Ploche ONE: N-myc Následný regulovanú génovú 1 (NDRG1) podporuje tvorbu metastáz ľudského Scirrhous Žalúdočné nádorových buniek cez epiteliálne mezenchýme Transition

abstraktné

Naša nedávna štúdia ukázala, že vyššia expresie N-myc downregulated gen 1 ( NDRG1) úzko koreluje so zlou prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka. V tejto štúdii sme sa opýtali, či NDRG1 má kľúčovú úlohu v malígne progresii vrátane metastázy rakovinových buniek žalúdka. Génovú expresiu microarray analýzy expresie NDRG1 ukázala vyšší rast medzi celkom 3691 up-regulované génov vo vysoko metastatickej rakoviny žalúdka bunkové línie (58As1) než rodičovskej nízke metastázujúcej náprotivok (HSC-58). Vysoko metastatický bunkové línie vykazovali zníženie expresie E-cadherinu, spolu so zvýšenou expresiou vimentin a Slimák. Táto znížená expresia E-cadherinu bol obnovený Slimák Knockdown vo vysoko metastatických buniek. Ďalej sme založená stabilné NDRG1 porazený bunkové línie (AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54) z vysoko metastatického bunkové línie, a to ako z týchto bunkových línií vykazovala zvýšenú expresiu E-cadherinu a znížená expresia vimentin a Slimák. A tiež bolo zistené, že E-cadherin promótor riadený Aktivita luciferázy sa zvýši o NDRG1 Knockdown vo vysoko metastatickej bunkovej línie. NDRG1 porazený v žalúdku nádorové bunky vykazovali potlačená invázie nádorových buniek do priestorových tkanív, potlačil metastáz do pobrušnice a znížila hromadenie ascites u myší s výrazným zlepšením prežitia. Toto je prvá štúdia, ktorá preukázala, že NDRG1 hrá svoju kľúčovú úlohu v malígne progresii rakoviny žalúdka cez epitelové mezenchýme prechod

Citácia :. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, M Kage , et al. (2012) N-myc Následný regulovanú génovú 1 (NDRG1) podporuje tvorbu metastáz ľudského Scirrhous Žalúdočné nádorových buniek cez epiteliálne mezenchýme prechod. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: 08.12.2011; Prijaté: 22. júna 2012; Uverejnené: 23.júla 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený grantom-in-podpory pre výskum rakoviny od ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a technológie v Japonsku (dr Ono), ako aj tretí Term komplexnej kontroly výskum na rakovinu z ministerstva zdravotníctva, práce a sociálnych vecí Japonska (Dr. Kuwano). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších zhubných nádorov v Japonsku a ďalších ázijských krajinách. Prognóza pacient scirrhous karcinómu žalúdka je obzvlášť zlý. Scirrhous karcinóm žalúdka je často sprevádzaná peritoneálnej šírenie a metastázy do lymfatických uzlín a pečene, čo sú závažné problémy, ktoré musia byť kontrolované. Profil génovej expresie ukázala, génovej amplifikácie K-sam a c-Met v 30-40% scirrhous karcinómov žalúdka, a že nadmerná expresia rôznych rastových faktorov, ako je transformujúci rastový faktor beta (TGF-beta), rastu odvodeného od doštičiek faktor (PDGF), inzulínu podobný rastový faktor (IGF) a fibroblastový rastový faktor-2 (FGF-2) [1]. Nedávna analýza DNA microarray preukázal konkrétne upregulaci niekoľkých génov, vrátane SPARC
RGEIII
S100A10 stroje a kolagén typu I [2] - [4].

Zvieracie modely, ktoré odrážajú charakteristiky rakovinový zápal pobrušnice a metastáz do pobrušnice sú dôležité pre pochopenie vývoja malígny progresie rakovinou žalúdka. Yanagihara et al.
[5] najskôr stanovila bunkové línie HSC-58 od ľudského scirrhous rakoviny žalúdka, a potom založila dve sublinie, 58As1 a 58As9, s vysokým potenciálom pre peritoneálnej šírenie a lymfatických uzlín opakovanými ortotopická inokulácie HSC-58 buniek do žalúdočnej steny athymických myší [6], [7]. Táto sublinie často spôsobujú hromadenie ascitu po ortotopické implantácii a vykazujú zvýšenú expresiu génov kódujúcich proteázy a proteíny zapojené do bunkovej adhézie, bunkovej motility, proliferácie a angiogenézy [6]. Tiež rast selektívne v žalúdočnej submukóze, a napadnúť hlbšie vrstvy pre dosiahnutie Serózna rovinu žalúdka [7]. Avšak, to zostáva nejasné, prečo by získali tak vysoký potenciál pre metastázy v priebehu výberu.

V našej štúdii sme používali tieto vysoko metastatických bunkových línií vyšetrovať ako ľudské rakovinové bunky žalúdočné mohol získať metastatické potenciál. Najprv sme v porovnaní profilov génovej expresie medzi vysoko metastatických a nízkych metastatických rodičovských bunkových línií analýzou mikročipov. sme sa zamerali na jeden gén s názvom N-myc génu po prúde regulovaná 1 (NDRG1), pretože sa zistilo, že je Výrazne sa zvyšuje vo vysoko metastatických nádorových bunkových línií žalúdka v porovnaní s ich náprotivkov buniek. Bolo tiež oznámené, že skôr NDRG1 výraz bol vypovedajúce marker pre malígny progresiu a zlou prognózou u pacientov so žalúdočnými [8]. V súlade s týmto štúdii sme pozorovali, že vysoká NDRG1 expresie významne koreluje s nádorovú angiogenézu a malígne progresiu spolu so zlou prognózou u rakoviny žalúdka [9]. Tiež uviedol, že NDRG1 porazený indukuje zníženú tvorbu silných angiogénnych faktorov a nádorové angiogenézy buniek pľúcneho karcinómu, a tiež to, že NDRG1 je prediktívne marker pre nádorové angiogenézy a zlou prognózou u pacientov s ne-malobunkovým karcinómom pľúc [10]. NDRG1, jeden zo štyroch NDRG rodinných génov, teda ukazuje, rôzne funkcie, [11], a NDRG1 funkcie, a to buď ako metastázy potláčajúce alebo ako onkogénne a malígny promótorom, v závislosti od typu tumoru [11], [12]. Okrem toho, expresia génu je úzko NDRG1 riadený N-Myc a príbuzných Myc proteínov rodiny [13] a nadmerné expresie c-myc indukovanej epiteliálne mezenchýme prechodu (EMT) v epitelových bunkách prsnej žľazy [14]. Významnú úlohu EMT sa často označuje v jeho tesnej súvislosti s rozvojom a progresiou nádoru, vrátane nádorových metastáz [15], [16]. Avšak v týchto štúdiách, regulačné úlohy NDRG1 sa neskúmal. V našej štúdii sme skúmali metastatického potenciálu rakovinových buniek žalúdka jeho korelácia s EMT so sídlom úlohu NDRG1.

Výsledky

Porovnanie rastu buniek, morfológie buniek, nádorového rastu, šírenie a profily génovej expresie medzi vysoko metastatické rakovina žalúdka bunkových línií a ich nízka metastatický Vyrovnávacia

V súlade s predchádzajúcimi štúdiami [6], [7], vysoko metastatické rakovina bunkové línie 58As1 a 58As9 ukázala vyššie tempo rastu než ich rodičovskej náprotivok, HSC-58, s zdvojnásobenie doby 23-26 hod v porovnaní s 30 hr rodičovských bunkách (obrázok 1a). 58As1 bunky boli ľahko oddeliť a vykázala rast zavesenie typu buniek s okrúhlym morfológiu, zatiaľ čo HSC-58 a 58As9 bunky boli pripojené a ukázal vrstveného bunkový rast s fibroblastic morfológia (obrázok 1B). Obe 58As1 a 58As9 bunky vykazovali oveľa vyššej rýchlosti rastu nádoru v modeli xenoimplantátu subkutánnej v porovnaní s rodičovskými HSC-58 bunkách (obrázok 1C). Predchádzajúce štúdie preukázali, že ortotopická transplantácia 58As1 buniek indukované omnoho vyššia peritoneálnej šírenie a ascites akumuláciu než HSC-58 buniek [6], [7]. Ďalej sme potvrdili peritoneálnej šírenie buniek implantáciou je do peritoneálnej dutiny myší. Myši implantovaná 58As1 buniek ukazuje vzhľad priemerne 8 ± 3 viditeľné uzliny v mesenteriu každej myši a akumuláciu ascitu (od 0.7-2.5 ml /myš) (Obrázok 1D, E). Naproti tomu, myši implantované rodičovských HSC-58 buniek ukazuje tvorbu nemnoho ak nejaké malé uzlíky, a žiadny zjavný hromadenie ascitu.

Ďalej sme v porovnaní profilov génovej expresie medzi 58As1 buniek a ich rodičovskej náprotivok, HSC- 58, pomocou analýzy DNA čipu. Z 41,000 transkriptov RNA a variantov, sme identifikovali 3691 rozdielne exprimovaných génov, ktoré boli upregulovány na 2-krát, a 3536 génov, ktoré boli downregulated až 0,5-násobne alebo menej v 58As1 bunkách v porovnaní s HSC-58 buniek. Obrázok 1F prezentované gény, ktoré boli odlišne exprimované v 58As1 bunkách v porovnaní s HSC-58 bunky, sú obmedzené len na tie, ktoré patria do rodiny NDRG a gény súvisiace s metastázami, vrátane matrixových metaloproteinázy (MMP) /katepsinů, adhézie a epiteliálne-mezenchýmových-prechodu ( EMT). Zo štyroch génov v rodine NDRG [17], je expresia NDRG1 a NDRG4 bola up-regulovaná vo vysoko metastatickej bunkovej línie (58As1) v porovnaní s rodičovskou bunkovú líniu (HSC-58). Expresie EMT súvisiacich génov v bunkách 58As1 bol ovplyvnený predovšetkým akvizície vysokej metastatickým potenciálom. Expresia epitelu špecifické gény, vrátane E-cadherinu (
CDH1), P-cadherin (
CDH3) a β-katenin ( CTNNB1
), bol downregulated , Naproti tomu iba MMP1 ( MMP1
) výraz bol Výrazne sa zvyšuje; expresia kathepsinu L ( CTSL1
) bola zvýšená, ale katepsinu B ( CTSB
) nebol. Expresia mesenchyme špecifické gény, vimentin ( VIM
) a Slimák ( SNAI1
), čo je kľúčový transkripčný faktor pre potlačenie E-cadherin prejavu, bola up-regulovaná.

Enhanced NDRG1 génovej expresie u vysoko metastatické rakovina žalúdka bunkové línie

ďalej sme porovnávali expresiu proteínu niekoľkých génov v HSC-58, 58As1 a 58As9 buniek (obrázok 2A). Expresia NDRG1 sa výrazne rozšírený, a že na vimentin, Slimák, p-ERK1 /2, p-Akt, a p-GSK-3β bola tiež zvýšená, a to ako 58As1 a 58As9 buniek v porovnaní s HSC-58 buniek. Nebola zistená žiadna zjavná expresie Wnt3a a Wnt5a v týchto bunkových línií (dáta nie sú uvedené). Naproti tomu sme pozorovali znížená expresia E-cadherinu a beta-kateninu v 58As1 a 58As9 buniek v porovnaní s HSC-58 bunkách (obrázok 2A). Bolo zistené, fosforylácie P-kateninu Ser33 /37 a Ser552, že je oveľa menej, než 58As1 a 58As9 HSC58. V súlade s úrovňou expresie proteínu, expresné hladiny mRNA NDRG1, vimentin, slimák a MMP-1, boli vyššie v oboch vysoko metastatických bunkových líniách než rodičovskej náprotivok (obrázok 2B). Bolo oveľa menej mRNA expresie E-cadherinu a beta-kateninu ako 58As1 a 58As9 než HSC-58.

Imunocytochemická analýza ukázala, že lokalizácia E-cadherinu a to ako v cytoplazme a membránou, a P-kateninu bol prevažne lokalizované v cytoplazme v oboch HSC-58 a 58As9 bunkách (Obrázok 2C). Imunocytochemická analýza pre 58As1 nemohla byť vykonaná ako 58As1 rastie v suspenzii. Okrem toho, expresia beta-kateninu bol v oboch cytoplazme a jadru relatívne nižšie, ale to Snail bolo zistené, že je oveľa vyššia v jadre 58As1 a 58As9 než HSC-58 (obrázok 2D). Tiež sme skúmal E-cadherinu promotorovou aktivitu (obr 2E) a β-katenin indukovanej Reportéra aktivitou, TopFlash reportéra testom (obr 2F) a zistil, že tam bolo významné zníženie aktivity luciferázy poháňaný E-cadherin promótor a tiež beta-kateninu v oboch 58As1 a 58As9 v porovnaní s HSC-58, v súlade s úrovňou mRNA oboch génov.

NDRG1 Vyradenie navodzuje Zvýšená expresia E-cadherinu a down-reguláciu vimentin a Slimák vo vysoko metastatických buniek

Ďalej sme skúmali, či NDRG1 knockdown čiastočne ovplyvnená expresiu EMT súvisiacich génov vo vysoko metastatického bunkové línie, 58As1. Vytvorili sme dva stabilné NDRG1 porazený bunkové klony, AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 transfekcia NDRG1 zhrnie do 58As1 buniek. Oba AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 bunky vykazovali podobné tempo rastu seba a svoje rodičovské náprotivok AS1 /Mock3, s zdvojnásobenie doby 25-27 h v kultúre (obrázok 3A). Obe NDRG1 umlčaný bunkové línie vykazovali tesné adhéziu buniek na kultivačné misky a fibroblastickou morfológiu, zatiaľ čo AS1 /Mock3 bunky vykazovali rast v suspenzii typu buniek s okrúhlym morfológiu buniek (obrázok 3B). Ďalej sme skúmali účinok NDRG1 umlčanie na onkogénne aktivity buniek 58As1 za použitia Analýza rastu ukotvenia nezávislý. Obe NDRG1 umlčaný bunkové línie vykazovali významné zníženie ich ukotvenia nezávislý rast, ako je uvedené podľa počtu kolónií v mäkkom agare ( ^{* p <
0,01). (Obrázok 3C)}

Potom sme porovnali profily génovej expresie medzi AS1 /Mock3 a AS1 /Sic50 buniek pomocou analýzy DNA microarray (Obrázok 4A). NDRG1 porazený viedlo k zvýšeniu expresie E-cadherinu (
CDH1) a P-cadherinu (
CDH3), ale znížená expresia v vimentin ( VIM
) a Slimák ( SNAI1
). Ďalej sme vykonaná western blot a QRT-RCR analýzy pre niekoľko molekúl, ktoré boli modulovaných NDRG1 Knockdown v microarray analýzy (obrázok 4B, C). Tieto dve bunkové línie vykazovali oveľa nižšie expresiu ako NDRG1 mRNA a proteínu v porovnaní s bunkami AS1 /Mock3. Zvýšená expresia E-cadherinu bola konzistentne pozorovaná AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 buniek v porovnaní s AS1 /Mock3 bunkách pomocou Western blot analýzy. AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 buniek, a to western blot a QRT-PCR analýzy potvrdili zníženie expresie vimentin a Slimák bez ovplyvnenia expresie p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3p a GSK-3β (obrázok 4B, C).

na druhej strane, NDRG1 je dobre známe, pre potlačenie metastázy a bunkovej proliferácie rakoviny prostaty a hrubého čreva. Nedávne štúdie preukázali, že NDRG1 moduluje Wnt-β-katenin signálne dráhu so zvýšenou expresiou E-cadherinu v ľudskej prostaty a rakoviny hrubého čreva bunky [18], [19]. Avšak, NDRG1 knockdown v 58As1 bunkách neovplyvňuje expresiu β-katenin tak na úrovni mRNA a proteínu (obrázok 4B, C). A tiež β-katenin riadený promotorovou aktivitu reporterového testu podľa TopFlash ukázalo, žiadny rozdiel v aktivite promótorom medzi AS1 /Mock a NDRG1 umlčaný bunkových línií. Preto, β-katenin expresie nebola ovplyvnená NDRG1 príklepu. NDRG1 porazený tak neustále zvyšoval expresiu E-cadherinu a znížená expresia šnek a vimentin vo vysoko metastatickej bunkovej línie. Avšak, tam bol zrejme nedochádza k zmene v expresiu beta-kateninu podľa NDRG1 príklepu.

Enhanced E-cadherin Promoter Aktivita podľa NDRG1 porazený cez Snail v žalúdočnej nádorových buniek

rôznych transkripčných faktorov, ktoré potláčajú expresia E-cadherinu vrátane slimák, slimák, Twist, TCF4 a SIP1 [20], expresia slimák bol špecificky moduluje NDRG1 v rakovinových bunkách žalúdka. Skúmali sme, či expresia E-cadherinu a /alebo vimentin by mohli byť upravené Snail v HSC-58 buniek. Prechodné liečba Snail siRNA malo za následok zvýšenú expresiou E-cadherinu, ale nie to vimentinu a NDRG1, v závislosti na čase (obrázok 5A). Bol tam len k miernemu prípadné zvýšenie β-katenin výrazu Snail príklepu. Navyše, E-cadherin promótor riadený aktivita luciferázy bola významne potlačená transfekcia Slimák komplementárna DNA v dvoch testovaných nádorových bunkových línií (obr 5B). Ďalej sme v porovnaní E-cadherinu promotorovou aktivitu medzi AS1 /Mock3 a jeho NDRG1 umlčaný bunkových línií. Ako je vidieť na obrázku 5C, bol významný (* p Hotel &0,05) zvýšenie E-cadherin aktivitou promótorom podľa NDRG1 Knockdown

GSK-3β je kľúčovým enzýmom pre aktiváciu EMT. cesta [20], [21], a tiež pre fosforyláciu NDRG1 [22], [23]. Expresie p-GSK-3p bola zvýšená na vysoko metastatického bunkové línie, 58As1 (viď obrázok 2A). Skúmali sme, či GSK-3β bol zapojený do NDRG1 indukované pozmenenej expresie E-cadherinu a vimentin. Liečby inhibítorom (CT99021) GSK-3p viedlo k zníženiu expresie p-NDRG1 a p-GSK-3p, a tiež zvýšená expresia E-cadherinu a p-kateninu v 58As1 bunkách (Obrázok 5d). Ako je znázornené na obrázku 5E, β-katenin porazený neovplyvnila expresiu E-cadherinu, vimentin a Slimák.

NDRG1 Vyradenie indukuje mezenchymálnych epitelu Transition a potláča metastázy do pobrušnice vysoko metastatické rakovina žalúdka bunky

v porovnaní rastu nádoru z AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 buniek v modeli xenoimplantátu ukázali pomalšiu rýchlosť rastu nádoru oboch AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 podľa NDRG1 knockdown (obrázok 6A, B). NDRG1 knockdown potlačil miestnej invázii nádorových buniek AS1 /Mock3 do okolitého strómy a priľahlé tukového tkaniva a /alebo svalového tkaniva, a zapuzdreného rastu nádoru (obrázok 6C). Vysoká expresia E-cadherinu bola pozorovaná v AS1 /Sic50 a AS1 /nádory Sic54, zatiaľ čo vysoká expresia vimentin bol pozorovaný v rakovinových bunkách AS1 /Mock3 nádorov (obrázok 6d). Naproti tomu došlo takmer k žiadnej zmene v expresiu beta-kateninu v AS1 /Sic50 a nádory AS1 /Sic54 v porovnaní s AS1 /Mock3 nádoru.

Ak chcete skontrolovať, či NDRG1 porazený by mohli ovplyvniť metastáz do pobrušnice a akumuláciu ascitu, sme porovnávali metastatické potenciál AS1 /Sic50 a AS1 /Mock3 buniek po ortotopické transplantácii. Obrázok 7A ukazuje reprezentatívne zobrazenie rozšírené brušnej dutiny a prítomnosť nádorových uzlíkov v pobrušnice. Po ortotopické inokulácii AS1 /Sic50 buniek, počet uzlíkov uvedených v peritoneu bol približne o 30% nižšie ako tie, ktoré vyplývajú z AS1 /Mock3 buniek, ale tento pokles nebol štatisticky významný ( p
= 0,21) (obrázok 7B). Avšak uzliny vyplývajúce z AS1 /Sic50 buniek bola oveľa menšie rozmery ako tie z AS1 /Mock3 buniek (obrázok 7A). Nahromadenie ascitu od AS1 /Sic50 buniek bola významne (* p 0,01) sa znížil, až asi 10%, ktoré bolo vyvolané AS1 /Mock3 bunkách (Obrázok 7c). Okrem toho došlo k výraznému (* p Hotel &0,01) zvýšenie miery prežitia myší inokulovaných AS1 /Sic50 buniek (51 ± 16 dní) v porovnaní s 35 ± 14 dní pre myší inokulovaných AS1 /Mock3 bunky, čo naznačuje, že NDRG1 knockdown predlžuje prežívanie (obrázok 7D).

Diskusia

sme už skôr uviedol, že NDRG1 úzko koreluje s nádorovú angiogenézu a zlé prežitie u pacientov s rakovinou žalúdka, čo naznačuje, že NDRG1 je prediktívne biomarker pre malígny progresii karcinómu žalúdka [9]. Z našej štúdii sme pozorovali tieto vlastnosti sú základom pre získanie vysokého metastatického potenciálu v karcinómu žalúdka: mikročipu, western blot a RT-PCR analýzy spoločne odhalil upregulaci NDRG1 vo vysoko metastatických bunkových líniách, 58As1 a 58As9, v porovnaní s ich low metastázujúce rodičovskej náprotivok, HSC-58; Vyššia expresia vimentinu, Slimák, a MMP-1, a nižšie expresie E-cadherinu a p-kateninu boli zrejmé vo ​​vysoko metastatických bunkových línií v porovnaní s ich kolegami rodičovskou; génov downregulated vo vysoko metastatického bunkové línie, NDRG1 porazený za následok up-reguláciu E-cadherinu a downregulace vimentinu a slimák, ale takmer žiadny vplyv na expresiu beta-kateninu; Aktivita promótorom E-cadherin bol významne rozšírený NDRG1 Knockdown; NDRG1 knockdown potlačená peritoneálnej šírenie a hromadenie ascitu a invázii vysoko metastatických buniek do okolitej normálne tkaniva.

V tejto štúdii, NDRG1 knockdown viedlo k potlačeniu metastáz u vysoko metastatických buniek karcinómu žalúdka (obrázok 6 , 7), čo naznačuje, že NDRG1 môže byť metastáza promótor génu skôr než metastázy supresorové gén v karcinómu žalúdka. Naša súčasná štúdia dôrazne podporuje myšlienku, že nech NDRG1 podporuje alebo potláča malígne progresie rakoviny u ľudí závisí na typov nádorov a /alebo stavom diferenciácie [11] [12]. Avšak, to zostáva nejasné, prečo NDRG1 funguje ako nádorový supresor alebo promótor v závislosti na typy nádorov alebo histologických typov. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že NDRG1 potláča rast nádorov a angiogenézy rakoviny pankreasu pomocou NDRG1 poháňaného útlmu NF-kB signálne dráhy [24], [25]. Nedávna štúdie uvádzajú, že expresia metastázy supresorický gén, KAI1
gén, je zapojený do NDRG1 sprostredkované potlačenie metastáz karcinómu prostaty prostredníctvom ATF3-NF-kB dráhy [26]. Ďalšie štúdie sa vyžaduje porozumieť tomu, ktoré regulačný mechanizmus je výhradne zodpovedné za NDRG1 poháňaného podporu malígne progresie u buniek karcinómu žalúdka.

EMT je nedávny zdôrazňujú, že by mohla byť úzko spojená s rakoviny malígny progresiu, vrátane získania vysoko metastatického potenciálu [15], [16]. V našej štúdii, NDRG1 porazený zvýšená expresia E-cadherinu a potláčal expresiu vimentin obaja in vitro stroje a in vivo
. NDRG1 môže hrať kľúčovú úlohu v prechode z polarizovaného epitelu fenotyp s vysoko pohyblivých mezenchýme fenotypu. Čiastočná alebo úplná strata E-cadherinu je často pozorovaný pri progresii smerom malignity v mnohých nádorov, vrátane rakoviny žalúdka [27], [28]. Oliveira et al. [29] uvádzajú úzku spojitosť medzi stratou E-cadherinu a vysokým metastatického potenciálu v rakoviny žalúdka. Chan a kol. [30] hlásené tiež rozpustný E-cadherinu ako biomarker pre predĺžené prežitie pacientov s rakovinou žalúdka. NDRG1 knockdown za následok relatívne vyššia E-cadherinu expresiu v AS1 /Sic50 nádoru ako v AS1 /Mock3 nádorov, čo naznačuje, že NDRG1 môžu špecificky kontrolovať EMT prípadne prostredníctvom transkripčného faktora Slimák od buniek karcinómu žalúdka (obr 7e).

Wnt signalizácia má kľúčovú úlohu v malígny progresii a metastázy od pľúc a prsníka rakovinových buniek [31], [32], a Wnt signalizácie tiež indukuje EMT, ktorá zahŕňa metastatické progresii karcinómu epitelu [31], [33]. NDRG1 je známy ako metastáz supresorového génu v prostaty a karcinómu hrubého čreva a bunky [11], [12]. Liu et al [18] oznámil, že NDRG1 potláča metastázy cez Wnt /β-katenin signálne dráhy v bunkách karcinómu prostaty. Príslušná štúdie Chen et al [19] tiež preukázala, že NDRG1 moduluje TGF-beta-indukovanú EMT prostredníctvom pozmenenej expresie beta-kateninu a E-cadherinu v bunkách kolorektálneho karcinómu. Naša súčasná štúdia preukázala zníženie expresie beta-kateninu u oboch vysoko metastatických bunkových líniách v porovnaní s rodičovským náprotivku, HSC-58. Avšak, obaja western blot a QRT-PCR analýzy nepreukázali žiadne výrazné zmeny v expresných hladín beta-kateninu a tiež β-katenin poháňaného promotorovou aktivitu medzi vysoko metastatických 58As1 buniek a jeho dvaja NDRG1 umlčených bunkových línií. Zdá sa, že menej pravdepodobné, že β-katenin hrá kľúčovú úlohu pri potláčaní metastáz o NDRG1 Knockdown vo vysoko metastatických nádorových buniek.

Na druhej strane, GSK-3β je tiež známe, že hrá úlohu pri kontrole EMT [20], [21], a GSK-3β je základným enzýmom pre fosforylácii NDRG1, vynikajúce substavu GSK-3p [22], [23]. Expresie p-GSK3p bol relatívne vyšší vo vysoko metastatických bunkových líniách ako rodičovské bunkové línie (obrázok 2B). Liečba silný inhibítor GSK-3p za následok potlačenú expresiu p-NDRG1, sprevádzané zvýšením expresie E-cadherinu a beta-kateninu (obrázok 5D). Avšak, neexistuje takmer žiadny rozdiel v expresiu GSK-3p a p-GSK-3p od NDRG1 Knockdown vo vysoko metastatických bunkách (Obrázok 4B), čo naznačuje, že GSK-3β nemusí hrať významnú úlohu v indukcii EMT prostredníctvom NDRG1 do buniek karcinómu žalúdka.

Slimák je reprezentatívny transkripčný faktor, ktorý riadi expresiu E-cadherin [20]. Z rôznych regulačných faktorov, ktoré riadia transkripčný E-cadherin, expresia šnek bol špecificky moduluje NDRG1 v žalúdočných nádorových bunkových línií použitých v tejto štúdii. Slimák porazený indukované zvýšenie expresie E-cadherinu (Obrázok 5A) a exogénne tarnsfection z Slimák cDNA potlačená E-cadherinu promotorovou aktivitu (Obrázok 5B).

Vo vysoko metastatických nádorových bunkových línií žalúdka, expresia bola up-regulovaná ako slimák v porovnaní s ich nízkou metastatické náprotivok, HSC-58 (obrázok 2A, B). Obe NDRG1 umlčal bunkové línie, AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54, ktoré preukázali, znížená expresia Slimák v porovnaní s ich vysoko metastatické náprotivok, AS1 /Mock3 (obrázok 4B, C). Navyše, E-cadherin aktivita promotora bola významne stimulovaná v oboch NDRG1 umlčané bunkové línie v porovnaní s ich vysoko metastatickej náprotivok (obrázok 5C).

Na záver, NDRG1 knockdown indukuje upregulaci E-cadherinu a downregulace vimentinu a Slimák, a potlačil invázie, metastázy a hromadenie ascitu zo strany vysoko metastatických buniek karcinómu žalúdka. Tento NDRG1 sprostredkovaná regulácia E-cadherinu a /alebo vimentin výraz postihnutého epiteliálne mezenchýme prechod buniek karcinómu žalúdka. Tento NDRG1 indukovaná modifikácie EMT sa zdá, že je aspoň čiastočne pripísať transkripčný faktor Slimák. NDRG1, v jeho tesnej súvislosti s EMT súvisiacich génov môže podieľať na získanie vysokého metastatického potenciálu progresívnych buniek karcinómu žalúdka.

materiáloch a metódach

Materiály a bunkových línií

HSC-58 bola stanovená z ľudských scirrhous žalúdočné karcinómy a 58As1 a 58As9 bola nezávisle stanovená opakovanou ortotopické implantáciou HSC-58 buniek do steny žalúdka athymických myší, ako bolo opísané skôr [5], [6]. AS1 /Sic50 a AS1 /Sic54 bunky boli stanovené stabilné transfekcia NDRG1 zhrnie do 58As1 buniek. Všetky bunkové línie boli udržiavané v RPMI-1640 médiu doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (FBS). BxPC-3, A ľudské pankreatické rakoviny bunkové línie, bola získaná od American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 protilátka bola vytvorená ako bolo opísané skôr [34]. Ďalšie protilátky boli zakúpené takto: anti-β-aktínu protilátky a anti-šnek protilátky boli od abca; proti β-katenin protilátku, anti-β-katenin (ser 33/37), anti-β-katenin (Ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β protilátka, anti-EGFR protilátku, anti-GAPDH protilátka, anti-p-GSK-3β protilátka, anti-ERK1 /2 protilátka anti-p-ERK1 /2 protilátka, anti-AKT, anti-p-AKT protilátky boli od Cell Signaling Technology; anti-vimentin protilátku bol od Calbiochem; anti-E-cadherin protilátok bol od BD. CT99021 bol zakúpený od Axon Medchem BV (Holandsko).

Gene Expression microarrays

Komplementárna RNA bol amplifikovaný, označené, a hybridizuje sa s 44K Agilent 60-mer oligomicroarray v súlade s pokynmi výrobcu (Agilent technologies). Všetky hybridizované microarray sklíčka bola snímaná Agilent skenera. Relatívne intenzity hybridizácia a hodnoty hybridizácia pozadia boli vypočítané za použitia Agilent Feature Extraction Software. Ak chcete zistiť nahor alebo nadol regulované gény, sme vypočítali pomery (non-log zmenšený rozkladací zmeny) z normalizovanej intenzity signálu každej sondy pre porovnanie medzi kontrolnou a experimentálne vzorky. Potom sme založili kritériá pre regulované gény: up-regulovaných génov, pomer ≥2-fold; down-regulované gény, pomer ≤0.5.

Construct z NDRG1 zhrnie a Zriadenie NDRG1 Knockdown bunkové línie

Ak chcete získať ľudského a U6 siRNA vektor na báze pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), U6 promótor ľudského (obsahujúce Hind III a
Bam HI
klonovacie miesta) bola amplifikovaná z ľudskej genómovej DNA s páru primerov 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC a 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, a ligován do bGL II
pozemok pcDNA3. Čiastkové fragmenty DNA ľudského NDRG1 DNA boli chemicky syntetizované a klonovaný do pcDNA3-hU6siRNA štiepi Hind III a
Bam HI
produkovať pcDNA3shNDRG1. Syntetizované DNA pre pcDNA3shNDRG1 boli: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA a: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Slimák cDNA bol pripravený ako bolo opísané skôr [35]. Šnek cDNA sa ligu do pcDNA3 (pcDNA3-Slimák). Bunky boli transfekovány pcDNA3shNDRG1 alebo pcDNA3-šnek s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen) po protokolu výrobcu. Stabilné prenesené klony boli stanovené s použitím výberu G418.

transfekcia malé interferujúce RNA

siRNA, čo zodpovedá nukleotidových sekvencií šnek a beta-kateninu boli zakúpené od Invitrogen (Carlsbad, CA), v danom poradí, siRNA duplexy boli tranfected použitím Lipofectamine RNAiMAX a Opti-MEM médiu (Invitrogen) v súlade s odporúčaním pre výrobu je.

Luciferase Assay

Ak chcete získať E-cadherinu-Luc vektor E-cadhein promótor (-262 do +120) bola amplifikovaná pomocou PCR za použitia nasledujúcich párov primerov: 5'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'a 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Zdôrazňuje ukazujú reštrikčné enzým štiepiaci miesta. Amplifikovanej fragment bol ligován do vektora ľahko pGEM-T (Promega) a prevedené do pGL3-basic Vector (Promega) v miestach BglII a HindlII. E-cadherin-luc a pcDNA3-Slimák boli transfekovány použitím Lipofectamine LTX a Opti-MEM médiu (Invitrogen) v súlade s odporúčaním pre výrobu je. Po 24 h sa aktivita luciferázy bola meraná v súlade s pokynmi výrobcu (Promega). Ďalej sme skúmali aktivitu luciferázy poháňaný beta-kateninu pomocou TopFlash reportéri vektor, ako bolo opísané skôr [18].

Soft Agar Assay kolónie tvoriacich

4 x 10 ^{3 bunky boli nanesené v 1 ml kultivačného média s obsahom 0,36% (w /v), vrchný agar navrstvený nad bazálnej vrstve 0,72% (hmotnosť /objem) agaru v 6-jamkových doštičiek a ponechané rásť po dobu 3-4 týždňov. Kolónie boli fotografované a počítané v desiatich náhodne zornom poli pri 50X zväčšení za použitia svetelnej mikroskopie. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}

Western blot analýza a frakcionovaním jadre a cytoplazme

Bunky boli lyžovanie v pufri obsahujúcom 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 10 ug /ml aprotinínu, 10 ug /ml leupeptinu a 1 mM Na3VO4. Celkové fragmenty buniek boli podrobené SDS-PAGE a prenesené na Immobilon membrány (Millipore Corp., Bedford, MA), ako bolo opísané skôr [24], [25]. Na prípravu cytosolu a nukleárnej frakcie boli bunky lyžovanie v Buffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM chloridu draselného, ​​10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% IGEPAL a inhibítory proteázy) a inkubuje sa po dobu 20 minút na ľade. Po odstredení (3 min, 5000 otáčok za minútu), supernatant bol použitý ako cytoplazmatické frakcie. Výsledné pelety boli resuspendované v bufferB (20 mM HEPES, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM DTT a inhibítory proteázy) a inkubuje sa na dobu 2 hodín za stáleho miešania pri teplote 4 ° C. Po odstredení (5 min, 15000 rpm), supernatant bol použitý ako jadrová frakcia.

• Ploche ONE: Vyjadrenie Profilovanie kmeňových buniek súvisiace génov v neoadjuvantná farbené rakoviny žalúdka: A NOTCH2, GSK3B a β-katenin Gene Podpis predpovedá prežitie
• Ploche ONE: Úloha vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) a VEGF-R genotypizácia pri vedení metastatického procesu v pT4a resekciou rakovina žalúdka u pacientov