PLoS ONE: Målretning CDH17 Undertrykker Tumor Progression i Gastric Cancer ved nedregulering Wnt /β-Catenin Signaling

Abstrakt

Formål

mavekræft er stadig en af ​​de førende årsager til kræft død på verdensplan. Patienter normalt tilstedeværende sent med lokal invasion eller metastase, for hvilke der ikke er effektive behandlinger til rådighed. Efter tidligere undersøgelser, der identificerede adhesionsmolekylet Cadherin-17 (CDH17) som en potentiel markør for gastrisk karcinom, vi udførte proof-of-principle undersøgelser til at udvikle rationelle terapeutiske metoder rettet mod CDH17 til behandling af denne sygdom.

Metoder

Immunhistokemi blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​CDH17 i 156 gastriske carcinomer, og forholdet mellem overlevelse og CDH17 ekspression blev undersøgt ved multivariate analyser. Virkningen af ​​RNA-interferens-medieret knockdown af CDH17 på proliferation af gastrisk carcinom-cellelinier blev undersøgt in vitro og in vivo, såvel som virkningerne på nedstrøms signalering ved immunblotting.

Resultater Salg

CDH17 var konsekvent opreguleret i humane gastrisk kræft, og samlet overlevelse hos patienter med CDH17 opregulering var dårligere end i dem uden ekspressionen af ​​dette gen (5 år samlede overlevelsesraten 29,0% vs. 45,0%, P < 0,01). Funktionelle analyser viste, at CDH17 knockdown hæmmede celleproliferation, adhæsion, migration, invasion, clonogenicity og fremkalde G0 /G1 anholdelse. Hos mus, shRNA-medieret CDH17 knockdown markant inhiberer tumorvækst; intratumoral injektion af CDH17 shRNAs resulterer i signifikante antitumorvirkninger på transplanterede tumormodeller. De antitumor mekanismer bag CDH17 hæmning involverer inaktivering af Wnt /β-catenin signalering.

Konklusion

Vores resultater identificerer CDH17 som biomarkør af gastrisk karcinom og attraktivt terapeutisk mål for denne aggressive malignitet.

Henvisning: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Målretning CDH17 Undertrykker Tumor Progression i Gastric Cancer ved nedregulering Wnt /β-Catenin Signaling. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959

Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: 22 oktober, 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Udgivet: 15. marts 2013 |

Copyright: © 2013 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation (30672408 til RHX). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige årsag til cancer dødsfald i verden. Selvom forekomsten af ​​mavekræft er faldet drastisk i nogle udviklede lande i det seneste årti, skønnes i alt en million nye tilfælde skal diagnosticeres hvert år [1]. Patienter med denne sygdom ofte har en dårlig udsigter, der tegner sig for 10% af de samlede kræftdødsfald [2]. Selv efter radikal kirurgi, mere end halvdelen af ​​patienterne gentage sig. Lymfeknude involvering, dybde tumor invasion og tumor placering er blevet identificeret som de væsentligste clinicopathologic prognostiske faktorer [3], [4].

Lokal invasion og fjernmetastaser almindeligt forekommende i avanceret gastrisk karcinom. Processen for invasion og metastase er kompleks og kræver dysregulering af en række cellulære elementer, herunder kritiske adhæsionsmolekyler. Cadherin hører til en af ​​adhæsionsmolekylet familier og spiller en afgørende rolle i etableringen celle-celle interaktion [5]. Cadherin-17 (CDH17), som også kaldes lever-tarm (LI) cadherin eller humant peptidtransportøren-1 (HPT-1), er et strukturelt unik medlem af cadherin superfamilien [6], [7]. Henviser de såkaldte klassiske cadheriner, såsom E-, N- og P-cadherin, har fem cadherin repeats inden det ekstracellulære domæne, CDH17 består af syv cadherin repeats. Desuden CDH17 har kun 20 aminosyrer i det cytoplasmatiske domæne, hvorimod klassiske cadheriner har en stærkt bevaret cytoplasmatisk domæne bestående af 150-160 aminosyrer. CDH17 udtrykkes i mus og mennesker næsten udelukkende i epitelceller både embryonal og voksen tyndtarmen og tyktarmen, med ingen detekterbar ekspression i maven og leveren [8].

Ved hjælp integrative genomiske og proteomiske fremgangsmåder, forskere har begyndt at identificere hidtil ukendte onkogener og tumor suppressorer i gastrisk cancer. Tidligere undersøgelser af kliniske kohorter identificeret CDH17 som en potentiel sygdom markør for gastrisk carcinom [9], [10]. Trods disse signifikante kliniske fund, de molekylære funktioner af CDH17 forbliver ukendte, og dens tumorigene rolle i gastrisk karcinom er endnu ikke blevet bekræftet. Her har vi til formål at dissekere de onkogene signaling mekanismer CDH17 i mavens karcinom kontekst og evalueret virkningerne af målretning CDH17 som en potentiel terapeutisk tilgang til mavekræft.

Metoder

Patienter

undersøgelsen bestod af 156 konsekutive patienter (106 mænd og 50 kvinder) planlagt til operation fra 1. januar 2002 til 31. december 2006 på Sun Yat-Sen University Cancer center, Guangzhou, Kina. Alle patienter i dette studie havde en histologisk bekræftet diagnose af primær gastrisk karcinom, der blev yderligere analyseret patologisk efter operationen. Kirurgi bestod af subtotal eller total gastrektomi hos alle patienter; en standardiseret teknik blev anvendt til kirurgisk resektion og lymphadenectomy, som beskrevet andetsteds [3]. Patienter, der fik foretaget ikke-resective kirurgi, og dem med Siewert type I Cardia adenocarcinom blev udelukket fra undersøgelsen. Specimen og tumor størrelser blev registreret af patologer. Repræsentative områder af tumoren blev udvalgt og snap-frosset. pTNM klassifikation fulgt kriterierne i 6. udgave af UICC [11] .Den median alder af patienterne var 57,2 år (interval: 27-78 år) Alder, køn, type kirurgi, tumor placering, TNM stadie, kemoterapi, eksemplar længde, tumorstørrelse, og histologisk differentiering, blev registreret for hver patient i en database. Alle patienter, som gennemgik nogen form for kemoterapi var på 5-FU, platin eller taxol-baserede regimer. Alle patienter, efter udskrivelse fra hospitalet, trådte en opfølgning program i henhold til standard-protokol [12]. Opfølgningen blev lukket i april 2010. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Sun Yat-sen University Cancer Center, alle deltagere forudsat deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

cellelinjer og CDH17 antistof

Gastric karcinom cellelinjer, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 og SGC-7901 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) og Beijing Medical University (Beijing, Kina). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). Et monoklonalt muse-antistof til CDH17 (ab54511) var fra Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 kort hårnål RNA (shRNA)

pLKO.1 puro (7 kb) lentiviral konstruktion indeholder en U6 promotoren og HIV-1 RNA-pakning signal med pruomycin- og ampicillin- modstandselementer klonet 3 'for den humane phosphoglyceratkinase (hPGK) promotor. En cpptCTE blev indsat 5 'for hPGK-promotoren. Menneskelige CDH17 shRNA konstruktioner blev genereret ved at ligere følgende udglødet oligomerer i de unikke Agel og EcoRI-stederne i pLKO.1 puro: CDH17 shRNA fremad (5'CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3 ") og omvendt (5'AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3). Lentivirale præparater blev fremstillet ved co-transfektion pLKO.1 puro tom vektor med CDH17 shRNA, og hjælper-virus emballage plasmider pCMVΔR8.9 og pMG.G (ved en 10:10:01 forhold) i 293T-celler. Transfektion blev udført ved anvendelse af lipofectamin og PLUS-reagens (Invitrogen). Lentivira blev høstet ved 24, 36, 48 og 60 timer efter transfektion. To kontroller blev sat op, hvor mavens kræftceller enten har modtaget behandling eller blev transficeret med røræg ikke-målrettet RNAi vektor (Mock). Infektion blev udført i nærvær af 8 ug /ml polybren. Efter infektion AGS og MKN-45 celler blev selekteret til stabil ekspression af de shRNAs anvendelse af 2 ug /ml puromycin. Cellerne blev lyseret til western blot-analyse 10 dage efter infektion.

immunblotting og subcellulær fraktionering

Proteinlysater blev fremstillet ud fra cellelinje-monolag under anvendelse af lysepuffer (1% NP-40,50 mM Tris HCI, pH 8,0, 100 mM natriumfluorid, 30 mM natriumpyrophosphat, 2 mM natriummolybdat, 5 mM EDTA, 2 mM natriumorthovanadat) indeholdende proteaseinhibitorer (10 mg /ml aprotinin, 10 mg /ml leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid ). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Cellelysater blev underkastet natriumdodecylsulfat sulfacte-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og de separerede proteiner blev elektroforetisk overført til Immobilon-P-membraner (Millipore). Efter blokering af fedtfri mælk blev membranerne inkuberet uafhængigt i primære antistoffer P53 (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), cyclin D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling΢9), β-Catenin (Zymed, 13-8400), GSK3p (Santa Cruz, SZ-7291) og p-GSK3p (Ser9) (Cell SignalingΥ6). Membranen blev vasket adskillige gange i PBS med 0,1% Tween 20 og scannes i LI-COR Odyssey infrarød tofarvet påvisning billeddanner systemet (LI-COR Bioscience) ifølge producentens instruktioner.

Subcellulære fraktioneringer blev udført under anvendelse specifik cellelyse, buffere og gentagne centrifugeringstrin (kerneekstrakt kit fra Active Motive, Carlsbad, CA) ifølge producentens specifikationer. Cellefraktioner blev opløst i RIPA-buffer, og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse BCA protein kvantificering assay. Proteinekstrakter (20 ug) blev yderligere opløst i 1 × Laemmli puffer, underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner, som beskrevet ovenfor. Western blot analyse af poly-ADP-ribose-polymerase (PARP, fra Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) og superoxiddismutase 2 (SOD2, fra ABFrontier, Seoul, Korea) blev udført for at bekræfte passende adskillelse af kerner og cytosol-proteiner.

Kvantitativ revers transskription-PCR (QPT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer og frosne gastrisk adenocarcinom væv fra TRIzol-reagens (Invitrogen). Revers transkription af totalt RNA (2 Ag) blev udført under anvendelse af en Advantage RT for PCR-kittet (Clontech), og cDNA blev udsat for PCR i 28 cyklusser af amplifikation med de følgende primere: CDH17 FW 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC og CHD17 Rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-Actin blev anvendt som en kontrol.

Immunhistokemi (IHC)

I alt 156 formalinfikserede og paraffinindlejrede gastrisk cancer vævsprøver blev udvalgt til IHC undersøgelse. IHC-farvning blev udført på 5 um vævssnit rehydrerede gennem graduerede alkoholer. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i 15 min. Objektglas blev mikrobølge behandlet i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 10 minutter. Ikke-specifik binding blev blokeret med 10% normalt kaninserum i 20 minutter. De væv Objektglassene blev inkuberet med anti-CDH17 (1:50 fortynding) i 60 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Objektglassene blev inkuberet med biotinyleret kanin-anti-muse-immunoglobulin i en koncentration på 1:100 i 30 minutter ved 37 ° C omsættes derefter med et streptavidin-peroxidasekonjugat i 30 min ved 37 ° C og endelig inkuberet med 3-3 'diaminobenzidin som et chromogen substrat. For at udelukke en falsk positivt signal, blev negative kontroller inkluderet i hver test ved at erstatte det primære antistof med blokerende serum. To uafhængige observatører blindet til clinicopathologic oplysninger scoret dias. Definitionen af ​​farvning var som følger: negativ, med 0% til mindre end 5% af tumorcellerne viser immunreaktivitet; svag, 5-40% af tumorcellerne viser immunreaktivitet; positiv, mere end 40% af tumorcellerne viser immunoreaktivitet. De positive sager blev videre nord sub-klassificeret i CDH17 + (immunoreaktivitet: 40-60%), CDH17 2+ (immunoreaktivitet: 60-80%) og CDH17 3+ (immunoreaktivitet: 80-100%).

I vitro assays til vurdering tumor fænotype

de eksperimentelle procedurer for cellevækst, foci dannelse, blød agar, celle migration, sårheling og cellecyklus analyser er beskrevet i Støtte Metoder S1.

Rescue eksperimenter

Redningen af ​​CDH17 i shCDH17 AGS og MKN-45 cellelinjer er beskrevet i Støtte Metoder S1.

In vivo musemodeller af mavekræft

Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af Sun Yat-sen University Cancer Center (Permit Nummer: 09-0238). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Efter anæstesi blev Nøgne mus aflivet ved cervikal dislokation.

tumordannelse i nøgne mus.

In vivo tumorigenese blev undersøgt ved tumor xenograft eksperimenter. Ca. 2 × 10 ^{6 AGS celler inficeret med CDH17 shRNA, kontrol AGS celler inficeret med mock RNAi vektor og forældrenes AGS celler blev injiceret subkutant ind i højre og venstre bagben af ​​4 uger gamle nøgne mus (30 mus, 10 pr betingelse). Tumor dannelse i nøgne mus blev overvåget over en periode på 8 uger. Tumorvolumenet blev beregnet ved formlen V = 0,5 × L × W 2. [13]}

Tumor-bærende musemodel.

Subkutane tumorer blev induceret i nøgne mus under anvendelse AGS celler som ovenfor nævnt. En uge efter podning blev musene behandlet med anti-CDH17 shRNA. Hver mus modtog 100 pi intratumoral injectionscontaining 1 × 10 ^{9 kopier af CDH17 eller mock lentivirus, to gange om ugen i 2 uger. Fem mus blev anvendt i hver gruppe. Tumor vækst blev overvåget dagligt.}

Statistik

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 13.0. Forskelle blandt variabler blev vurderet ved χ2-analyse eller 2-tailed Students t test. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD med mindre andet er angivet. Samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) kurver blev beregnet af Kaplan-Meier-metoden, og forskellene mellem de to grupper blev sammenlignet ved log-rank test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

CDH17 er stærkt udtrykt i gastrisk carcinomceller og er relateret til dårlig klinisk resultat

Først og fremmest, vi undersøgte ekspressionsniveauet af CDH17 i 156 gastrisk karcinom prøver ved IHC: 69 (44,3%) af 156 sager var positive, mens de resterende 87 sager (55,7%) var negative eller svage til CDH17 udtryk (fig. 1). Niveauet af ekspression var +, 2+ og 3+ i 21 (13,5%), 20 (12,8%) og 28 (17,9%) tilfælde hhv. Disse fund indikerer, at CDH17 kan spille en vigtig rolle i gastrisk cancer tumorigenese. Vi derefter sammenlignet de kliniske og patologiske træk ved de patienter med og uden CDH17 ekspression. blev ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle mellem de to grupper med hensyn til køn, alder, tumorstørrelse, tumor site, dybde tumor invasion, lymfeknude metastaser, fjernmetastaser og TNM stadie (tabel 1).

Dernæst vi undersøgte de potentielle konsekvenser af CDH17 udtryk status på overlevelsen af ​​patienter på lang sigt ved univariate og multivariate analyse. Median opfølgning var 24,3 måneder, ved afslutningen af ​​opfølgningen, 68 patienter var stadig i live, 87 patienter var døde af tumor, og en patient var død af andre årsager; kræft-relaterede 5-års overlevelse i hele serien var 37,8%. Univariate analyser viste en sammenhæng mellem samlet overlevelse og tumor site, histologisk differentiering, TNM stadie og CDH17 udtryk (tabel S1). I multivariate analyser, tumor websted (p = 0,02) histologisk differentiering (p = 0,02), TNM stadie (p < 0,001) og CDH17 udtryk (p < 0,01) var uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse. Fig. 2A viser samlet overlevelse forskellen mellem patienter med og uden CDH17 ekspression. Median samlet overlevelse var 15,9 måneder hos patienter med CDH17 udtryk sammenlignet med 26,6 måneder hos dem CDH17 negative eller svage udtryk (P < 0,01), svarende til en reduktion i dødeligheden 16%. Endvidere blev sygdomsfri overlevelse (DFS) analyse udført i 131 patienter, som gennemgik R0 resektion. Ved slutningen af ​​follow-up, 69 (52,7%) patienter var stadig i live og 62 (47,3%) patienter var døde af tumor tilbagefald eller fjernmetastaser viste multivariate analyser de samme resultater, histologisk differentiering, tumor site, dybde tumor invasion (pT stadium), lymfe-knude metastaser (pN etape) var uafhængige prognostiske faktorer for sygdomsfri overlevelse (data ikke vist). Vi fandt også, at patienter uden CDH17 ekspression har en bedre prognose end de, der med CDH17 ekspression i tumorvæv (figur 2B.) (P < 0,01). Samlet overlevelse blev reduceret hos patienter med høj ekspression af CDH17 (IHC 2+, 3+) end hos patienter med CDH17 + ekspression (fig. 2C). Den mediane samlede overlevelse af patienter, hvis tumorer havde højere CDH17 udtryk var 10,9 måneder for CDH17 3+, 21,1 måneder for CDH17 2+, og 25,7 måneder hos dem tildelt være CDH17 + udtryk (p < 0,01).

CDH17 udtrykt i humane gastriske cellelinier

Vi vurderede, om humane gastrisk carcinom-cellelinier udtrykker CDH17 og således kunne anvendes til yderligere at evaluere den potentielle funktion dette protein. Vi valgte et panel af 6 gastrisk karcinom cellelinjer med forskellige metastatisk potentiale: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 og SGC-7901. CDH17 mRNA-niveau blev målt ved QRT-PCR-analyse. Stærk ekspression blev set i primær og metastatisk gastrisk carcinom-cellelinie (AGS og MKN-45) (fig. S1A). Western blots analyse bekræftede høj CDH17 proteinekspression i AGS (etableret fra en primær tumor) og MKN-45 (metastatisk) (fig. S1B).

Taget sammen antyder disse resultater, at CDH17 er vigtig for initiering og metastase af mavekræft; mindst en delmængde af godt credentialed gastriske carcinoma cellelinier bevarer ekspression af CDH17 muliggør yderligere funktionel karakterisering.

CDH17 knockdown inducerer antitumorvirkninger in vitro

Dernæst vi slået ned CDH17 i gastrisk karcinom cellelinjer-AGS og MKN-45 ved hjælp CDH17-specifikke shRNAs. Den knockdown gav > 75% reduktion i både mRNA og protein niveauer (figur 3A.). Vi derefter vurderet de tumorigene og metastatiske egenskaber (spredning, kolonidannelse, vedhæftning, invasion og cellecyklus) af CDH17 mangelfulde gastric kræftceller (shCDH17 celler) sammenlignet med mock vektor-inficerede kontrol celler.

CDH17 shRNA medieret knockdown resulterede i signifikant reduceret cellevækst af gastrisk karcinom cellelinier (P < 0,001) (figur 3A, højre.). Foci-dannelse blev også signifikant inhiberet (P < 0,001) i shCDH17 celler sammenlignet med Mock celler (Fig 3B, Venstre.), Et lignende resultat blev opnået i blød agar, hvori kolonidannelse blev reduceret betydeligt i shCDH17 celler (P < 0,001;. figur 3B, højre). Rolle CDH17 i metastase blev undersøgt ved sårheling og Transwell analyser. CDH17 knockdown kunne falde celle mobilitet (fig. 3C, Venstre), som bestemt ved såret assay. Transwell assay viste, at nedsat ekspression af CDH17 signifikant nedsætter celleadhæsion (P < 0,001) (. Fig 3C, højre). At udforske den mekanisme underliggende vækst hæmning af CDH17 knockdown blev cellecyklus fordelinger af celler med CDH17 shRNA hårnål og Mock bestemmes ved flowcytometri: shCDH17 celler blev anholdt i G0 /G1 fasen, med færre celler i G2 /M-fase (Fig . 3D). Antitumorvirkningen af ​​CDH17 knockdown blev også set i metastatisk gastrisk carcinom cellelinie MKN-45 (fig. S2A-E). Ifølge de accepterede standarder, der vil forsikre kvaliteten og nøjagtigheden af ​​RNAi eksperimenter [14], vi udførte redningsforsøg re-udtrykkende CDH17 i AGS og MKN-45 shCDH17 celler (Fig. S3A-B). Restaurering af CDH17 udtryk i AGS og MKN-45 celler returneret cellerne til forældrenes fænotype, bekræfter, at anti-tumor effekter af CDH17 knockdown ikke skyldtes forbi mål effekter. De redningsforsøg afslørede, at efter restaureringen af ​​CDH17 til udtryk i disse to cellelinjer, tumorigeniciteten og metastatisk potentiale steg til lignende niveauer af forældrenes AGS og MKN-45 celler (Fig. S3C-F). Disse resultater giver stærke beviser for de onkogene roller CDH17 i gastrisk carcinomceller.

CDH17 som en in vivo Mål for mavekræft Therapy

Vi undersøgte, om CDH17 er nødvendig for dannelse af tumorer og invasivitet i gastriske carcinomceller i en nøgen musemodel. Vi subkutant injiceret shCDH17, Mock og forældreorlov AGS celler i nøgne mus. Tumorer er normalt synlige makroskopisk i dorsale flankerer inden for en periode på 6 til 8-uge af celler injektion. 1 mus fra både de parentale AGS og Mock grupper døde under den tredje uge efter injektion (humane endepunkter blev anvendt). Mus blev aflivet 8 uger efter tumorcelleinjektion. I gruppen af ​​mus injiceret med shCDH17 celler, 2 mus viste ingen tumor nodule, og 8 mus viste signifikant reduceret tumordannelse sammenlignet med mus injiceret med mock-celler. Tumorstørrelse og vægt blev væsentligt reduceret i mus injiceret med shCDH17 celler sammenlignet med mus injiceret med mock-celler (fig. 4A). Disse resultater viser, at reduktionen af ​​CDH17 udtryk kan væsentligt undertrykke tumorigenicitet in vivo.

For yderligere at vurdere effekten af ​​CDH17 knockdown på primær tumor vækst, så undersøgte vi, om in vivo levering af CDH17 shRNA kunne hindre væksten af ​​en etableret tumor xenograft fra parentale AGS celler i nøgne mus. En uge efter podning med tumoren, når tumoren havde nået ca. 100 mm ^{3, udførte vi en intratumoral injektion af CDH17 shRNA eller mock vektor i en dosis på 10 9 viruspartikel /injektion på tumorstedet. Injektionen blev administreret to gange ugentligt, i 2 uger. I dyr injiceret med mock vektor, tumorerne voksede progressivt i løbet af forsøget. Tværtimod intratumoral injektion af CDH17 shRNA resulterede i signifikant mindre tumorer ved hvert tidspunkt, herunder den endelige volumen måling (fig. 4B). Undersøgelse af tumorcellerne ved CDH17 IHC demonstrerede bemærkelsesværdig nedregulering af hensigten CDH17 mål i shCDH17 behandlede celler (P < 0,05;. Figur 4B). Disse resultater viser, at in vivo nedregulering af CDH17 i gastriske carcinomceller reducerer tumordannelse i mus, hvilket betyder, at CDH17 er et terapeutisk mål for mavekræft.}

nedregulering af Wnt /β-catenin signalering ved CDH17 knockdown

Vi afhørte flere veje for at opdage den molekylære mekanisme CDH17 knockdown-medieret hæmning af gastrisk vækst, spredning og metastaser kræft. Vi fandt flere medlemmer af Wnt /β-catenin pathway, der skal udtrykkes differentielt mellem shCDH17 og parentale celler. β-catenin udtryk, GSK-3β fosforylering, og cyclin D1 udtryk faldt; og Rb ekspression steg i både AGS og MKN-45 shCDH17 celler. Desuden ekspression af P53, MDM2 og nøglen cellecyklus regulator p21 steg i CDH17-knockdown celler. (Fig. 5A). I en TOPFlash /FOPFlash reporter luciferaseanalyse (fig. 5B), restaurering af CDH17 både AGS og MNK-45 celler steg markant styrke TCF /LEF-signaler i forhold til shCDH17 kontroller. Som vist ved hjælp af immunoblotanalyse, vi har registreret en stigning på både den samlede og nuklear β-catenin protein efter restaurering af CDH17 i AGS og MKN-45, når der sammenlignes med shCDH17 (fig. 5C) .Together, disse resultater indikerer, at CDH17 knockdown resulterer i nedregulering af Wnt /β-catenin pathway i gastriske cancerceller. Dette vil igen, tyder på, at CDH17 fastholder proliferative potentiale gennem Wnt /β-catenin pathway signalering.

Diskussion

CDH17 er en roman cadherin, dets struktur er anderledes end de klassiske cadheriner ved, at den N-terminale domæne og det cytoplasmiske del viser ingen signifikant homologi med klassiske cadheriner [6]. Den biologiske funktion af CDH17 er stadig ukendt. Talrige undersøgelser har rapporteret forhøjede niveauer af CDH17 i forskellige humane cancere, der forbinder ekspression af dette protein til prognose og risikovurdering [10], [15]. CDH17 overekspression er blevet rapporteret i gastrisk adenocarcinom [9], hepatocellulært carcinom [16] og colorectalt carcinom [17]. Dette indikerer, at CDH17 kan være afgørende i tumorigenese af gastrisk og leverkræft.

Hos mennesker CDH17 normalt udelukkende udtrykkes på den basolaterale overflade af hepatocytter og enterocytter. Efter den første rapport fra CDH17 som en tarm metapasia markør af Grotzinger et al [9], har flere undersøgelser evalueret CDH17 udtryk i mavekræft. CDH17 blev udtrykt i 50-78% af mavekræft væv med intestinal-type, overvægt [18], [19]. I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at CDH17 er et onkogen og et attraktivt terapeutisk mål i mavekræft: CDH17 er stærkt udtrykt i tumorvæv, med næsten halvdelen af ​​gastrisk kræft bliver CDH17 positive ved IHC. Park og kolleger evalueret CDH17 udtryk i mere end 200 gastrisk karcinom vævsprøver, og rapporterede, at det var stærkt udtrykt i tidligere TNM stadier [20], Desuden fandt de, at reduceret ekspression af CDH17 har vist sig at være tæt forbundet med tumor aggressivitet og lymfeknude metastase af human gastrisk carcinom [20]. andre rapporterede dog, at dens udtryk var meget højere i avanceret lymfeknude metastaser [18], [21]. I vores undersøgelse var der ingen sammenhæng mellem CDH17 ekspression og andre klinisk-patologiske træk.

Som prognostisk faktor, viste CDH17 ekspression en tendens til en indikator for ugunstig overlevelse i flere kohorter patientgrupper, selv efter kontrol for tumor fase. I den forbindelse var den mediane samlede overlevelse på 15,9 måneder i gruppen med positiv CDH17 udtryk, vs. 26,6 måneder hos patienter med IHC negative tumorer repræsenterer en klinisk signifikant sammenhæng. Endvidere viste en eksplorativ analyse dårlig samlet overlevelse hos patienter med høj ekspression af CDH17 protein (IHC 2+ og 3+) sammenlignet med patienter med lav ekspression af CDH17 protein (IHC +). Disse resultater er bemærkelsesværdige på grund af den dårlig prognose i denne population. Kollektivt, CDH17 ekspression er en nyttig prognostisk markør i gastrisk carcinom og synes at være relateret til tumorprogression.

Den foreliggende undersøgelse viser, at shRNA-medieret CDH17 knockdown i de meget tumorgene gastriske carcinoma cellelinier AGS og MKN-45 effektivt kunne undertrykke cellevækst, fald foci-dannelse og kolonidannelse i blød agar, samt invasionsevne og metastatisk evne mavekræft in vitro. G1-S faseovergang er en væsentlig checkpoint for cellecyklusprogression og p21 er en af ​​de kritiske negative regulatorer i denne overgangsperiode [22]. Den vigtigste celle-cyklus effekt af CDH17 knockdown er inhibering af G1-S-faseovergang gennem aktivering af p21 blev bekræftet i blots undersøgelser (Fig. 5). En nylig undersøgelse i HCC-celler fundet, at udtømning af CDH17 resulterede i inhibering af invasion, vækst og metastase i MHCC97H hepatocellulære carcinomceller [16]. CDH17 er en positiv regulator til vandrende, lim, og invasive adfærd. Det er tænkeligt, at, i overensstemmelse med N-cadherin. I mavekræft, kan CDH17 mediere carcinom celle interaktion med gastrisk stroma og være involveret i fremme af gastrisk cancer metastaser ved at lette karcinom celle migration og genetablere homofil celle-celle adhæsion i metastaser. Vores undersøgelser giver ny indsigt i dens potentielle rolle i mavekræft initiering og progression. Ifølge vores resultater, CDH17 er et onkogen og et attraktivt terapeutisk mål i gastrisk cancer.

Derfor postulerer vi, at målretning CDH17 kan anvendes til behandling af gastrisk cancer in vivo. Musemodeller for mavecancer blev anvendt til at validere virkningen af ​​målretning CDH17 som en potentiel behandling. Infektion af mavens carcinom celler ved CDH17 shRNA afskaffet deres kræftfremkaldende hos mus. I tumorbærende mus, lokal levering af lentiviral baseret CDH17 shRNA inhiberede tumorvækst, der viser en slående undertrykkende virkning på tumordannelse. Disse resultater har vigtige kliniske implikationer til behandling af gastrisk cancer. I øjeblikket er der kun en FDA-godkendt målrettet terapi til behandling af en undergruppe af gastrisk cancer: Trastuzumab, et monoklonalt antistof, som interfererer med HER2-receptoren. Desværre, HER2-udtrykkende tumorer er sjældne, kan kun 22% gastrisk cancer patient drage fordel af denne terapi [23]. I modsætning hertil blev CDH17 stærkt udtrykt i gastrisk cancer hos næsten 50% af patienterne (tabel 1) .Currently, standardbehandling for mavekræft omfatter kirurgi med optimal debulking af sygdom efterfulgt af cytotoksisk behandling. Trods disse bestræbelser, 80% af patienter diagnosticeret med mavekræft udvikle tilbagevendende sygdom og kun 20% af disse patienter overlever 5 år efter diagnosen [24]. Vores resultater tyder på, at gastrisk kræftpatienter kan have gavn af målrettet terapi mod CDH17, og garanterer udforskning og design af potentielle CDH17 hæmmere.

De molekylære mekanismer, som CDH17 regulerer gastrisk kræft vækst mangler at blive belyst. En nylig rapport viste en trans-vekselvirkning mellem E-cadherin og CDH17 i enterocytter under udviklingen af ​​tarmepitelet [25], [26], hvilket tyder på, at CDH17 måske skærer med Wnt vej gennem sin koordinering med E-cadherin og /eller tilhørende partnere. Tidligere undersøgelser viste, at målrette CDH17 inaktiverer Wnt /β-catenin signalering i hepatocellulært carcinom [16]. Aktivering af Wnt /β-catenin signalering er fundet i ca. 30% af gastrisk cancer og transgene dyremodeller har også påvist, at Wnt signalering fremmer gastrisk carcinogenese [27].

• PLoS ONE: caveolin-1 Expression Niveau i cancer associeret fibroblaster Forudsiger Outcome i Gastric Cancer
• PLoS ONE: Fase II studie Evaluering 2 Doseringsplan af Oral Foretinib (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, i patienter med metastatisk gastrisk kræft