PLOS NËMMEN: N-myc afgerappt reegelen Gene 1 (NDRG1) förderen Metastasen vun Mënscherechter Scirrhous Gastric Cancer BTS duerch Epithelial Mesenchymal Transitioun

Wat VerfÜgung

Eis rezent Etude bewisen, datt héich Expressioun vun N-myc downregulated Gentherapie 1 (NDRG1) ass enk mat aarmséileg hätt an gastric Kriibs Patienten soll. An dëser Etude, gefrot mir ob NDRG1 dréien Biergleit am malignant Werdegang dorënner Metastasen vun gastric Kriibs Zellen huet. Vun der Gentherapie Ausdrock microarray Analyse Ausdrock vun NDRG1 zougedréckt a dem héichen Erhéijung ënnert enger total vun 3691 bis-reegelen Genen vun enger héich metastatic gastric Kriibs Zell Linn (58As1) wéi hir Elteren niddereg metastatic Kolleg (HSC-58). Déi héich metastatic Zell Linnen zougedréckt ofgeholl Ausdrock vu E-cadherin, zesumme mat verstäerkte Ausdrock vun vimentin an Wéngertsschleek. Dëst ofgeholl Ausdrock vu E-cadherin vun Wéngertsschleek knockdown zu héich metastatic Zell Linnen restauréiert gouf. Mir etabléierten nächst stabil NDRG1 knockdown Zell Linnen (As1 /Sic50 an As1 /Sic54) aus dem héichste metastatic Zell Linn, an zwee vun dësen Zell Linnen zougedréckt verstäerkte Ausdrock vu E-cadherin a rofgaang Ausdrock vun vimentin an Wéngertsschleek. An och, E-cadherin Promoteur-Hausse gouf luciferase Aktivitéit fonnt an der héichgradeg metastatic Zell Linn vun NDRG1 knockdown fräi ze ginn. NDRG1 knockdown zu Zell gastric Kriibs zougedréckt Invasioun vu Kriibs Zellen an ëmginn Stoffer opgeléist, Trupen Metastasen zu der peritoneum a rofgaang ascites Heefung zu Mais mat Taux wesentlech verbessert Iwwerliewensfro. Dëst ass den éischte studéieren ze beweisen dass NDRG1 seng dréien Roll an der malignant Werdegang vun gastric Kriibs duerch epithelial mesenchymal Transitioun spillt VerfÜgung

Fro:. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, IZUMI H, Kawahara A, Kage M , et al. (2012) N-myc afgerappt reegelen Gene 1 (NDRG1) förderen Metastasen vun Mënscherechter Scirrhous Gastric Cancer BTS duerch Epithelial Mesenchymal erbäizeféieren. PLoS NËMMEN 7 (7): e41312. Doi: 10.1371 /journal.pone.0041312 VerfÜgung

Redakter: Rakesh K. Srivastava, D'Universitéit vu Kansas Medical Center, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: Dezember 8, 2011; Akzeptéiert: 22 Juni, 2012; Publizéiert: 23. Juli 2012 zu

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Etude duerch Subventiounen-zu-Hëllef fir Cancer Research aus dem Educatiounsministère, Kultur, Sport, Wëssenschaft an Technologie vun Japan (Dr. Bono), a vun der 3. Fonctionnären Aneneegräifend Control Fuerschung fir Cancer vum Gesondheetsministère ënnerstëtzt gouf, Aarbechtsmaart, an Wuelergoen vun Japan (Dr. Kuwano). D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs ass eent vun de meescht genannten malignancies an Japan an aner asiatesch Länner. De Patient hätt vun scirrhous gastric carcinoma ass besonnesch schlecht. Scirrhous gastric carcinoma ass vun peritoneal Verbreedung an Metastasen zu der lymph Wirbelen a Liewer, déi sérieux Problemer oft begleet, déi gin kontrolléiert hunn. Gene Ausdrock Profil réischt Gentherapie amplifications vun K-sam an c-kennegeleiert 30-40% vun scirrhous gastric Cancers, an datt d'overexpression vun verschiddenen Wuesstem Facteuren, wéi transforméiert Wuesstem Faktor-β (TGF-β), platelet-ofgeleet Wuesstem Faktor (PDGF), Insulin-wëll Wuesstem Faktor (IGF) an fibroblast Wuesstem Faktor-2 (FGF-2) [1]. Rezent DNA microarray Analyse bewisen spezifesch upregulation vu verschiddene Genen dorënner SPARC VerfÜgung, RGEIII VerfÜgung, S100A10 VerfÜgung, an collagen Typ ech [2] -. [4] VerfÜgung

Déieren Modeller dass d'Charakteristike vun kriibserreegend peritonitis an Metastasen zu der peritoneum spigelen sinn wichteg d'Entwécklung vun malignant Werdegang vun gastric Kriibs an Verständnis. Yanagihara et al. VerfÜgung [5] gegrënnt éischt de HSC-58 Zell Linn vum Mënsch scirrhous gastric Kriibs, an etabléiert dann zwou sublines, 58As1 an 58As9, mat engem héije Potenzial fir peritoneal Verbreedung an lymph Node Metastasen vun widderholl orthotopic inoculation vun HSC-58 Zellen an der gastric Mauer vun athymic Mais [6], [7]. Dës sublines oft Ursaach Heefung vun ascites der orthotopic ofgestouss a weisen fräi Meenungsäusserung vun Genen Zeechesaatz proteases a Proteinen zu Zell Haftung Équipe, Zell motility, Prolifératioun an angiogenesis [6]. Si wuessen och selektiv an der gastric submucosa, a violéieren der verstäerkter futti der serosal Fliger vun der Mo ze erreechen [7]. Mä et bleift kloer firwat se esou eng héich Potential fir Metastasen während Auswiel Qualifikatiounen hunn. VerfÜgung

An eis heiteg studéieren, mir dës héich metastatic Zell Linnen benotzt ze kucken wéi mënschlech gastric Kriibs Zellen metastatic Potential gewannen konnt. Mir Verglach éischt Gentherapie Ausdrock Profiler tëscht héich metastatic an niddreg metastatic Elteren Zell Verse microarray Analyse. Mer do op eng Gentherapie Numm N-myc afgerappt reegelen Gentherapie 1 (NDRG1) well et fonnt Ofstand zu der héichgradeg metastatic gastric Kriibs Zell Linnen am Verglach zu hire Kolleg Zellen upregulated gin. Et war och schonn confirméiert, datt NDRG1 Ausdrock engem predicative Bewaacher fir malignant Werdegang an aarme hätt an gastric Patienten huet [8]. Konsequent mat dëser Etude, observéiert mir dat Héich NDRG1 Ausdrock vill mat entholl angiogenesis an malignant Werdegang zesumme mat aarmséileg hätt an gastric Kriibs soll war [9]. Mir Rapport och dass NDRG1 knockdown induces ofgeholl Produktioun vun mächtegst angiogenic Facteuren an entholl angiogenesis vun haett Kriibs Zellen, an och dass NDRG1 ass eng predictive Bewaacher fir entholl angiogenesis an aarme hätt an Patienten mat net-kleng Zell haett Kriibs [10]. NDRG1, ee vun de véier NDRG Famill Genen, weist also verschiddenste Funktiounen [11], an NDRG1 Funktiounen entweder als Metastasen suppressor oder als oncogenic an malignant Promoteur, je entholl Zorte [11], [12]. Ausserdeem, ass kontrolléiert Ausdrock vun NDRG1 Gentherapie enk vun N-Myc an Zesummenhang Myc Famill Proteinen [13] an overexpression vun c-Myc entschlof epithelial mesenchymal Transitioun (EMT) zu mammary epithelial Zellen [14]. Déi wichteg Roll vun EMT ass oft an seng enk Kontext vun der Entwécklung an entholl Werdegang dorënner Kriibs Metastasen [15], [16] bezeechent. Ee vun dësen Studien, war de reglementaresche Roll vun NDRG1 net studéiert. An eis heiteg studéieren, ze propagéieren mir de metastatic Potential vun gastric Kriibs Zellen duerch seng Korrelatioun mat EMT-baséiert Roll vun NDRG1. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Se Zell Wuesstem, Zell grousse Ganzen, entholl Wuesstem, Publikatioun an Gene Expression Profiler tëscht immens Metastatic Gastric Cancer Zell zesummeféieren an hir Low Metastatic Amtskolleg VerfÜgung

haalt mat virdrun Studien [6], [7], déi héichgradeg metastatic Kriibs Zell Linnen 58As1 an 58As9 zougedréckt méi Wuesstem Tariffer wéi hir Elteren Kolleg, HSC-58, mat Zäite vun 23-26 HR Verglach mat 30 HR fir Elteren Zellen (Dorënner 1A) Verdueblung. 58As1 Zellen sech einfach ugebauten an zougedréckt Ophiewe-Typ Zell Wuesstem mat Ronn Wirklechkeet, iwwerdeems HSC-58 an 58As9 Zellen verbonnen huet an zougedréckt layered Zell Wuesstem mat engem fibroblastic Wirklechkeet (Dorënner 1B). Béid 58As1 an 58As9 Zellen zougedréckt a vill méi héich entholl Wuesstem Tariffer vun engem subcutaneous xenograft Modell Verglach zu den Elteren HSC-58 Zellen (Dorënner 1c). Virdrun Etuden bewisen, dass d'orthotopic Transplantéiere vu 58As1 Zellen vill méi héich peritoneal Verbreedung an ascites Heefung entschlof wéi déi vun HSC-58 Zellen [6], [7]. Mir bestätegt weider der peritoneal Verbreedung vun der Zellen vun hinnen an der peritoneal Discours vun Mais implanting. Mais implanted mat 58As1 Zellen zougedréckt a dem Opkommen vun der Moyenne vun 8 ± 3 siichtbar noverfollegt vun der mesenterium vun all Maus an Heefung vun ascites (rangéiert vun 0.7-2.5 ml /Maus) (Dorënner 1D, E). Par contre, implanted Mais mat den Elteren HSC-58 Zellen duerch d'Opstellung vun e puer wann all kleng Tountafele noverfollegt ginn, a keng visuell Heefung vun ascites. VerfÜgung

Mir nächst Verglach Gentherapie Ausdrock Profiler tëscht 58As1 Zellen an hir Elteren Kolleg, HSC- 58, mat DNA microarray Analyse. Vun de 41.000 RNS gët a Varianten, identifizéiert mir 3691 differentially ausgedréckt Genen déi zu 2-fantastesch upregulated goufen, an 3536 Genen datt zu 58As1 Zellen zu 0,5-fantastesch oder manner downregulated sech am Verglach zu HSC-58 Zellen. Figur 1F virgestallt Genen datt differentially zu 58As1 Zellen ausgedréckt huet am Verglach zu HSC-58 Zellen, an déi eesäiteg der Famill NDRG gehéiert, an Genen ze Metastasen dinn, dorënner Matrixentgasung metalloproteinases (MMPs) /cathepsins, Haftung an epithelial-mesenchymal-Iwwergank ( EMT). Vun de véier Genen vun der NDRG Famill [17], den Ausdrock vun NDRG1 an NDRG4 war an der héichgradeg metastatic Zell Linn (58As1) am Verglach zu den Elteren Zell Linn (HSC-58) upregulated. Den Ausdrock vun EMT-Zesummenhang Genen vun 58As1 Zellen war virun allem duerch d'Acquisitioun vun engem héije metastatic Potential betraff. Den Ausdrock vun epithelium-spezifesch Genen, dorënner E-cadherin ( CDH1 VerfÜgung), P-cadherin ( CDH3 VerfÜgung) an β-catenin ( CTNNB1 VerfÜgung), war downregulated . Par contre, war just MMP1 ( MMP1 VerfÜgung) Ausdrock Ofstand upregulated; den Ausdrock vun cathepsin L ( CTSL1 VerfÜgung) war fräi, mä dass vun cathepsin B ( CTSB VerfÜgung) war net. Den Ausdrock vun mesenchyme-spezifesch Genen, vimentin ( VIM VerfÜgung) an Wéngertsschleek ( SNAI1 VerfÜgung), e Schlëssel Transkriptiouns Faktor fir d'Ennerdréckung vun E-cadherin Ausdrock, war upregulated. VerfÜgung

Geographie NDRG1 Gene Expression an immens Metastatic Gastric Cancer Zell zesummeféieren VerfÜgung

Mir Verglach weider d'FAQ Ausdrock vu verschiddene Genen am HSC-58, 58As1 an 58As9 Zellen (Dorënner 2A). Den Ausdrock vun NDRG1 Ofstand Lamb, an dat vun vimentin, Wéngertsschleek, p-ERK1 /2, p-Akt, an p-GSK-3β war och fräi, an souwuel 58As1 an 58As9 Zellen am Verglach mat HSC-58 Zellen. Et war keen visuellen Ausdrock vun Wnt3a an Wnt5a an dës Zell Linnen (Daten dës net). Par contre, observéiert mir ofgeholl Ausdrock vu E-cadherin an β-catenin zu 58As1 an 58As9 Zellen am Verglach mat HSC-58 Zellen (Dorënner 2A). Phosphorylation vun β-catenin Ser33 /37 an Ser552 gouf fonnt vill gin manner an 58As1 an 58As9 wéi HSC58. Konsequent mat der FAQ Ausdrock Niveauen, mRNA Ausdrock Niveau vun NDRG1, vimentin, Wéngertsschleek an MMP-1 waren héich an zwou héichste metastatic Zell Linnen ewéi hir Elteren Kolleg (Dorënner 2B). Et war vill manner mRNA Ausdrock vu E-cadherin an β-catenin zu souwuel 58As1 an 58As9 wéi HSC-58. VerfÜgung

Immunocytochemical Analyse Teamchef Lokalisatioun vun E-cadherin souwuel zu Zytoplasma an Membran, an β-catenin war zu Zytoplasma zu souwuel HSC-58 an 58As9 Zellen (Dorënner 2C) meeschtens en der. Immunocytochemical Analyse fir 58As1 net geschloen ginn hätt als 58As1 zu Ophiewe geplëmmt. Ausserdeem, Ausdrock vun β-catenin war relativ niddreg a béid Zytoplasma an helle mä dass vun Wéngertsschleek war ze gin vill méi héich am helle 58As1 an 58As9 wéi HSC-58 (Dorënner 2D) fonnt. Mir iwwerpréift och E-cadherin Promoteur Aktivitéit (Dorënner 2E) an β-catenin entschlof reporter Aktivitéit vun TopFlash reporter assay (Dorënner 2F) a fonnt, datt et däitlech Verloschter an der luciferase Aktivitéit gouf eng Hausse vun E-cadherin Promoteur an och duerch β-catenin souwuel 58As1 an 58As9 Verglach mat HSC-58, konsequent mat mRNA Niveaue vu béiden Genen. VerfÜgung

NDRG1 Knockdown Induces der Upregulation vun E-cadherin an der Downregulation vun Vimentin an Wéngertsschleek an immens Metastatic BTS VerfÜgung

Mir iwwerpréift nächst ob NDRG1 knockdown speziell den Ausdrock vun EMT-Zesummenhang Genen am héichste metastatic Zell Linn, 58As1 betraff. Mir etabléierten zwee stabil NDRG1 knockdown Zell clones, As1 /Sic50 an As1 /Sic54 vun NDRG1 shRNA an 58As1 Zellen transfecting. Béid As1 /Sic50 an As1 /Sic54 Zellen zougedréckt ähnleche Wuestum Tariffer fir all aner an hir Elteren Amtskolleg As1 /Mock3, mat Zäite vun 25-27 HR zu Kultur (Dorënner 3A) Verdueblung. Béid NDRG1 entsat Zell Linnen zougedréckt knapper Haftung vun Zellen fir d'Kultur gett an fibroblastic Wirklechkeet hierkommen As1 /Mock3 Zellen engem Ophiewe-Typ Zell Wuesstem mat Ronn Zell Wirklechkeet (Dorënner 3B) gewisen. Mir iwwerpréift nächst den Effet vun NDRG1 silencing op der tumorigenic Aktivitéit vun 58As1 Zellen eng Hafen-onofhängeg Wuesstem assay benotzt. Béid NDRG1 entsat Zell Linnen zougedréckt däitleche Minus vun hire Hafen-onofhängeg Wuesstem, wéi vun Amphipolis Zuel vun mëll Agar uginn ( * p &Si besteet; VerfÜgung 0.01). (D'Grondidee 3C) VerfÜgung

Dunn mir Verglach der Gentherapie Ausdrock Profiler tëscht As1 /Mock3 an As1 /Sic50 Zellen DNA microarray Analyse benotzt (Dorënner 4A). NDRG1 knockdown schéinen fräi Ausdrock vun der E-cadherin ( CDH1 VerfÜgung) a P-cadherin ( CDH3 VerfÜgung) mee ofgeholl Ausdrock vun der vimentin ( VIM VerfÜgung) an Wéngertsschleek ( SNAI1 VerfÜgung). Mir standing nächst westlech blot an qRT-RCR Analysë fir verschidden Molekülle datt duerch NDRG1 knockdown an der microarray Analyse (Dorënner 4B, C) modulated goufen. Dës zwee Zell Linnen awer vill manner Ausdrock vu béiden NDRG1 mRNA an FAQ Verglach zu der As1 /Mock3 Zellen. Verstäerkte Ausdrock vu E-cadherin war konsequent observéiert zu As1 /Sic50 an As1 /Sic54 Zellen am Verglach zu As1 /Mock3 Zellen duerch westlech blot Analyse. An As1 /Sic50 an As1 /Sic54 Zellen, souwuel westlech blot an qRT-Hinnen alleguer analyséiert ofgeholl Ausdrock vun vimentin an Wéngertsschleek bestätegt ouni Ausdrock Auswierkungen vun p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β an GSK-3β (Dorënner 4B, C). VerfÜgung

Wéinst dem, ass NDRG1 bekannt ze Metastasen an Zell Prolifératioun vun Aarbecht a Colon Kriibs Zellen oofgesinn. Rezent Studien hu bewisen, datt NDRG1 modulates Wnt-β-catenin sécher Passerelle mat verstäerkte Ausdrock vu E-cadherin zu mënschlech Aarbecht an Colon Kriibs Zell [18], [19]. NDRG1 knockdown zu 58As1 Zellen Allerdéngs huet Afloss net de β-catenin Ausdrock souwuel um FAQ a mRNA Niveau (Dorënner 4B, C). An och β-catenin gefuerene Promoteur Aktivitéit vun TopFlash reporter assay réischt keen Ënnerscheed zu de Promoteur Aktivitéit tëscht As1 /mierkt an NDRG1 Zell Linnen entsat. Dofir, war β-catenin Ausdrock net vun NDRG1 knockdown betraff. NDRG1 knockdown also konsequent Ausdrock vu E-cadherin fräi a rofgaang Ausdrock vun Wéngertsschleek an vimentin am héichste metastatic Zell Linn. Allerdéngs gouf et keng visuell Ännerung vun Ausdrock vun β-catenin vun NDRG1 knockdown. VerfÜgung

Geographie E-cadherin Promoter Aktivitéit vun NDRG1 Knockdown duerch Wéngertsschleek zu Gastric Cancer BTS VerfÜgung

Of verschidde Transkriptiouns Facteuren déi oofgesinn Ausdrock vun E-cadherin dorënner Wéngertsschleek, Slug, Twist, TCF4 an SIP1 [20], Ausdrock vun Wéngertsschleek war vun NDRG1 zu gastric Kriibs Zellen speziell modulated. Mir iwwerpréift ob Ausdrock vu E-cadherin an /oder vimentin vun Wéngertsschleek am HSC-58 Zellen regulariséiert ginn hätt. Flüchteg Behandlung mat Wéngertsschleek siRNA schéinen fräi Meenungsäusserung vun E-cadherin, mee net dass vun vimentin an NDRG1, an Zäit-ofhängeg Manéier (Dorënner 5A). Et war nëmmen e schmäerzhafte wann keng Erhéijung vun β-catenin Ausdrock vun Wéngertsschleek knockdown. Doriwwer eraus, war E-cadherin Promoteur-Undriff luciferase Aktivitéit vill vun transfection vun Wéngertsschleek ergänzen DNA an zwee Kriibs Zell Linnen getest (Dorënner 5B) opgeléist. Mir Verglach nächst E-cadherin Promoteur Aktivitéit tëscht As1 /Mock3 a seng NDRG1 entsat Zell Linnen. Als zu Dorënner 5C gesinn, et war wichteg (* p VerfÜgung &Si besteet; 0,05) Opléisung vun E-cadherin Promoteur Aktivitéit vun NDRG1 knockdown VerfÜgung

GSK-3β ass e Schlëssel Aktivitéit fir Aktivatioun vun EMT. Passerelle [20], [21], an och fir phosphorylation vun NDRG1 [22], [23]. Ausdrock vun p-GSK-3β war an der héichgradeg metastatic Zell Zeil fräi, 58As1 (Dorënner 2A gesinn). Mir iwwerpréift ob GSK-3β zu NDRG1 entschlof verännert Ausdrock vu E-cadherin an vimentin Équipe war. Behandlung mat enger inhibitor (CT99021) vun GSK-3β schéinen ofgeholl Ausdrock vun p-NDRG1 a p-GSK-3β, an och Ausdrock vun E-cadherin an β-catenin zu 58As1 Zellen (Dorënner 5D) fräi. Als zu Dorënner 5E gewisen, knockdown β-catenin hutt Afloss net Ausdrock vu E-cadherin, vimentin an Wéngertsschleek. VerfÜgung

NDRG1 Knockdown Induces Mesenchymal Epithelial Transitioun an Hien Metastasen zu der Peritoneum vun recommandéieren Metastatic Gastric Cancer BTS VerfÜgung

Tariffer entholl Wuesstem Wann een vun As1 /Mock3, As1 /Sic50 an As1 /Sic54 Zellen zu engem xenograft Modell réischt lues entholl Wuesstem Taux vu béiden As1 /Sic50 an As1 /Sic54 vun NDRG1 knockdown (Dorënner 6A, B). NDRG1 knockdown Trupen dem lokal Invasioun vun As1 /Mock3 entholl Zellen an der Géigend stroma an bascht adipose an /oder Fleesch Otemschwieregkeeten, an nemmen dei ouni entholl Wuesstem (Dorënner 6C). Héich Ausdrock vu E-cadherin war zu As1 /Sic50 an As1 /Sic54 erhéijen observéiert, iwwerdeems héich Ausdrock vun vimentin zu Kriibs Zellen vun As1 /Mock3 erhéijen (Dorënner 6D) observéiert gouf. Par contre, war et bal keng Verännerung Ausdrock vun β-catenin zu As1 /Sic50 an As1 /Sic54 erhéijen als Verglach mat As1 /Mock3 entholl. VerfÜgung

Fir iwwerpréifen, ob NDRG1 knockdown Metastasen zu der peritoneum an Heefung Afloss konnt vun ascites, am Verglach mir de metastatic Potential vun As1 /Sic50 an As1 /Mock3 Zellen der orthotopic Transplantatioun. Figur 7A weist Vertrieder Biller vun der erweiterter postwendend misse Discours an der Präsenz vun Kriibs noverfollegt vun der peritoneum. No orthotopic inoculation vun As1 /Sic50 Zellen, war d'Zuel vun de Véi an der peritoneum Rostain ronn 30% manner wéi déi, déi aus As1 /Mock3 Zellen, mä dës erofgoen war net statistesch relevant ( p VerfÜgung = 0.21) (Well 7B). Ee noverfollegt ginn, déi aus As1 /Sic50 Zellen zougedréckt a méi kleng ze gesin wéi déi vun As1 /Mock3 Zellen (Dorënner 7A). D'Heefung vun ascites vun As1 /Sic50 Zellen war vill (* p &Si besteet; 0.01) ofgeholl, fir ronn 10% vun deem entschlof vun As1 /Mock3 Zellen (Dorënner 7C). Doriwwer eraus, war et e wesentlechen (* p VerfÜgung &Si besteet; 0.01) Erhéijung vun der Iwwerliewe Taux vu Mais mat As1 /Sic50 Zellen inoculated (51 ± 16 Deeg) am Verglach mat 35 ± 14 Deeg fir mat As1 inoculated Mais /Mock3 Zellen, wat beweist, datt NDRG1 knockdown Iwwerliewe prolongs (Dorënner 7D). VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Mir virdrun hu bericht, dass NDRG1 enk mat entholl angiogenesis an aarme Iwwerliewe vun Patienten mat gastric Kriibs soll et suggeréiert, dass NDRG1 ass eng predictive uweist fir malignant Werdegang vun gastric Kriibs [9]. Vun eis heiteg studéieren, observéiert mir de folgenden Eegeschafte d'Acquisitioun vun engem héije metastatic Potential vun gastric Kriibs Basisdaten: microarray, westlech blot an RT-Hinnen alleguer zesummen upregulation vun NDRG1 am héichste metastatic Zell Linnen réischt gebueden, 58As1 an 58As9, am Verglach mat hirer niddereg metastatic Elteren Kolleg, HSC-58; héich Ausdrock vun vimentin, Wéngertsschleek, an MMP-1, an ënnen Ausdrock vu E-cadherin an β-catenin waren am héichste metastatic Zell Linnen Verglach mat hir Elteren Amtskolleg evident; vun de Genen vun den héichste metastatic Zell Linn downregulated, schéinen NDRG1 knockdown zu upregulation vun E-cadherin, an downregulation vun vimentin an Wéngertsschleek, awer bal keen Effekt op Ausdrock vun β-catenin; E-cadherin Promoteur Aktivitéit war vill vun NDRG1 knockdown Lamb; NDRG1 knockdown och peritoneal Verbreedung an Heefung vun ascites, an Invasioun vu ganz metastatic Zellen an der Géigend normal Stoffer. VerfÜgung

Am Moment studéieren, NDRG1 knockdown duerchgesat an dem Ophiewe vun Metastasen duerch héich metastatic gastric Kriibs Zellen (Dorënner 6 opgeléist , 7), datt NDRG1 suggeréiert vläicht e Metastasen Promoteur Gentherapie ginn anstatt engem Metastasen suppressor Gentherapie zu gastric Kriibs. Eis presentéieren Etude ënnerstëtzt d'Iddi dass ob NDRG1 ënnerstëtzt oder Hien der malignant Werdegang vun mënschlech Kriibs hänkt op entholl Typen an /oder dat Status [11], [12]. Allerdéngs bleift et kloer firwat NDRG1 Funktiounen als entholl suppressor oder Promoteur op entholl Zorte oder histological Zorte jee. Eis virdrun Etude bewisen, dass NDRG1 entholl Wuesstem an angiogenesis vun Bauchspaicheldrüs Kriibs duerch NDRG1 gefuerene attenuation vun NF-κB sécher Passerelle [24], [25] Hien. Rezent Etude huet confirméiert, dass Ausdrock vun Metastasen suppressor Gentherapie, KAI1 VerfÜgung Gentherapie, an NDRG1 mediated Metastasen Ennerdréckung vun Aarbecht Kriibs duerch ATF3-NF-κB Passerelle Équipe ass [26]. Weider Etude ass néideg déi reglementaresche Mechanismus ze verstoen fir NDRG1 gefuerene Promotioun vun malignant Werdegang vun gastric Kriibs Zellen speziell responsabel ass. VerfÜgung

EMT ass eng rezent Highlight déi mat Kriibs malignant Werdegang dorënner acquirement vun héichgradeg metastatic Potential verbonne sinn enk kéint [15], [16]. An eis heiteg Etude, déi Ausdrock vun E-cadherin an Trupen dem Ausdrock vun vimentin NDRG1 knockdown souwuel verstäerkte kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. NDRG1 kann aus engem Polarisatioun epithelial phenotype zu engem héich motile mesenchymal phenotype eng Schlësselroll an der Liga spillen. Partiell oder komplett Verloscht vun E-cadherin ass oft während de Werdegang Richtung malignancy zu villen erhéijen, inklusiv gastric Kriibs [27], [28] observéiert. Oliveira et al. [29] gemellt enger enker Lien tëscht E-cadherin Verloscht a héich metastatic Potential vun gastric Kriibs. Chan et al. [30] Rapport och soluble E-cadherin als uweist fir länger Iwwerliewe vun gastric Kriibs Patienten. NDRG1 knockdown schéinen relativ héich E-cadherin Ausdrock vun As1 /Sic50 erhéijen an wéi zu As1 /Mock3 erhéijen, suggeréiert datt NDRG1 speziell d'EMT Kontroll kann eventuell duerch d'Transkriptiouns Faktor Wéngertsschleek vun gastric Kriibs Zellen (Dorënner 7). VerfÜgung

Wnt sécher nach dréien Rollen an der malignant Werdegang an Metastasen duerch Kriibs Zellen haett an Broscht [31], [32], an Wnt sécher induces och EMT déi de metastatic Werdegang vun epithelial Kriibs doranner [31], [33]. NDRG1 ass als Metastasen suppressor Gentherapie an Aarbecht an colorectal Kriibs Zell bekannt [11], [12]. Liu et al [18] huet confirméiert, dass NDRG1 Metastasen duerch Wnt /β-catenin sécher Passerelle an Aarbecht Kriibs Zellen Hien. A relevant Etude vun Chen et al [19] huet hien och déi NDRG1 TGF-β-entschlof EMT duerch verännert Ausdrock vun β-catenin an E-cadherin zu colorectal Kriibs Zell modulates. Eis presentéieren Etude zougedréckt ofgeholl Ausdrock vun β-catenin zu souwuel héich metastatic Zell Linnen am Verglach zu den Elteren Kolleg, HSC-58. Allerdéngs, souwuel westlech blot an qRT-Hinnen alleguer analyséiert tëscht héich metastatic 58As1 Zellen a seng zwee NDRG1 entsat Zell Linnen net markéiert Verännerung Ausdrock Niveau vun β-catenin an och β-catenin gefuerene Promoteur Aktivitéit huet. Et schéngt méi wahrscheinlech, dass β-catenin enger Jarnéier Roll an Ennerdréckung vun Metastasen vun NDRG1 knockdown zu héich metastatic Kriibs Zellen spillt. VerfÜgung

Wéinst dem GSK-3β och eng Roll an der Kontroll ze spillen ass gewosst vun EMT [20], [21], an GSK-3β ass eng wesentlech Aktivitéit fir d'phosphorylation vun NDRG1, eng excellent substate vun GSK-3β [22], [23]. Den Ausdrock vun p-GSK3β war relativ héich am héichste metastatic Zell Linnen ewéi hir Elteren Zell Linn (Dorënner 2B). Behandlung mat engem mächtegst inhibitor vun GSK-3β e schéinen Trupen Ausdrock p-NDRG1, begleet vun upregulation vun E-cadherin an β-catenin (Dorënner 5D). Allerdéngs war et bal keen Ënnerscheed zu Ausdrock vun GSK-3β a p-GSK-3β vun NDRG1 knockdown am héichste metastatic Zellen (Dorënner 4B) suggeréiert datt GSK-3β net eng grouss Roll an der Aféierungs- vun EMT duerch NDRG1 Leeschtung vläicht zu gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung

Wéngertsschleek ass e Vertrieder Transkriptiouns Faktor datt Ausdrock vu e-cadherin Kontrollen [20]. Vu verschiddenen reglementaresche Facteuren déi transcriptionally E-cadherin Kontroll, Ausdrock vun Wéngertsschleek war vun NDRG1 zu gastric Kriibs Zell Linnen an dëser Etude benotzt speziell modulated. Wéngertsschleek knockdown entschlof upregulation vun E-cadherin (Dorënner 5A), an exogenous tarnsfection vun Wéngertsschleek cDNA Trupen E-cadherin Promoteur Aktivitéit (Dorënner 5B). VerfÜgung

An héichgradeg metastatic gastric Kriibs Zell Linnen, Ausdrock vun Schleek war upregulated wéi am Verglach zu hire niddereg metastatic Kolleg, HSC-58 (Dorënner 2A, B). Béid NDRG1 entsat Zell Linnen, As1 /Sic50 an As1 /Sic54, zougedréckt ofgeholl Ausdrock vun Wéngertsschleek als Verglach zu hire héich metastatic Kolleg, As1 /Mock3 (Dorënner 4B, C). Doriwwer eraus, war Promoteur Aktivitéit E-cadherin vill stimuléiert a béid NDRG1 entsat Zell Zeilen als Verglach zu hire héich metastatic Kolleg (Dorënner 5C). VerfÜgung

An Conclusioun, NDRG1 knockdown der upregulation vun E-cadherin an downregulation vun vimentin entschlof an Wéngertsschleek, an Trupen der Invasioun, Metastasen an Heefung vun ascites vun der héichgradeg metastatic gastric Kriibs Zellen. Dëst NDRG1 mediated Regulatioun vun E-cadherin an /oder vimentin Ausdrock epithelial mesenchymal Transitioun vun gastric Kriibs Zelle betraff. Dëst NDRG1 entschlof Modifikatioun vun EMT schéngt fir de transcriptional Faktor Wéngertsschleek op d'mannst zu engem Deel zum Deel ze ginn. NDRG1, an seng enk Kontext mat EMT-Zesummenhang Genen, kéint an d'Acquisitioun vun engem héije metastatic Potential vun progressiv gastric Kriibs Zellen deelhuelen. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

spontan a Zell zesummeféieren VerfÜgung

HSC-58 gouf vun der Mënschheet scirrhous gastric carcinomas etabléierten a 58As1 an 58As9 sech duerch widderholl orthotopic ofgestouss vun HSC-58 Zellen an der gastric Mauer vun athymic Mais onofhängeg etabléierten wéi virdru beschriwwen [5], [6]. As1 /Sic50 an As1 /Sic54 Zellen sech duerch d'stabil transfection vun NDRG1 shRNA an 58As1 Zellen etabléiert. All Zell Strecken an RPMI-1640 mëttelfristeg ergänzt mat 10% An et Bovine serum (FBS) haten. BxPC-3, e Mënsch Linnen pancreatic Kriibs Zell, gouf aus der American Type Kultur Collection (Manassas, VA) kritt. Anti-NDRG1 antibody generéiert war wéi virdrun beschriwwen [34]. Aner antibodies sech wéi follegt kaaft: Anti-β-actin antibody an Anti-Wéngertsschleek antibody aus Abcam goufen; Anti β-catenin antibody, anti-β-catenin (SÖSC 33/37), anti-β-catenin (SÖSC 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β antibody, anti-EGFR antibody, Anti-GAPDH antibody, anti-p-GSK-3β antibody, anti-ERK1 /2 antibody anti-p-ERK1 /2 antibody, anti-AKT antibody, anti-p-AKT antibody sech aus Zell sécher Technology; Anti-vimentin antibody war vun Calbiochem; Anti-E-cadherin antibody gouf vum BD. CT99021 war vun Axon Medchem BV (Holland) kaaft. VerfÜgung

Gene Expression Microarrays VerfÜgung

Ergänzungsfuddermëttel RNS Implikatioune war, gekennzeechent, an hybridized zu engem 44K Agilent 60-mer oligomicroarray no der Taktik vum Fabrikant (Agilent Technologies). All hybridized microarray drënner waren déi eng Agilent Scanner gescannt. Relativer hybridization intensities an Hannergrond hybridization Wäerter sech mat Agilent Spillfilmer Extraktioun Software berechent. Z'identifizéieren uewen oder ënnen-reegelen Genen, mir berechent nennen (Net-Logbuch -och fantastesch-Ännerungen) aus der normalized Signal intensities vun all Studiebäihëllefe fir Verglach tëscht Kontroll an experimentell Echantillon. Mir dann Critèren etabléiert fir reegelen Genen: up-reegelen Genen, Verhältnis ≥2-fantastesch; verwandelt-reegelen Genen, Verhältnis ≤0.5. VerfÜgung

Bauen vun NDRG1 shRNA a Grënnung vun NDRG1 Knockdown Zell zesummeféieren VerfÜgung

Mënsch, e U6 siRNA Vecteure op pcDNA3 (Invitrogen, Karlsbad CA) Basis ze kréien de Mënsch U6 Promoteur (wouvun Hind VerfÜgung III an Bam VerfÜgung Salut Klone Siten) vu Mënsch Frankräich DNA mat der primer Pair 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC an 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, an an den Kick war Jonglenster BGL VerfÜgung II Site vun pcDNA3. D'partiell DNA Fragmenter vum Mënsch NDRG1 DNA sech chemesch Wierderbuch a gekloonten an pcDNA3-hU6siRNA eenalecn mat Hind VerfÜgung III an Bam VerfÜgung Salut pcDNA3shNDRG1 ze produzéieren. D'Wierderbuch DNAs fir pcDNA3shNDRG1 goufen: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA an: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. De Wéngertsschleek cDNA war virdrun ëmschriwwen bereet [35]. Wéngertsschleek cDNA war Jonglenster an der pcDNA3 (pcDNA3-Schleek). Zellen sech transfected mat pcDNA3shNDRG1 oder pcDNA3-Wéngertsschleek benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen) folgenden Fabrikant d'Protokoll. Stabil transfected clones benotzt G418 Auswiel etabléiert. VerfÜgung

Transfection vun enger klenger Interfering RNS VerfÜgung

SiRNA Message vun Wéngertsschleek zu Nukleotid entspriechend an β-catenin sech aus Invitrogen kaaft (Karlsbad CA), respektiv, siRNA duplexes sech tranfected Lipofectamine RNAiMAX an Opti-Mem mëttelfristeg (Invitrogen) benotzt no der Recommandatioun d'Chimie. VerfÜgung

Luciferase Assay VerfÜgung

fir E-cadherin-Luc Vecteure, E-cadhein Promoteur (-262 kréien bis +120 war) vun Hinnen alleguer mat der folgender primer Puer Implikatioune: 5'- AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'an 5'- AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3 ". Ënnersträicht weg Restriktioun Aktivitéit Rëss Siten. Implikatioune ofgesprengt gouf Jonglenster an der pGEM-T einfach Vecteure (Promega) an dem pGL3-Basis Vecteure (Promega) zu BglII an HindIII Siten transferéiert. E-cadherin-luc an pcDNA3-Wéngertsschleek huet mat Lipofectamine LTX an Opti-Mem mëttelfristeg (Invitrogen) transfected no der Recommandatioun d'Chimie. No 24 HR, war d'luciferase Aktivitéit gemooss laut den Hiersteller d'Instruktioune (Promega). Ausserdeem, mir luciferase Aktivitéit Hausse vun β-catenin benotzt TopFlash reporter Vecteure och virdrun ëmschriwwen iwwerpréift [18]. VerfÜgung

Haart Agar Kolonie ze grënnen Assay VerfÜgung

4 × 10 3 Zellen sech plated zu 1 ml vu Kultur mëttelfristeg 0,36% (w /v) erop Agar layered iwwer eng basal futti vun 0,72% (w /v) Agar zu 6-och Telleren an Nodeems si fir 3-4 Wochen ze wuessen. Kolonien huet an zéng ënnerschiddleche Beräicher vun Vue op 50X Vergréisserung mat liichtem microscopy fotografeschen an gezielt. All Experimenter war zu triplicate gemaach. VerfÜgung

Western Blot Analys an Zersteckelung vun Nucleus an Zytoplasma VerfÜgung

BTS sech zu gefiermt lysed mat 50 mm Tris-HCl, 350 mm NaCl, 0,1% NP40, 5 mm héich, 50 mm NaF, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg /mL aprotinin, 10 μg /mL leupeptin, an 1 mm Na3VO4. Total Zell lysates sech ze SDS-PAGE ënnerworf an blotted op Immobilon Schläimhait (Millipore Corp., Bedford, MA) wéi virdru beschriwwen [24], [25]. Ze preparéieren Zytosol an nuklear Ëmwandlung, goufen Zellen zu bufferA lysed (10 mm HEPES, pH 7,9, 10 mm KCl, 10 mm héich, 1 mm DTT, 0,4% IGEPAL an protease inhibitors) a fir 20 min op Äis incubate. No centrifugation (3 min, 5000 Ziichter), supernatant war den cytoplasmic Ëmwandlung benotzt. Déi doraus resultéierend Pellets sech zu bufferB (20 mm HEPES, pH 7,9, 200 mm NaCl, 1 mm héich, 5% glycerol, 1 mm DTT an protease inhibitors) an incubated op fir 2 HR mat kontinuéierlech Onroue bei 4 ° C resuspended. No centrifugation (5 min, 15,000 Ziichter), supernatant war den nuklear Ëmwandlung benotzt.

• PLOS NËMMEN: Expression Profiling vun Stammzellenfuerschung-Contenu Genen vun Neoadjuvant-Traité Gastric Cancer: Eng NOTCH2, GSK3B an Gene ënnerschriwwe β-catenin renomméierter däitscher Zeitung…
• PLOS NËMMEN: Roll vun wiere Endothelial Wuesstem Factor (VEGF) an VEGF-R Genotyping der Metastatic ënnerzéie pT4a Resected Gastric Cancer Patients