PLoS One: célzás CDH17 gátolja a tumor progressziója gyomorrákban által mTOR gátlása miatt csökken Wnt /β-Catenin Signaling

absztrakt katalógusa

Cél katalógusa

A gyomorrák továbbra is az egyik fő oka a daganatos halálok világszerte. A betegeknél általában késő helyi invázió vagy áttét, amelyek nincsenek hatékony terápiák állnak rendelkezésre. Következő előző tanulmányok azonosított adhéziós molekula Cadherint-17 (CDH17) mint potenciális marker gyomorrák végeztünk proof-of-elv kidolgozására vonatkozó tanulmányok racionális terápiás megközelítések célzás CDH17 kezelésére a betegség. Katalógusa

Módszerek

az immunhisztokémiai használták, hogy tanulmányozza a kifejeződése CDH17 156 gyomor carcinoma, és a kapcsolat a túlélés és CDH17 kifejeződését vizsgáltuk többváltozós elemzéseket. A hatás a RNS-interferencia-mediált kiütése CDH17 szóló proliferációját gyomorkarcinóma sejtvonalak vizsgáltuk in vitro és in vivo körülmények között, valamint a hatások a downstream jelátvitelt immunoblot.

Eredmények

CDH17 következetesen fel szabályozott humán gyomorrák és a teljes túlélés betegeknél CDH17 upreguláció gyengébb volt, mint azoknál, akik nem kifejeződése ez gén (5 év teljes túlélési arány 29,0% vs. 45,0%, P < 0,01). Funkcionális vizsgálatok kimutatták, hogy a CDH17 kiütése gátolta a sejtburjánzást, tapadás, a migráció, invázió, clonogenicity és indukálják G0 /G1 letartóztatását. Egereken, shRNS közvetített CDH17 knockdown markánsan gátolja a daganat növekedését; intratumorális injekciót CDH17 shRNS eredményez jelentős tumorellenes hatását transzplantált tumor modellekben. A tumorellenes mechanizmusa CDH17 gátlása vonja inaktiválása Wnt /β-catenin jelátvitel. Katalógusa

Következtetés

Eredményeink azonosítani CDH17 biomarkere gyomorrák és vonzó terápiás célpont agresszív rosszindulatú.

bevezető hivatkozás: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) célzás CDH17 gátolja a tumor progressziója gyomorrákban által mTOR gátlása miatt csökken Wnt /β-Catenin jelzés. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959 katalógusa

Szerkesztő: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: október 22, 2012; Elfogadva: január 16, 2013; Megjelent: március 15, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Qiu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány (30672408 a RHX). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb daganatos halálok a világon. Bár az előfordulási gyakorisága a gyomorrák drámaian csökkent néhány fejlett országokban az elmúlt évtizedben összesen egy millió új esetet becslések szerint évente diagnosztizált [1]. Ilyen betegségben szenvedő betegeknél általában a rossz kilátások, számviteli 10% -át a rákos halálesetek [2]. Még azután radikális műtét, több mint a fele a betegek visszatérnek. Nyirokcsomó-érintettség, mélysége tumor invázió és a tumor helyét azonosították a legjelentősebb klinikopatológiai prognosztikai tényezők [3], [4]. Katalógusa

A helyi invázió és távoli áttétek gyakran előfordul a fejlett gyomorrák. A folyamat a invázió és metasztázis bonyolult, és előírja, hogy a szabályozási zavarának különféle sejtes elemek beleértve a kritikus adhéziós molekulák. Cadherin közé tartozik, adhéziós molekula családok és döntő szerepet játszik kialakításában a sejt-sejt kölcsönhatás [5]. Cadherin-17 (CDH17), amely más néven máj-bél (LI) cadherin vagy humán peptid transzporter-1 (HPT-1), egy szerkezetileg egyedi tagja a cadherin szupercsalád [6], [7]. Mivel az úgynevezett klasszikus kadherinek, például E-, N- és P-kadherin, öt cadherin belüli ismétlődésekkel extracelluláris domén, CDH17 áll hét cadherin ismétlődik. Sőt, CDH17 csak 20 aminosavat a citoplazmatikus domén, mivel a klasszikus kadherinek van egy erősen konzervált citoplazmatikus domén, amely 150-160 aminosavak. CDH17 van kifejezve egérben és emberben szinte kizárólag hámsejtjeiben mind az embrionális és felnőtt vékonybél és a vastagbél, és nem detektálható expresszióját a gyomorban és májban [8].

Kihasználva integratív genomikus és proteomikai megközelítések, a kutatók folynak a regény onkogének és tumor szupresszor gyomorrákban. Korábbi tanulmányok klinikai kohorsz azonosított CDH17 mint potenciális betegség marker gyomor karcinóma [9], [10]. Annak ellenére, hogy ezek a jelentős klinikai tünetek, a molekuláris funkcióit CDH17 ismeretlenek maradnak, és tumorképző szerepet gyomorrák még nem erősítették meg. Itt törekedtünk, hogy elemezzék az onkogén jelátviteli mechanizmusok CDH17 a gyomorrák összefüggésben, és értékelte a hatását célzó CDH17 potenciális terápiás megközelítést gyomorrák. Katalógusa

Módszerek katalógusa

A betegek katalógusa

A vizsgálati populáció 156 egymást követő beteg (106 férfi és 50 nő) tervezett sebészet 2002. január 1. és 2006. december 31-Szun Jat-szen Egyetem Rákkutató Központ, Guangzhou, Kína. Minden beteget vontak be ebbe a vizsgálatba beválasztott szövettanilag igazolt diagnózis elsődleges gyomorrák, hogy tovább elemeztük kórosan műtét után. A sebészeti beavatkozás részösszeg vagy teljes gastrectomia minden betegnél; standardizált technikát alkalmaztunk a sebészi eltávolítását és nyirokcsomó-eltávolítás, amit a leírásban máshol [3]. Átesett betegek nem reszekciós műtét, és azokat a Siewert I-es típusú cardia adenocarcinoma kizártuk a vizsgálatból. Minták és a tumor méretét feljegyeztük a patológusok. Reprezentatív területek a daganat választottak ki, és beépülő modul fagyott. pTNM besorolás követte a kritériumoknak a 6. kiadás a UICC [11] .A medián betegek életkora 57,2 év (tartomány: 27-78 év) életkor, a nem, a műtét típusa, lokalizációja, TNM, kemoterápia, mintadarab hossz, a daganat mérete, és szövettani differenciálás, feljegyeztük minden beteg esetében egy adatbázisban. Minden beteg átesett bármilyen típusú kemoterápia voltak az 5-FU, platina vagy taxol-alapú sémák. Minden beteg, miután a kórházból való kikerülés, belépett egy nyomon követési program standard protokoll szerint [12]. Az utánkövetés zárva volt 2010 áprilisában jóváhagyta a vizsgálatot az etikai bizottság Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center, minden résztvevő, ha azok írásos beleegyezést, hogy vegyenek részt a vizsgálatban. Katalógusa

Sejtvonalak és CDH17 ellenanyag

gyomor karcinóma sejtvonalakban, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823, SGC-7901 kaptuk az American Type Culture Collection (Manassas, VA), japán Cancer Research Resources Bank (Tokió, Japán) és Peking Orvostudományi Egyetem (Peking, Kína). A sejteket RPMI 1640 tápközegben (Sigma), kiegészítve 10% borjúembrió-szérumot (Invitrogen) és 1% penicillin-sztreptomicin (Invitrogen). Egy egér monoklonális antitest CDH17 (ab54511) származott ABCAM (Cambridge, MA). Katalógusa

CDH17 rövid hajtű-(shRNS) hotelben

A pLKO.1 puro (7 KB) Lentivirális konstrukciót tartalmaz U6 promoter és a HIV-1 RNS csomagolás jel pruomycin- és ampicillin- rezisztencia elemek klónozott 3 'a humán foszfoglicerát kináz (hPGK) promoter. Egy cpptCTE beillesztett 5 'hPGK promóter. Emberi CDH17 shRNS konstrukciót által generált összekapcsoljuk a következő lágyított oligomerek egyedi Agel és EcoRI helyei pLKO.1 puro: CDH17 shRNS előre (5'CCG GCC ACT TTC ATA TCC GTC GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G-3 ') és reverz (5'AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GTC GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G-3'). Lentivirális készítményeket állítottak elő co-transzfektáló pLKO.1 Puro üres vektort CDH17 shRNS és helper vírus csomagolás plazmidok pCMVΔR8.9 és pMG.G (egy 10:10:01 arányban) a 293T sejtekben. A transzfekciót végeztünk Lipofectamine és PLUS reagens (Invitrogen). Lentivírusok szüretelték 24, 36, 48 és 60 órával a transzfekció után. Két kontrollt létre, amelyben a gyomor rákos sejtek vagy semmilyen kezelést nem kaptak, vagy transzfektáltunk kódolt, nem célzott RNSi vektorba (Mock). Fertőzés végeztük jelenlétében 8 ug /ml polibren. A fertőzést követően, AGS és MKN-45 sejteket választottunk ki stabil expresszióját shRNS segítségével 2 ng /ml puromicin. A sejteket lizáltuk Western blot analízis 10 nappal a fertőzés után.

immunoblot és szubcelluláris frakcionálást

Protein lizátumokat készítünk sejtvonal egyrétegű felhasználásával lízis-pufferben (1% NP-40,50 mM Tris HCl, pH = 8,0, 100 mM nátrium-fluorid, 30 mM nátrium-pirofoszfát, 2 mM nátrium-molibdát, 5 mM EDTA-t, 2 mM nátrium-ortovanadátot) proteáz inhibitorokat tartalmazó (10 mg /ml aprotinin, 10 mg /ml leupeptin, 1 mM fenil-metil-fluorid ). A protein koncentrációt határoztuk meg Bio-Rad fehérje vizsgálati (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). A sejtlizátumokat vetjük alá nátrium-dodecil-sulfacte-poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE), és az elválasztott fehérjéket elektroforetikusan átvittük Immobilon-P membránokra (Millipore). Blokkolás után a nem-zsír tej, a membránokat inkubáltuk függetlenül primer antitestek p53 (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), ciklin D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling΢9), β-catenin (Zymed, 13-8400), GSK3p (santa Cruz, SZ-7291) és p-GSK3p (Ser9) (Cell SignalingΥ6). A membránt többször mossuk PBS-ben, 0,1% Tween-20 és a beolvasott az LI-COR Odyssey infravörös kétszínű kimutatási Imager rendszer (LI-COR Bioscience) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.

szubcelluláris frakcionálás alkalmazásával végeztük specifikus sejt lízis puffereket és ismételt centrifugálással lépéseket (Nuclear kivonat készlet Active motívumot, Carlsbad, CA), a gyártó előírásai szerint. Sejt-frakciókat feloldottuk RIPA-pufferben, és a fehérje koncentráció alkalmazásával mértük BCA fehérje mennyiségi meghatározását vizsgálatban. Kivonatok (20 ug) adtunk további feloldunk 1 × Laemmli-puffer, elektroforézisnek vetjük alá 10% -os SDS-PAGE és nitrocellulóz membránokra visszük át a fent leírt módon. Western-blot analízis a poli-ADP-ribóz polimeráz (PARP, a Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) és a szuperoxid-dizmutáz 2 (SOD2, származó ABFrontier, Szöul, Korea) végeztünk, hogy erősítse meg a megfelelő szétválasztása a nukleáris és a citoszol fehérjék.

kvantitatív reverz transzkripciós PCR (qPT-PCR)

Teljes RNS-t extrahálunk sejtvonalakat és fagyasztott gyomor adenokarcinóma szövetek által a TRIzol reagenssel (Invitrogen). Reverz transzkripció A teljes RNS-t (2 Ag) alkalmazásával végeztük Advantage RT PCR készlettel (Clontech), és a cDNS-t vetettünk alá PCR-28 amplifikációs ciklus a következő primerekkel: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC és CHD17 Rv, 5 "-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-aktin használtunk kontrollként.

immunhisztokémiai (IHC)

Az összesen 156 formalin-fixált és paraffinba ágyazott gyomorrák szövetmintákban választottak ki IHC tanulmány. IHC festést végeztünk az 5-um szöveti metszetekben rehidratált keresztül osztályozni alkoholok. Az endogén peroxidáz aktivitást blokkoljuk 0,3% -os hidrogén-peroxid-on 15 percig. A metszeteket mikrohullámú kezeltük 10 mM citrát pufferrel (pH = 6,0) 10 percig. A nemspecifikus kötődést blokkoltuk 10% normál nyúl szérummal 20 percig. A szövet metszeteket anti-CDH17 (1:50 hígítás) 60 percen át 37 ° C-on nedves kamrában. A metszeteket biotinilált nyúl anti-egér immunglobulin koncentrációjú 1:100 30 percen át 37 ° C-on, majd reagáltatjuk egy streptavidin-peroxidáz konjugátum 30 percen át 37 ° C-on, és végül inkubáltuk 3-3 'diamino-benzidint egy kromogén szubsztrát. Ahhoz, hogy kizárja a hamis pozitív jel, negatív kontrollokat minden vizsgálat helyett a primer antitestet blokkoló szérum. Két független megfigyelők ismerte a klinikai és patológiai adatok szerezte a diákat. A meghatározás a festődés a következő volt: negatív, 0% -a és kevesebb mint 5% a tumorsejtek mutató immunreaktivitást; gyenge, 5-40% a tumorsejtek mutató immunreaktivitást; pozitív, több mint 40% a tumorsejtek mutató immunreaktivitást. A pozitív esetet További részletes al-sorolni CDH17 + (immunreakció: 40-60%), CDH17 2+ (immunreakció: 60-80%) és CDH17 3+ (immunreakció: 80-100%). Katalógusa

vitro vizsgálatokban, hogy értékelje a tumor fenotípus

a kísérleti eljárások a sejtnövekedést, gócok kialakulása, lágy agar, sejtmigráció, sebgyógyulás és a sejtciklus-vizsgálatokat ismertet az igazoló Methods S1.

mentési kísérletekben

a mentési CDH17 a shCDH17 AGS és MKN-45 sejtvonalak ismerteti a támogató módszerek S1. katalógusa

in vivo egér modellek gyomorrák katalógusa

Ez a tanulmány végre szigorú ajánlásaival összhangban az útmutató az ápolási és a laboratóriumi állatok felhasználását a National Institutes of Health. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai állatkísérletek Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center (engedély száma: 09-0238). Minden műtét alatt végeztük nátrium pentobarbitál érzéstelenítés, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Miután érzéstelenítés, Nude egereket leöltük nyaki diszlokáció.

daganatképződés csupasz egerekben.

Az in vivo tumorigenezis vizsgáltuk tumor xenograft kísérletek. Mintegy 2 × 10 ^{6 AGS fertőzött sejtek CDH17 shRNS, ellenőrzés AGS fertőzött sejtek ál RNAi vektor és a szülői AGS sejteket s.c. a jobb és bal oldali hátsó lábak 4-hetes csupasz egerekbe (30 egerek, 10 per feltétel). Tumorképződést nude egerekben követtük felett egy 8 hetes időszak alatt. A tumor térfogatát úgy számítottuk ki, a V = 0,5 × L × W 2. [13]}

tumorhordozó egér modellben.

Szubkután tumorokat indukált meztelen egerekben használva AGS sejteket, mint fent említettük. Egy héttel a beoltás után, az egereket kezeltünk anti-CDH17 shRNS. Minden egérnek 100 ul intratumorális injectionscontaining 1 × 10 ^{9 példányt CDH17 vagy ál lentivírus, hetente kétszer 2 héten át. Öt egeret használtunk minden egyes csoportban. A tumor növekedését naponta ellenőrizzük. Katalógusa}

Statisztika katalógusa

A statisztikai elemzéseket SPSS 13.0. Különbségek a változók közötti értékelték χ2 analízissel vagy 2 Student-féle t-próbát. Az adatokat az átlag ± SD, kivéve, ha másként nem jelezzük. A teljes túlélés (OS) és betegségmentes túlélés (DFS) görbéket a Kaplan-Meier-módszerrel, és a különbség a két csoport között hasonlítottuk össze log-rank teszt. A p-érték kevesebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

CDH17 erősen kifejezett gyomor karcinóma sejteket és kapcsolatban van a rossz klinikai eredmény katalógusa

Először is, megvizsgáltuk az expressziós szintjének CDH17 156 gyomorrákos mintákban IHC: 69 (44,3%) a 156 pozitív volt, míg a fennmaradó 87 esetben (55,7%) negatív vagy gyenge CDH17 kifejezés (1.). Az expresszió szintje volt +, 2+ és 3+ 21 (13,5%), 20 (12,8%) és 28 (17,9%) esetben volt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy CDH17 lehet fontos szerepet játszanak a gyomorrák tumorigenezis. Ezután összehasonlították a klinikai és patológiai jellemzői a betegek anélkül CDH17 kifejezést. Nem statisztikailag szignifikáns különbség volt megfigyelhető a két csoport között, tekintettel a nem, az életkor, a tumor mérete, telek, mélysége tumor invázió, nyirokcsomó áttét, távoli áttétek és TNM (1. táblázat). Katalógusa

Továbbá, megvizsgáltuk a lehetséges hatását CDH17 kifejezés állapotát a hosszú távú túlélés a egyváltozós és többváltozós analízis. Medián követési idő 24,3 hónap végén a nyomon követés, 68 beteg még életben voltak, 87 beteg halt meg a daganat, és 1 beteg halt meg más ok A rákkal kapcsolatos 5 éves túlélési aránya a teljes sorozat 37,8%. Az egyváltozós elemzések azt mutatták közötti társulás teljes túlélést és a tumor helyén, szövettani differenciálás, TNM és CDH17 kifejezés (táblázat S1). A többváltozós elemzések, daganat helyén (p = 0,02) szövettani differenciálás (p = 0,02), TNM (p < 0,001) és CDH17 kifejezés (p < 0,01) független prognosztikai tényezők teljes túlélés. Ábra. 2A mutatja be a teljes túlélési különbség a betegek és a nélkül CDH17 kifejezést. A teljes túlélés középértéke 15,9 hónap betegeknél CDH17 kifejezés képest 26,6 hónap azokban CDH17 negatív vagy gyenge kifejezés (P < 0,01), ami 16% -kal csökkent a halálozás. Továbbá, a betegségmentes túlélés (DFS) analízist 131 átesett betegek R0 reszekció. Végén a nyomon követés, 69 (52,7%) beteg még él, és 62 (47,3%) beteg halt meg daganatos kiújulás vagy a távoli áttét, többváltozós elemzések azt mutatták, hasonló eredmények, szövettani differenciálás, a tumor helyén, mélysége tumor invázió (pT) fázisban, nyirokcsomó-áttétek (pN szakasz) független prognosztikai tényezői betegségmentes túlélés (nem közölt adatok). Azt is megállapították, hogy a betegek nem CDH17 kifejezés jobb prognózissal, mint azok, akik a CDH17 kifejezés a tumor szövetben (ábra. 2B) (p < 0,01). A teljes túlélés csökkent a betegek magas kifejezése CDH17 (IHC 2+, 3+) betegeknél, mint a CDH17 + kifejezése (ábra. 2C). A medián teljes túlélés betegek, akiknek a daganata volt magasabb CDH17 kifejezés 10,9 hónap volt a CDH17 3+, 21,1 hónap CDH17 2+, és 25,7 hónap számára kijelölt legyen CDH17 + kifejezés (p < 0,01). Katalógusa

CDH17 kifejezett humán gyomor sejtvonalakban

értékeltük, hogy az emberi gyomor karcinóma sejtvonalak kifejezni CDH17 és így lehetne használni, hogy tovább értékeljük a potenciális funkció ez a fehérje. Azért választottuk a testület 6 gyomorrák sejtvonalak különböző metasztatikus potenciállal: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823, SGC-7901. CDH17 mRNS szintje mértük QRT-PCR elemzést. Erős expresszió volt megfigyelhető az elsődleges és áttétes gyomor karcinóma sejtvonal (AGS és MKN-45) (ábra. S1A). Western blot analízis megerősítette magas CDH17 protein expresszió AGS (létrehozott egy primer tumor) és MKN-45 (metasztatikus) (ábra. S1B).

Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CDH17 fontos az iniciációs és metasztázis gyomorrák; legalább egy része jól minősítéssel gyomor karcinóma sejtvonalak megtartja kifejezése CDH17, amely lehetővé teszi a további funkcionális jellemzése. katalógusa

CDH17 kiütése indukál tumorellenes hatását in vitro katalógusa

Továbbá, mi leütötte CDH17 a gyomor carcinoma sejtvonalakon-AGS és MKN-45 segítségével CDH17-specifikus shRNS. Az akciós engedett > 75% -os csökkentése mRNS és fehérje szinten (3A.). Mi majd értékelte a daganatkelto és metasztatikus tulajdonságai (proliferáció, kolónia kialakítása, tapadás, invázió és a sejtciklus) a CDH17 hiányos gyomorrák sejtek (shCDH17 sejtek) képest ál vektor-fertőzött kontroll sejtekhez. Katalógusa

CDH17 shRNS -mediált knockdown eredményezett jelentősen csökkentette a sejtek növekedését a gyomor karcinóma sejtvonalak (P < 0,001) (3A. ábra, jobbra). Foci képződés is szignifikánsan gátolta (P < 0,001) shCDH17 sejtekben összehasonlítva Mock sejtek (ábra. 3B, bal) hasonló eredményt kapunk, a lágy agar, amelyben a kolónia képződését szignifikánsan csökkent shCDH17 sejtekben (P < 0,001 mutatja be. 3B, jobb). A szerepe CDH17 metasztázisban vizsgáltuk sebgyógyulás és Transwell vizsgálatokban. CDH17 knockdown képes volt csökkenteni sejt mobilitás (3C., Bal) által meghatározott seb vizsgálattal. Transwell assay során kiderült, hogy a csökkent expressziója CDH17 jelentősen csökkenti sejtadhézió (P < 0,001) (3C., Jobbra). Ahhoz, hogy vizsgálja meg a alapjául szolgáló mechanizmus okozta növekedési gátlással CDH17 knockdown, a sejtciklus eloszlása ​​sejtek CDH17 shRNS hajtű és Mock kerültek áramlási citometriával meghatározva: shCDH17 sejteket letartóztatták G0 /G1 fázisban, kevesebb sejtek G2 /M-fázisban (ábra . 3D). A tumorellenes hatását CDH17 kiütése is látható volt a metasztatikus gyomor-sejtvonal MKN-45 (ábra. S2A-E). Az elfogadott szabványoknak, amelyek biztosítják a minőséget és pontosságot RNSi kísérletek [14], végeztünk mentési kísérleteket újra kifejező CDH17 AGS és MKN-45 shCDH17 sejtek (ábra. S3A-B). Restaurálása CDH17 expresszió AGS és MKN-45 sejtek visszatért a sejteket a szülői fenotípus, amely megerősíti, hogy az anti-tumor hatását CDH17 kiütése nem voltak miatt le cél hatásokat. A mentési kísérletek során kiderült, hogy a helyreállítás után a CDH17 kifejezés e két sejtvonalakban a tumorképző és metasztatikus potenciállal emelkedett hasonló mértékű szülői AGS és MKN-45 sejtek (ábra. S3C-F). Ezek az eredmények szilárd bizonyíték onkogén szerepét CDH17 a gyomor karcinóma sejteket. Katalógusa

CDH17 mint In vivo gyomorrák Therapy katalógusa

Megvizsgáltuk, hogy CDH17 szükséges daganatképződés és invazív in gyomor karcinóma sejtek csupasz egerekbe modell. Mi szubkután shCDH17, Mock és a szülői AGS sejtek csupasz egerekben. Daganatok egymással szokásosan látható makroszkopikusan a dorzális szegélyezi belül 6-8 hét alatt a sejtek injekciót. 1 egér mind a szülői AGS és Mock csoportok meghalt a harmadik héten az injekció beadása után (kíméletes végpontok használtuk). Az egereket megölték 8 hét után a tumorsejtek injekciót. Abban a csoportban az egerek injekciózott shCDH17 sejtek, 2 egerek nem tumor göb, és 8 egér mutatott szignifikáns csökkentett daganatképződés összehasonlítva injektált egerekben mock sejteket. A daganatok méretét és súlyát szignifikánsan csökkent az egerek injekciózott shCDH17 sejtek összehasonlítva beinjekciózott egerek mock-sejtek (ábra. 4A). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a csökkentés CDH17 expresszió jelentősen elnyomja tumorképző in vivo.

Ahhoz, hogy tovább hatásának értékelésére CDH17 kiütése az elsődleges tumor növekedését, akkor majd vizsgáltuk, hogy in vivo bejuttatására CDH17 shRNS akadályozhatja a növekedés egy létrehozott tumor xenograft a szülői AGS sejtek csupasz egerekbe. Egy héttel a daganat beoltása után, amikor a tumor elérte a mintegy 100 mm ^{3, végeztünk egy intratumorális injekciót CDH17 shRNS vagy mock vektor dózisban 10 9 vírusrészecske /injekció a tumor helyén. Az injekciót adtunk be hetente kétszer, 2 hétig. Az állatokat injektáljuk a mock vektor, a tumorok növekedése fokozatosan során a kísérletet. Éppen ellenkezőleg, intratumorális injektálása CDH17 shRNS következtében lényegesen kisebb tumorok minden időpontban, beleértve a végső térfogat mérés (ábra. 4B). Vizsgálata a tumorsejtek által CDH17 IHC bizonyították figyelemre méltó down-regulációja szánt CDH17 célt a shCDH17 kezelt sejteket (P < 0,05; ábra. 4B). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az in vivo alulszabályozása CDH17 a gyomor karcinóma sejteket csökkenti a tumor kialakulását egerekben, utalva arra, hogy CDH17 egy terápiás célpont gyomorrák.}

down-regulációja Wnt /β-catenin jelátvitel által CDH17 knockdown

kihallgatták több utat annak érdekében, hogy felfedezzék a molekuláris mechanizmusa CDH17 kiütése által közvetített gátlását gyomorrák növekedés, proliferáció és metasztázis. Találtunk több tagja a Wnt /β-catenin utat kell differenciáltan expresszálódó között shCDH17 és szülői sejtek. β-catenin kifejezés, a GSK-3β foszforiláció és ciklin D1 expresszió csökkent; és Rb kifejezés egyaránt nőtt AGS és MKN-45 shCDH17 sejteket. Ezen túlmenően, a p53 expressziója, MDM2 és a kulcs sejtciklus szabályozó p21 megnövekedett CDH17-knockdown sejteket. (Ábra. 5A). Egy TOPFlash /FOPFlash riporter iuciferázvizsgáió (ábra. 5B), helyreállítása CDH17 mind AGS és MNK-45 sejtek szignifikánsan növelte az erejét TCF /LEF jeleket összehasonlítva a shCDH17 ellenőrzéseket. Továbbá, amint azt útján immunoblot analízis, észleltünk a növekedés mind a teljes és a nukleáris β-catenin fehérje után helyreállítása CDH17 AGS és MKN-45, ha összehasonlítjuk a shCDH17 (ábra. 5C) .Together, ezek az eredmények azt mutatják, hogy CDH17 knockdown eredményeket downregulációját Wnt /β-catenin útvonal gyomorrák sejtek. Ez viszont azt sugallja, hogy CDH17 fenntartja a proiiferatív potenciállal keresztül Wnt /β-catenin-útvonali jeltovábbítás.

Discussion

CDH17 egy újszerű cadherin, annak szerkezete, hogy eltérnek a klasszikus kadherinek ban, hogy az N-terminális domén és a citoplazmatikus rész megjeleníti nincs szignifikáns homológiát klasszikus kadherinek [6]. A biológiai funkciója CDH17 még nem ismert. Számos tanulmány arról számolt be emelkedett CDH17 különféle emberi rákos megbetegedések, összekötve e protein expressziójának a prognózis és a kockázat Assesment [10], [15]. CDH17 overexpressziója jelentettek gyomor adenokarcinóma [9], hepatocelluláris karcinóma [16] és kolorektális karcinóma [17]. Ez azt jelzi, hogy CDH17 döntő fontosságú lehet tumorigenezis gyomor- és májrák. Katalógusa

Az emberben CDH17 normálisan expresszálódik kizárólag a bazolaterális felszínén májsejtek és enterocitáinak. Miután az első jelentés CDH17 mint bél metapasia marker által Grotzinger munkatársai [9] Több vizsgálat értékelte CDH17 kifejezés a gyomorrák. CDH17 fejeztük 50-78% gyomorrák szövetek intesztinális típusú túlsúlya [18], [19]. A jelen tanulmányban azt bizonyítják, hogy CDH17 egy onkogén és vonzó terápiás célpont gyomorrák: CDH17 erősen expresszálódik daganatos szövetek majdnem fele gyomorrák hogy CDH17 pozitív IHC. Park és munkatársai értékelték a CDH17 kifejezés több mint 200 gyomorkarcinóma szövetminták, és jelentette, hogy azt erősen expresszálódik korábbi TNM szakaszaiban [20], Ezen kívül, azt találták, hogy csökkent expressziója CDH17 kimutatták, hogy szorosan összefügg a tumor agresszivitás és a nyirokcsomó-metasztázis az emberi gyomor karcinóma [20]. Azonban mások számoltak be, hogy az expressziója sokkal magasabb volt fejlett nyirokcsomó-metasztázis [18], [21]. Vizsgálatunkban nem volt kapcsolata CDH17 kifejezés és más klinikopatológiai jellemzői. Katalógusa

Ennek prognosztikai tényező, CDH17 kifejezés tendenciát mutattak irányába mutató kedvezőtlen túlélési több betegcsoportok, kontrollálva is daganat stádiuma. Ebben az összefüggésben, a túlélés középértéke 15,9 hónap volt a csoport pozitív CDH17 kifejezés, vs. 26,6 hónap betegeknél IHC negatív tumorok képvisel klinikailag jelentős kapcsolatot. Továbbá, egy feltáró elemzés azt mutatta, az általában gyenge túléléssel betegeknél magas expresszióját CDH17 fehérje (IHC 2+ és 3+), összehasonlítva az betegek alacsony expressziója CDH17 fehérje (IHC +). Ezek az eredmények figyelemre méltó, tekintettel a rossz prognózis ebben a populációban. Együttesen CDH17 kifejezés egy hasznos prognosztikai gyomorrák, és úgy tűnik, hogy kapcsolatban áll a tumor progresszióját. Katalógusa

A jelen tanulmány azt mutatja, hogy shRNS-mediált CDH17 knockdown az erősen tumorigenikus gyomorkarcinóma sejtvonalon AGS és MKN-45 hatékonyan elnyomja a sejtek növekedését, csökkenti a gócok kialakulása és kolónia képződését lágy agar, valamint invazív és metasztázisos képességét gyomorrák in vitro. G1-S fázis átmenet az egyik fő ellenőrzőpont a sejtciklus és a p21 az egyik kritikus negatív regulátorok az átmenet során [22]. A fő sejtciklus hatása CDH17 kiütése van gátlása G1-S fázis átmenet aktiválásán keresztül P21 megerősítette blotok vizsgálatok (ábra. 5). Egy nemrégiben készült tanulmány a HCC sejtekben találták, hogy kimerülése CDH17 eredményezte a gátlása invázió, a növekedés és metasztázisok MHCC97H hepatocelluláris karcinóma sejtek [16]. CDH17 pozitív szabályozó vándorló, ragasztó, és invazív viselkedését. Elképzelhető, hogy ezzel összhangban N-cadherin. A gyomorrák, CDH17 közvetítheti karcinóma sejtek kölcsönhatása gyomor- és stroma részt vesz a promóciós gyomorrák metasztázis megkönnyítésével carcinoma sejt migráció és helyreállítsák homofil sejt-sejt adhézió áttétet. A tanulmányok olyan új betekintést potenciális szerepe a gyomorrák kialakulásában és progressziójában. Eredményeink szerint, CDH17 egy onkogén és egy vonzó terápiás célpont a gyomorrák.

Ennek megfelelően, azt feltételezik, hogy célzás CDH17 lehet használni kezelésére gyomorrák in vivo. Egér modell gyomorrák használtuk, hogy érvényesítse a hatását megcélzó CDH17 mint potenciális kezelést. Fertőzés a gyomor carcinoma sejtek CDH17 shRNS eltörölte a rákkeltő egerekben. A tumort hordozó egerek, a helyi szállítás lentivírus alapú CDH17 shRNS gátolta a tumor növekedését, bemutatva egy feltűnő elnyomása hatása a tumor kialakulását. Ezek az eredmények fontos klinikai következményei kezelésére gyomorrák. Jelenleg csak egyetlen FDA által jóváhagyott célzott kezelés kezelésére egy részhalmaza gyomorrák: Trastuzumab, egy monoklonális antitest, amely gátolja a HER2 receptor. Sajnos, a HER2-t expresszáló daganatok ritkák, csak 22% gyomorrák beteg hasznot húzhat a terápia [23]. Ezzel szemben, a CDH17 ben erősen expresszálódik a gyomorrák közel 50% -ánál (1. táblázat) .Jelenleg, a standard terápiát gyomorrák magában foglalja a műtét optimális debulking a betegség, majd citotoxikus terápiával. Ezen erőfeszítések ellenére betegek 80% -ánál diagnosztizáltak gyomorrák fejleszteni visszatérő betegség, és csak 20% -át ezek a betegek 5 éves túlélés a diagnózis után [24]. Eredményeink azt sugallják, hogy gyomorrákos betegek részesülhetnek a célzott terápia ellen CDH17, és szavatolja a feltárási és tervezési potenciális CDH17 inhibitorok. Katalógusa

A molekuláris mechanizmusok, amelyek CDH17 szabályozza a gyomor rák növekedését még tisztázásra szorul. Egy friss jelentés mutatott transz-kölcsönhatás E-cadherin és CDH17 enterocytákban fejlesztése során bélhámban [25], [26], ami arra utal, hogy a CDH17 esetleg metszik a Wnt út keresztül az összehangolás E-cadherin és /vagy társult partnerekkel. Korábbi tanulmányok megállapították, hogy célba CDH17 inaktiválja Wnt /β-catenin jelátvitel hepatocelluláris karcinóma [16]. Aktiválás a Wnt /β-catenin jelátvitel található mintegy 30% -a a gyomorrák, és transzgenikus állatmodellek azt is kimutatták, hogy a Wnt jelátvitel elősegíti a gyomor karcinogenezis [27].

• PLoS One: Caveolin-1 expressziós szintje a rákkal összefüggő fibroblasztok jósolja eredmény Gyomor Cancer
• PLoS One: Phase II vizsgálat kiértékelése 2. adagolási rend esetén az Oral Foretinib (GSK1363089), cMET /VEGFR2 inhibitor, a betegek metasztatikus gyomor rák