell Signaling΢9), β-katenin (Zymed, 13 až 8400), GSK3p (Santa Cruz, sz-7291) a p-GSK3p (Ser9) (Cell SignalingΥ6). Membrána bola niekoľkokrát premytá v PBS s 0,1% Tween 20 a prechádzať v LI-COR Odyssey infračervené dvojfarebné detekčný systém termokamery (LI-COR Bioscience) podľa inštrukcií výrobcu.

subcelulárnu frakcionácie sa vykonáva za použitia špecifické lýze buniek nárazníky a opakované odstreďovanie kroky (extrakt stavebnica Nuclear z Active motív, Carlsbad, CA) podľa špecifikácií výrobcu. frakcie buniek sa rozpustí v pufri RIPA, a koncentrácia proteínu bola meraná pomocou BCA proteín kvantifikácie testu. Proteínové extrakty (20 ug) boli ďalej rozpustí v 1 x Laemmliho pufra, podrobí elektroforéze na 10% SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózové membrány, ako je popísané vyššie. Analýza Western blot poly-ADP-ribóza polymerázy (PARP, od Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA) a superoxiddismutázy 2 (SOD2, od ABFrontier, Soul, Kórea) boli vykonané pre potvrdenie príslušné oddelenie jadrových a cytozolové proteíny.

Kvantitatívny reverznej transkripcie-PCR (qPT-PCR)

Celková RNA bola extrahovaná z bunkových línií a mrazené tkaniva adenokarcinóme žalúdka činidlom TRIzolu (Invitrogen). Reverzný transkripcie celkovej RNA (2 Ag) bolo vykonané pomocou výhodu RT PCR kit (Clontech), a cDNA bola podrobená PCR pre 28 cyklov amplifikácie s nasledujúcimi primermi: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC a CHD17 Rv, 5 "-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-aktínu bol použitý ako kontrola.

imunohistochémia (IHC)

Celkom 156 formalínom fixovaných a vzorky tkaniva rakovina žalúdka parafínových boli vybrané pre štúdium IHC. IHC farbenie bolo vykonané na 5 um tkanivových rezoch rehydratovaných cez odstupňovaných alkoholov. Endogénnej peroxidázy aktivita bola blokovaná 0,3% peroxidu vodíka po dobu 15 min. Sklíčka bola MV ošetrené v 10 mM citrátovom pufri (pH 6,0) počas 10 min. Nešpecifická väzba bola blokovaná s 10% normálnym králičím sérom po dobu 20 minút. Sklíčka tkaniva boli inkubované s anti-CDH17 (1:50 riedenie), 60 min pri 37 ° C vo vlhkej komore. Sklíčka bola inkubovaná s biotinylizované králičie anti-myší imunoglobulín v koncentrácii 1: 100 počas 30 minút pri teplote 37 ° C, potom sa nechá reagovať s konjugátom streptavidínu peroxidáze počas 30 minút pri 37 ° C a nakoniec inkubované s 3-3 'Diaminobenzidine ako chromogén substrátom. Ak chcete vylúčiť falošne pozitívny signál, negatívne kontroly boli zahrnuté v každom teste nahradením primárnej protilátku s blokovaním sérum. Dva nezávislí pozorovatelia zaslepenej k patologickým informácií skóroval sklíčka. Definícia farbenie bolo nasledovné: negatívne, s 0% do menej ako 5% nádorových buniek vykazujúcich imunoreaktivita; slabý, 5-40% nádorových buniek vykazujúcich imunoreaktivita; pozitívne, viac ako 40% nádorových buniek vykazujúcich imunoreaktivitu. Pozitívne prípady boli info sub-rozdelené do CDH17 + (imunoreaktivity: 40 - 60%), CDH17 2+ (imunoreaktivita: 60 - 80%) a CDH17 3+ (imunoreaktivita: 80 - 100%).

In in vitro testy pre posúdenie nádorového fenotypu

experimentálne postupy pre bunkový rast, tvorbu ložiskách, mäkkom agare, migráciu buniek, hojenie rán a testy bunkového cyklu sú popísané v podpornej metódy S1.

Záchranné experimenty

záchrana CDH17 v shCDH17 AGS a MKN-45 bunkových línií sú popísané v podpornej metódy S1.

In vivo myších modeloch rakoviny žalúdka

Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami uvedenými v príručke pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat z National Institutes of Health. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách v Sun Yat-sen University Cancer Center (Povolenie číslo: 09-0238). Všetky operácie sa vykonávajú v pentobarbitalu sodného narkóze, a boli vykonané všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia. Po anestézii, Holé myši boli usmrtené cervikálny dislokáciou.

Tvorba nádoru u nahých myší.

in vivo vzniku nádorov bol vyšetrovaný nádorových štepov experimenty. Asi 2 x 10 ^{6 AGS bunky infikované CDH17 zhrnieme, ovládanie AGS bunky infikované predstieranou RNAi vektorom a rodičovskú AGS bunky boli S.C. do pravej a ľavej zadnej nohy 4 týždňov starých holých myší (30 myší, 10 za stavu). Tvorba nádoru u nahých myší bola sledovaná po dobu 8 týždňov. Objem nádoru bol vypočítaný podľa vzorca V = 0,5 x L x W 2. [13]}

nesúcich nádor modelu u myší.

Podkožné nádory boli indukované v nahých myšiach s použitím AGS buniek, ako je uvedené vyššie. Jeden týždeň po naočkovaní boli myši ošetrené anti-CDH17 zhrnieme. Každá myš dostala 100 ul intratumorální injectionscontaining 1 x 10 ^{9 kópií CDH17 alebo falošnom lentivirus, dvakrát týždenne po dobu 2 týždňov. Bolo použité päť myší v každej skupine. Rast nádoru boli denne sledované.}

štatistiky

Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS 13,0. Rozdiely medzi premennými boli hodnotené pomocou X2 analýzou alebo T testov 2-sledoval študenta. Dáta sú uvedené ako priemer ± SD, pokiaľ nie je uvedené inak. Celkového prežívania (OS) a prežívanie bez ochorenia (DFS) krivky boli vypočítané podľa metódy Kaplan-Meier, a rozdiely medzi oboma skupinami boli porovnané pomocou log-rank testu. Hodnota p menšie ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významné.

Výsledky

CDH17 je vysoko exprimovaný v rakovinových bunkách žalúdočnej a súvisí so zlým klinickým výsledkom

Po prvé, sme skúmali hladinu expresie CDH17 vo 156 vzorkách karcinómu žalúdka prostredníctvom IHC: 69 (44,3%) zo 156 prípadov bolo pozitívnych, zatiaľ čo zvyšných 87 prípadoch (55,7%), boli negatívne alebo slabé CDH17 expresiu (obr. 1). Hladina expresie bola +, 2+ a 3+ u 21 (13,5%), 20 (12,8%) a 28 (17,9%) prípadov, resp. Tieto zistenia naznačujú, že CDH17 môže hrať dôležitú úlohu v žalúdku rakoviny vzniku nádorov. Potom sme porovnávali klinické a patologické rysy pacientov s a bez CDH17 výrazu. neboli pozorované žiadne štatisticky významné rozdiely medzi medzi dvoma skupinami čo sa týka pohlavia, vek, veľkosť nádoru, nádorové mieste, hĺbka invázie nádoru, lymfatických uzlín, vzdialené metastázy a TNM fáze (Tabuľka 1).

Ďalej sme skúmali potenciálny dopad CDH17 stavu prejave na dlhodobé prežitie pacientov od jednorozmerné a viacrozmerné analýzy. Medián follow-up bola 24,3 mesiaca, na konci sledovania, 68 pacientov bolo ešte nažive, 87 pacientov zomrelo nádoru, a jeden pacient zomrel z inej príčiny; 5-ročné prežitie rakoviny súvisiace v celej sérii bol 37,8%. Jednorozmerné analýzy ukázali súvislosť medzi celkové prežitie a nádorové mieste, histologické diferenciácie, TNM štádiu a CDH17 výrazu (tabuľka S1). Na základe viacnásobnej analýzy, tumor miesto (p = 0,02), histologické diferenciácie (p = 0,02), TNM fázy (p 0,001) a CDH17 výraz (p 0,01) boli nezávislé prognostické faktory pre celkové prežitie. Obr. 2A ukazuje celkový rozdiel prežitie medzi pacientmi s a bez CDH17 výrazu. Medián celkového prežívania bol 15,9 mesiacov u pacientov s CDH17 výrazom v porovnaní s 26,6 mesiacmi u pacientov CDH17 negatívne alebo slabé vyjadrenie (P 0,01), čo predstavuje zníženie o 16% úmrtnosť. Okrem toho Prežívanie bez príznakov ochorenia (DFS) analýza bola vykonaná u 131 pacientov, ktorí podstúpili resekciu R0. Na konci sledovania, 69 (52,7%) pacientov boli stále nažive a 62 (47,3%) pacientov zomrelo z recidívy alebo vzdialených metastáz, viacrozmerné analýzy ukázali podobné výsledky histologické diferenciácie tumoru miesto, hĺbku invázie tumoru (pT stupeň), lymfatických uzlín (PN stupeň) boli nezávislé prognostické faktory pre prežitie bez známok ochorenia (dáta nie sú uvedené). Tiež sme zistili, že pacienti bez CDH17 expresie majú lepšiu prognózu ako tí, ktorí sa CDH17 expresiu v nádorovom tkanive (obr 2B.) (P 0,01). Celková doba prežitia bola znížená u pacientov s vysokou expresiou CDH17 (IHC 2+, 3+) ako u pacientov s CDH17 + výrazu (obr. 2c). Medián celkového prežitia pacientov, ktorých nádory mali vyššie CDH17 výraz bol 10,9 mesiaca u CDH17 3+, 21.1 mesiacov pre CDH17 2+, a 25,7 mesiacov u tých, ktoré sa CDH17 + výraz (p < 0,01).

CDH17 vyjadrený v ľudských bunkových líniách žalúdočných

Vyhodnotili sme, či ľudské bunkové línie karcinómu žalúdka vyjadriť CDH17 a teda by mohli byť použité na ďalšie hodnotenie potenciálnej funkcie tohto proteínu. Vybrali sme panel 6 žalúdočného karcinómu bunkových línií s rôznym metastatickým potenciálom: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 a SGC-7901. Úroveň CDH17 mRNA bola meraná pomocou QRT-PCR analýzou. Silná expresia bola pozorovaná v primárnom a metastatického karcinómu žalúdka bunkové línie (AGS a MKN-45) (viď obr. S1A). Analýza Western bloty potvrdila vysokú expresiu proteínu v CDH17 AGS (stanovená z primárneho nádoru) a MKCH-45 (metastázujúcej) (obr. S1B).

Dokopy tieto výsledky naznačujú, že CDH17 je dôležité pre iniciáciu a metastázy rakoviny žalúdka; aspoň podmnožina dobre credentialed karcinómu bunkových línií žalúdočných zachováva expresiu CDH17 umožňuje ďalšie funkčné charakterizáciu.

CDH17 knockdown indukuje anti-nádorové účinky in vitro

Ďalej sa zrazil CDH17 v karcinóm žalúdka bunkové línie-AGS a MKN-45 za použitia CDH17 špecifických shRNAs. Knockdown sa získa > 75% zníženie v oboch mRNA a proteínové úrovni (obr. 3A). My potom hodnotila tumorigénny a metastatické vlastnosti (proliferácie, tvorby kolónií, adhézie, invázia a bunkového cyklu) jednotlivých CDH17 deficitných buniek karcinómu žalúdka (shCDH17 buniek) v porovnaní s modelovou kontrolných buniek vektorom infikované.

CDH17 zhrnieme sprostredkovanú knockdown za následok výrazne znížený rast buniek karcinómu žalúdka bunkových línií (P 0,001) (obr 3A, vpravo.). Tvorba ložiská bol tiež významne inhibovaná (P 0,001) v shCDH17 bunkách v porovnaní s modelovými bunkami (obrázok 3B, vľavo). Podobný výsledok bol získaný na mäkkom agare, v ktorom bola tvorba kolónií výrazne znížená v shCDH17 bunkách (p 0,001 na obr. 3B, Right). Úloha CDH17 v metastáz bola študovaná hojenie rán a transwell testy. CDH17 knockdown bol schopný znížiť pohyblivosť buniek (obr. 3C, vľavo), ako bolo stanovené testom rany. Transwell skúška ukázala, že znížená expresia CDH17 výrazne znižuje adhéziu buniek (P 0,001) (obr. 3C, vpravo). Preskúmať mechanizmus stojaci inhibíciu rastu o CDH17 Knockdown, rozvody bunkového cyklu buniek s CDH17 zhrnie vlásenky a Mock bola stanovená pomocou prietokovej cytometrie: shCDH17 bunky boli zatknutí v G0 /G1 fáze, s menším počtom buniek v G2 /M-fáza (obr . 3D). Protinádorový účinok CDH17 Knockdown bola pozorovaná tiež v metastatického karcinómu žalúdka bunkové línie MKN-45 (obr. S2A-E). Podľa uznávaných štandardov, ktoré by poistiť kvalitu a presnosť RNAi experimentov [14], sme vykonali záchranné pokusy znova vyjadrovať CDH17 v AGS a MKN-45 shCDH17 bunky (obr. S3A-B). Obnova CDH17 expresie v AGS a MKN-45 bunky sa vrátil bunky sa rodičovskej fenotyp, čo potvrdzuje, že protinádorové účinky CDH17 Knockdown neboli spôsobené mimo cieľovej účinky. Záchranné experimenty odhalili, že po obnovení CDH17 expresie v týchto dvoch bunkových línií, vyvolanie nádorového bujnenia a metastatického potenciálu zvýši na podobnou úrovňou rodičovských AGS a MKN-45 bunkách (obr. S3C-F). Tieto výsledky poskytujú silný dôkaz o onkogénnych rolí CDH17 v bunkách karcinómu žalúdka.

CDH17 ako in vivo Target pre žalúdočné Cancer Therapy

Skúmali sme, či CDH17 je nutná pre tvorbu nádoru a zasahovanie do bunky karcinómu žalúdka v modeli nahých myší. Máme podkožné injekciou shCDH17, makety a rodičovských buniek AGS do holých myší. Nádory sú zvyčajne viditeľné makroskopicky v chrbtovej boky v 6-8 týždňov období injekciu buniek. 1 myš z oboch rodičovských AGS a Mock skupín zomrelo počas tretieho týždňa po (boli použité humánne koncové body) injekcie. Myšiam bolo zabitých 8 týždňov po injekcii nádorových buniek. V skupine myší injikovaných bunkami shCDH17, 2 myši zobrazené žiadne nádorové uzlík a 8 myši vykazovali významne zníženú tvorbu nádoru v porovnaní s myšou injektovaných s modelovými bunkami. Veľkosť a hmotnosť nádoru sa významne znížili u myší s injekciou shCDH17 bunkami v porovnaní s myšou injektovaných s modelovými bunkami (obr. 4a). Tieto výsledky ukazujú, že zníženie expresie CDH17 môže výrazne potlačiť tumorigeničnosti in vivo.

Pre ďalšie hodnotenie účinku CDH17 Knockdown na primárny rast nádoru, potom sme skúmali, či in vivo dodávanie CDH17 zhrnieme mohlo brániť rastu po dosiahnutí založená tumor xenografe z rodičovských buniek AGS u nahých myší. Jeden týždeň po inokulácii nádoru, kedy nádor dosiahol približne 100 mm ^{3, sme vykonali intratumorální injekciu CDH17 zhrnieme alebo predstieranou vektora v dávke 10 9 vírusové častice /injekcia v mieste nádoru. Injekcia sa podáva dvakrát týždenne po dobu 2 týždňov. U zvierat injikovaných s modelovou vektorom, nádory narástli postupne v priebehu experimentu. Naopak, intratumorální injekcie CDH17 zhrnieme za následok významne menšie nádory na každom časovom okamihu, vrátane merania konečný objem (obr. 4B). Vyšetrenie nádorových buniek CDH17 IHC demonštroval pozoruhodnú down-reguláciu zamýšľaného cieľa CDH17 v ošetrených shCDH17 buniek (P 0,05; obr. 4B). Tieto výsledky ukazujú, že in vivo downregulace CDH17 do buniek karcinómu žalúdka znižuje tvorbu nádorov u myší, čo znamená, že CDH17 je terapeutickým cieľom pre rakovinu žalúdka.}

Down-regulácia Wnt /β-katenin podľa CDH17 príklepu

vypočúvali sme niekoľko ciest, aby sa zistilo molekulárnej mechanizmus CDH17 porazený sprostredkovanej inhibície žalúdočnej rastu rakoviny, proliferáciu a metastáz. Zistili sme niekoľko členov Wnt /β-katenin dráhy, ktoré majú byť rôzne vyjadrená medzi shCDH17 a rodičovských buniek. β-katenin výraz, GSK-3β fosforylácie, a expresie cyklín D1 znížil; a Rb expresie zvýšila v oboch AGS a MKN-45 bunkách shCDH17. Okrem toho, expresia p53, MDM2 a kľúče regulátor bunkového cyklu p21 zvýšenej v CDH17-knockdown buniek. (Obr. 5A). V TOPFlash /FOPFlash reportér luciferázy testu (obr. 5B), obnova CDH17 v oboch AGS a MNK-45 buniek, výrazne zvýšila pevnosť TCF /LEF signály v porovnaní s kontrolami shCDH17. Okrem toho, ako je znázornené prostredníctvom imunoblotovou analýzou sme zistili, nárast celkovej i jadrovej β-katenin proteínu po obnovení CDH17 v AGS a MKN-45, v porovnaní s shCDH17 (obr. 5c), sú tieto výsledky .Together ukazujú, že CDH17 porazený výsledky downregulace Wnt /β-katenin dráhe u buniek karcinómu žalúdka. To zase naznačuje, že CDH17 udržiava proliferačnej potenciál cez Wnt /β-katenin dráhy signalizácie.

Diskusia

CDH17 je nový cadherinu, jeho štruktúra sa líši od tých klasických kadheriny sa tým, že N-koncová doména a cytoplazmatická časť zobrazuje žiadnu významnú homológie s klasickým kadheriny [6]. Biologická funkcia CDH17 je stále neznámy. Početné štúdie preukázali zvýšené hladiny CDH17 v rôznych ľudských nádorov, spájajúce expresiu tohto proteínu k prognóze a rizík POSÚDENIE [10], [15]. CDH17 nadmerná expresia bola zaznamenaná u adenokarcinóme žalúdka [9], hepatocelulárny karcinóm [16] a kolorektálneho karcinómu [17]. To znamená, že CDH17 môže byť rozhodujúce v tumorigenezi žalúdku a rakovina pečene.

U ľudí, CDH17 je normálne exprimovaný výlučne na bazolaterálnou povrchu hepatocytov a enterocytov. Po prvej správe CDH17 ako črevnú metapasia označeného Grotzinger et al [9], niektoré výskumy hodnotená CDH17 expresiu v karcinómu žalúdka. CDH17 bola vyjadrená v 50-78% žalúdočných rakovinové tkanive črevnými typu prevahou [18], [19]. V tejto štúdii sme ukazujú, že CDH17 je onkogén a atraktívnym terapeutickým cieľom v karcinómu žalúdka: CDH17 je vysoko exprimovaný v nádorovom tkanive, s takmer polovica karcinómov žalúdka bytia CDH17 pozitívny IHC. Park a kolegovia hodnotí expresiu CDH17 vo viac ako 200 vzoriek žalúdočnej karcinóm tkanív, a uvádzajú, že sa vysoko exprimovaný v skorších fázach TNM [20], Okrem toho sa zistilo, že znížená expresia CDH17 bolo preukázané, že je úzko spojená s nádorovú agresivitou a lymfatických uzlín ľudského karcinómu žalúdka [20]. Avšak, zatiaľ čo iní uviedli, že jeho expresia bola oveľa vyššia v pokročilom lymfatických uzlín [18], [21]. V našej štúdii, nebol žiadny vzťah medzi expresiou CDH17 a ďalšie klinicko-funkcií.

Ako prognostický faktor, CDH17 expresie vykazovali tendenciu k indikátora nepriaznivé prežitie v rôznych kohorty pacientov, a to aj po kontrole štádiom nádoru. V tejto súvislosti je medián celkového prežívania 15,9 mesiacov v skupine s pozitívnym výrazom CDH17, vs. 26,6 mesiacov u pacientov s nádormi IHC negatívnymi predstavuje klinicky významný vzťah. Okrem toho, prieskumný analýza ukázala, zlé celkové prežívanie u pacientov s vysokou expresiou CDH17 proteínu (IHC 2+ a 3+) v porovnaní s pacientmi s nízkou expresiou CDH17 proteínu (IHC +). Tieto zistenia sú pozoruhodné vzhľadom na zlou prognózou tejto populácii. Súhrnne CDH17 výraz je užitočný prognostický marker v karcinómu žalúdka, a zdá sa, že v súvislosti s progresiou nádoru.

Táto štúdia ukazuje, že zhrnieme sprostredkované CDH17 vyraďujúce vo vysoko tumorigénny karcinómu žalúdka bunkové línie AGS a MKN-45 by mohli účinne potláčajú rast buniek, znižujú tvorbu ložísk a tvorby kolónií v mäkkom agare, rovnako ako invazívnosti a metastatického karcinómu žalúdka schopnosť in vitro. G1-S fázový prechod je hlavný kontrolný bod pre progresiu bunkového cyklu a p21 je jedným z kritických negatívnych regulátorov počas tohto prechodu [22]. Hlavné bunkového cyklu účinok CDH17 Knockdown je inhibícia G1-S fázového prechodu prostredníctvom aktivácie p21 bola potvrdená štúdiou blot (viď obr. 5). Nedávna štúdia v HCC bunkách zistené, že deplécia CDH17 viedla k inhibíciu invázie, rastu a metastáz u MHCC97H hepatocelulárneho karcinómu buniek [16]. CDH17 je pozitívny regulátor pre sťahovavé, vrstvou lepidla a invazívne správanie. Je možné, že v súlade s N-cadherinu. V prípade rakoviny žalúdka, CDH17 môže sprostredkovať interakciu s karcinómom žalúdka stróma a podieľať sa na podpore žalúdka nádorových metastáz tým, že uľahčuje migráciu karcinóm a obnovovať homophilic adhéziu bunka-bunka v metastáz. Naše štúdie poskytujú nový pohľad na jej potenciálnu úlohu v žalúdku iniciácii a progresii rakoviny. Podľa našich výsledkov, CDH17 je onkogén a atraktívnym terapeutickým cieľom v karcinómu žalúdka.

V súlade s tým, predpokladáme, že zacielenie CDH17 môžu byť použité na liečbu rakoviny žalúdka in vivo. myšou modely rakoviny žalúdka boli použité na overenie účinku zacielenie CDH17 ako potenciálny liečbu. Infekcia žalúdka karcinómu buniek CDH17 zhrnieme zrušený ich karcinogénny u myší. U myší s nádorom, miestne dodávanie lentivirové báze CDH17 zhrnieme inhibuje rast nádoru, čo ukazuje výrazný vplyv na potlačenie tvorby nádoru. Tieto zistenia majú významné klinické dôsledky pre liečbu rakoviny žalúdka. V súčasnej dobe existuje iba jeden schválený FDA cielenej terapie pre liečbu podskupiny karcinómu žalúdka: trastuzumab, monoklonálne protilátky, ktorá by ovplyvňovala HER2 receptoru. Bohužiaľ, HER2-exprimujúce tumory sú zriedkavé, len 22% rakovinou žalúdka by mohli mať prospech z tejto terapie [23]. Na rozdiel od toho CDH17 bol vysoko exprimovaný v karcinómu žalúdka v takmer 50% pacientov (tabuľka 1) .Currently, štandardná liečba karcinómu žalúdka zahŕňa operáciu s optimálnym debulking ochorenie s následnou cytotoxickou terapiou. Napriek týmto snahám, 80% pacientov s diagnózou rakoviny žalúdka rozvíjať recidivujúce ochorenie a iba 20% z týchto pacientov prežije 5 rokov po stanovení diagnózy [24]. Naše výsledky silne naznačujú, že pacienti s rakovinou žalúdka môžu mať prospech z cielenej terapie proti CDH17, a zaručujú skúmanie a návrh možných inhibítorov CDH17.

Molekulárne mechanizmy, ktorými CDH17 upravuje žalúdočnú rast rakoviny zostáva objasniť. Nedávna správa ukázala, trans-interakciu medzi E-cadherinu a CDH17 v enterocytoch pri vývoji črevného epitelu [25], [26], čo naznačuje, že CDH17 môže pretínať Wnt dráhy prostredníctvom koordinácie s E-cadherinu a /alebo súvisiace partneri. Predchádzajúce štúdie zistila, že zacielenie CDH17 inaktivuje Wnt /β-katenin v hepatocelulárneho karcinómu [16]. Aktivácia /β-katenin Wnt sa nachádza v asi 30% rakoviny žalúdka, a transgénne zvieracie modely tiež ukázali, že Wnt signalizácie podporuje žalúdočnú karcinogenéze [27].

• Ploche ONE: Caveolin-1 hladinou expresie pri karcinóme pridružených fibroblasty predpovedá výsledok u rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Fáza II štúdie hodnotiace 2 dávkovacej schéme orálneho Foretinib (GSK1363089), cMet /VEGFR2 inhibítora, u pacientov s metastatickým rakoviny žalúdka