Ploche ONE: znížená expresia AZGP1 je spojené s zlou prognózou v primárnej žalúdku Cancer

abstraktné

Pozadie

2-Zinc-glykoproteínu 1 (AZGP1) je multidisciplinárny proteín, ktorý sa podieľa na mnohých dôležité funkcie v ľudskom tele, vrátane hnojenie, imunoregulaci a lipidovej mobilizácie. V poslednej dobe bolo preukázané, že AZGP1 sa tiež podieľa na karcinogenéze a diferenciácie nádoru. V tejto štúdii sme skúmali úrovne expresie a prognostickú hodnotu AZGP1 v primárnych karcinómov žalúdku.

Metódy a výsledky

Sledovali sme expresiu AZGP1 v 35 párované rakovinový a uzavreté priľahlé nenádorové sliznicu žalúdka tkaniva v reálnom čase kvantitatívne RT-PCR (QRT-PCR) a western blotting. Okrem toho sme analyzovali AZGP1 výraz v 248 pacientov, ktorí podstúpili resekcia postupov medzi rokmi 2005 a 2007 pomocou imunohistochémia. Vzťahy medzi úrovňami AZGP1 expresie sa prešetrili klinicko-patologické faktory a prežitie pacienta. AZGP1 expresia bola významne znížená u oboch mRNA ( P
= 0,023) a proteínové hladiny ( P
= 0,019) vo vzorkách nádorovom tkanive, v porovnaní s expresiou v susedných párových vzoriek nenádorových tkanív , Tieto údaje imunohistochemické farbenie ukázalo, že AZGP1 expresie bola v 52,8% (131/248) žalúdočného adenokarcinómu prípadov výrazne znížila. Klinicko-analýza ukázala, že znížená expresia AZGP1 významne koreluje s umiestnením tumoru ( P
= 0,011), histologického stupňa ( P
= 0,005) a T fázu ( P
= 0,008). Prežitie Kaplan-Meier krivky bolo zistené, že znížená expresia AZGP1 bola spojená so zlou prognózou u pacientov s adenokarcinómom žalúdka ( P
= 0,009). Multivariačný Cox analýza identifikovala AZGP1 výraz bol nezávislý prognostický faktor pre celkové prežívanie pacientov s adenokarcinómom žalúdka (HR = 1.681, 95% CI = 1.134-2.494, P
= 0,011).

Závery

Naša štúdia naznačuje, že AZGP1 by mohlo slúžiť ako kandidát nádorový supresor a potenciálneho prognostického biomarkeru v žalúdočnej karcinogenéze

Citácia :. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li YF, Jiang ss, et al. (2013) znížená expresia AZGP1 je spojená s horšou prognózou v primárnej rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10,1371 /journal.pone.0069155

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Španielsko |

prijatá: 05.03.2013; Prijaté: 5.6.2013; Uverejnené: 23.júla 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená dizertačnej fondu Ministerstva školstva Číny (20100171110084). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

žalúdka rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete, s 988,000 nových prípadov a 736,000 úmrtí ročne [1] - [2]. V Číne, rakovina žalúdka bol predpovedaný byť treťou najčastejšou rakovinou v roku 2005 s 0,4 miliónmi nových prípadov a 0,3 milióna úmrtí hlásených [3]. Liečba rakoviny žalúdka zahŕňa kombináciu chirurgia, chemoterapia a rádioterapie. Ale takmer 60% postihnutých pacientov podľahne rakovine žalúdka po samotnom kuratívny resekcii alebo po kuratívny resekcii s následnou adjuvantnej terapie [4]. Karcinómu žalúdka je heterogénne ochorenie, ako histológie a genetiky; teda výsledok pacient je ťažké predpovedať pomocou klasických histologických klasifikácie. Žalúdočné karcinogenézy je multifaktoriálne a viacstupňový proces, ktorý zahŕňa aktiváciu onkogénov a inaktivácia supresorových génov v rôznych štádiách progresie rakoviny žalúdka. V poslednej dobe boli identifikované niekoľko nových onkogénov a tumor supresorové gény spojené s rakovinou žalúdka. Preto je klinicky dôležité nájsť účinné nové ciele pre včasnú diagnózu a účinnú liečbu rakoviny žalúdka.

AZGP1 (2-zinok-glykoproteínu 1, Zn-alfa 2-glykoproteín) je 41 kDa proteín, rozpustný s hlavného histokompatibilního komplexu-1 (MHC-1) -like zložiť v jeho štruktúre, a to bolo pôvodne identifikovaný a purifikovaný v ľudskom sére v roku 1961 [5]. Gén pre AZGP1, priradený k chromozómu 7q22.1 pomocou fluorescenčnej hybridizácie karyotypu, sa skladá zo štyroch exónov a intronom tri [6], [7]. Pomocou imunohistochemických štúdií, bolo zistené, že AZGP1 je exprimovaný hlavne v epiteliálnych bunkách prsníka, prostaty, pečene a rôznych iných gastrointestinálnych orgánov, [8]. V súlade so svojou výrobu o sekrečnú epitelové bunky, AZGP1 sa vyskytuje v mnohých telesných tekutinách [9], [10], [11].

AZGP1 je multidisciplinárny proteín, ktorý sa podieľa na mnohých dôležitých funkcií v ľudské telo, vrátane oplodnenia [11], imunoregulaci [12] a lipidové mobilizácia [13], [14], [15]. AZGP1 je tiež spájaný s rakovinou kachexia. AZGP1 má vysokú úroveň aminokyselinové sekvenčné homológie s lipidmi mobilizáciu faktor nádoru odvodeného [14], a na myšiam modeli nádorov produkujúcich AZGP1, AZGP1 stimulovanej lipolýzu v adipocytoch, ktoré vedú k kachexii [16]. V poslednej dobe bolo preukázané, že AZGP1 sa tiež podieľa na karcinogenéze a diferenciácie nádoru. Proteínové a mRNA expresie testy ukázali vzťah medzi úrovňou AZGP1 a histologické stupeň s rakovinou prsníka, nádorov [17], [18]. Okrem toho, mnoho štúdií naznačujú, že AZGP1 je potenciálny sérum markerom karcinómu prostaty [9], [19]. Okrem toho bolo preukázané, že pôsobí ako AZGP1 nové nádorový supresor v rakoviny pankreasu [20]. Avšak, neboli uvedené, ak je stav expresie AZGP1 a prognostický význam tohto proteínu v primárnych karcinómov žalúdku.

V tejto štúdii sme analyzovali hladinu AZGP1 výraz v karcinómov žalúdka pomocou real-time kvantitatívne RT -PCR (QRT-PCR), western blotting a imunohistochémia. Ďalej sme zistili vzťah medzi AZGP1 prejavu a klinicko rysov rakoviny žalúdka, a sme hodnotili prognostickú hodnotu AZGP1 výraz pre post-resekčné prežitie pacientov s karcinómom žalúdka.

Výsledky

AZGP1 mRNA expresia analyzovaná pomocou QRT-PCR

transkripčný hladiny AZGP1 boli stanovené pomocou QRT-PCR s použitím 35 párov resekcii vzoriek (vzorky nádorového tkaniva a priľahlých spárovaných vzoriek nenádorových tkanív) od pacientov s rakovinou žalúdka. Hladiny mRNA AZGP1 bola významne znížená vo vzorkách 28 (80%), nádorovom tkanive v porovnaní s spárovaných susednými vzorkami non-nádorové tkanivo ( P
= 0,023, obrázok 1).

AZGP1 Expression Analyzované westernovým prenosom

hladiny AZGP1 bielkovina v vyňatých vzoriek s karcinómom žalúdka boli stanovené westernovým prenosom. Výsledky ukázali pásmo pre AZGP1 41 kDa, a množstvo proteínu prítomného AZGP1 bola meraná pomocou denzitometria a výšky. V súlade s výsledkami QRT-PCR, bol pozorovaný pokles v AZGP1 expresie v 25 (71,4%) z žalúdočných nádorových tkanivách v porovnaní s spárovaných okolitom normálnom tkanív ( P
= 0,019, obrázok 2A). Osem párov reprezentatívnych žalúdočných nádorového tkaniva a spárovaných okolitom normálnom tkanive bolo uvedené na obrázku 2B.

Imunohistochemické analýza AZGP1 expresie v karcinómu žalúdka vzorky tkaniva a jej vzťah s klinicko-Vlastnosti

za účelom potvrdenia molekulárnej biologickej poznatky a skúmať klinicko-prognostické role AZGP1 expresie sme vykonali imunohistochemické analýzou v 248 parafínových žalúdočnej úsekov s rakovinou. Pozitívne expresia AZGP1 bol lokalizovaný do cytoplazmy (obr S1). Medzi 248 vzoriek karcinómu žalúdka, 117 (47,2%) vykazoval vysokú AZGP1 výraz (AZGP1 ++ alebo AZGP1 +++), zatiaľ čo zvyšných 131 prípadoch (52,8%), zobrazí nízku AZGP1 expresiu (AZGP1- alebo AZGP1 +) (obrázok 3, tabuľka 1). Normálny žalúdočné tkaniva ukázala najsilnejšia AZGP1 pozitívne farbenie (obrázok 3A).

na základe kategórií, ktoré sme definovali vo vyššie uvedených spôsobov základe dáta ukázali, že nízka expresia AZGP1 významne koreluje s umiestnením nádoru ( P
= 0,011), histologický grade ( P
= 0,005) a T etapa ( P
= 0,008), ale nie s vekom, pohlavím, veľkosť nádoru, radikálna resekcia , stav uzlín (N stupeň) alebo stav metastázy (M fáza). Mikrofotografie sú znázornené na obrázku 3.

Korelácia medzi AZGP1 prejavu na imunohistochemické pacientov a prežitie
základe

Stredná doba prežitia pacientov s rakovinou žalúdka 248 bol 45 mesiacov (rozmedzie 2-89 mesiacov) , Celková miera prežitia a 5-ročné prežitie sa významne zlepšilo vo vysokej AZGP1 expresným skupiny, ako je nízka expresia skupine [64,2% vs. 49,5% (celková miera prežitia) a 65,1% vs. 50,4% (prežitie 5 rokov), respektíve P
= 0,009, obr 4].

Jednorozmerné a viacrozmerné analýzy

Jednorozmerná a mnohorozmerné analýzy boli vykonané pre porovnanie vplyvu AZGP1 prejavu a ďalších parametrov na klinicko prognóza. na jednorozmerné analýze, ktorá zahŕňala všetky 248 pacientov na báze bolo zistené, že 8 faktory, ktoré majú štatisticky významné asociácie s celkovým prežitím. Táto analýza vzala tieto faktory do úvahy: Miesto tumor, veľkosť nádoru, histologického stupňa, úrovne AZGP1 výraz, TNM štádia (7. vydanie TNM klasifikácia) a či radikálna resekcia bola vykonaná alebo nie (tabuľka 2). Všetkých 8 faktory boli zahrnuté do multivariačný Coxovho modelu proporčne rizík s cieľom prispôsobiť účinkov premenných. Na základe tohto modelu, nádor umiestnenie, AZGP1 úrovne expresie, T javiskové a N štádia nádoru na báze boli potvrdené ako nezávislé prognostické faktory (tabuľka 2).

Diskusia

Karcinóm žalúdka zostáva jedným z najviac smrteľný ľudských malignít. Aj s pokroky v diagnostike a terapii, je prognóza pre rakovinu žalúdka je stále žalostný [1], [21]. Klinický výsledok rakoviny žalúdka závisí na rade nádorových charakteristík, ako je nádorový rast, diferenciáciu, invázia a vzdialených metastáz, ktoré sú upravené rôznymi príbuzných génov. Preto sa všeobecne za to, že genetické zmeny vedúce k aktivácii onkogénov a deaktiváciu nádorových supresor sú na základné príčiny rakoviny patogenézy. Sekvenčné zisk onkogénov a strata nádorových supresor poskytnúť potrebnú základ pre postupným progresie pevných nádorov od začiatku do transformácie a progresie nádoru [22], [23], [24]. Predtým AZGP1 Bolo popísané, že majú vlastnosti, tumor supresívnu v rakoviny prsníka, rakoviny prostaty, rakoviny pankreasu a niektorých ďalších zhubných nádorov [17], [20], [25]; však nebol doteraz vyhodnotený role AZGP1 primárneho karcinómu žalúdka. Naša štúdia ukázala, že expresia AZGP1 bola významne znížená tak na úrovni mRNA a proteínu vo vzorkách nádorovom tkanive, v porovnaní s expresiou v susedných párových vzoriek nenádorových tkanív. V súlade s našou štúdiu, Bryška MM et al. taktiež preukázané, že úrovne AZGP1 sú v normálnych tkanivách ústnej vyššia ako v ústnej nádorov [26]. Gagnon S et al. Tiež sa ukázalo, že AZGP1 bol prítomný u benígnych hyperplastickými žliaz v 91,1% prípadov, ale len u 40,7% (zle diferencovaný zložka) na 48,5% (dobre diferencovaný zložka) prostaty adenokarcinómu a iba 8% metastáz [27]. Výsledky tejto štúdie podporujú hypotézu, že AZGP1 môžu slúžiť ako nádorový supresor v niektorých druhov rakoviny.

Pre ďalšie overenie tohto zníženia AZGP1 expresie v primárnej rakoviny žalúdka, sme vykonali imunohistochemické analýzou s králičím anti-hAZGP1 protilátky. Pozorovali sme zníženú expresiu AZGP1 imunobarvením v bližšom či úplnej rakoviny žalúdka v porovnaní so vzdialenými rakovinou žalúdka tkanív. Niektoré štúdie preukázali, že proximálny pacientov s rakovinou žalúdka majú horšie prežitie než vzdialenejších pacientov s rakovinou žalúdka [28]. Tieto údaje naznačujú, že nízka expresia AZGP1 u karcinómu žalúdka je spojená s viacerými malígny fenotypmi. Okrem toho sme zistili, že znížená expresia AZGP1 bola spojená s zle diferencovaných adenokarcinómov (G3 vs. G1 /G2), čo naznačuje, že AZGP1 môžu indukovať diferenciáciu karcinómu žalúdka. Tieto výsledky sú v súlade so zisteniami Diez et al. [17], [18], ktorý popísal súvislosť medzi vysokou AZGP1 prejavu a vysokou úrovňou diferenciácie u karcinómu prsníka. Podobné nálezy boli tiež hlásené pri karcinóme prostaty [19], rakoviny prsníka a rakoviny pankreasu [26]. Ďalej sme zistili, že nízka expresia AZGP1 bola spojená s pokročilým T fáze. Tieto výsledky znamenalo, že nízka expresia AZGP1 môže podporovať rast nádoru. V súlade s našou štúdiu, Irmak S et al. navrhol, že AZGP1 súvisí s rozvojom povrchového karcinómu močového mechúra a jej transformácia do invazívneho fenotypu [29]. Tieto zistenia naznačujú, spoločne dôležitú úlohu pre AZGP1 v diferenciáciu a rast rakoviny žalúdka.

Pomocou analýzy Kaplan-Meierove krivky, pacienti v našej štúdii s nízkou expresiou AZGP1 mala výrazne kratšia prežitia ako pacienti s vysokým hladiny expresie. Jednorozmerné analýzy ukázali, že znížená expresia AZGP1 v žalúdočných rakovinové tkanive bola významne spojená s celková miera prežitia a miera prežitia 5 rokov. Multivariačný analýza ukázala, že expresia AZGP1, spolu s niektorými tradičnými prognostické faktory, ako je umiestnenie nádoru, T stupeň a N fázy, boli nezávislé rizikové faktory pre prognózu pacientov s rakovinou žalúdka. Tieto výsledky naznačujú, že AZGP1 by mohlo slúžiť ako nový prediktor prognózy u pacientov s karcinómom žalúdka po chirurgickej resekcii.

molekulárne mechanizmy nádorových potlačovacie vlastnosti AZGP1 sú stále nejasné. AZGP1 patrí do čeľade makroglobulínu, starobylé a evolučne konzervatívneho odkazu imunitného systému. Zorin NA et al. navrhol, že kapacita macroglobulins väzobných hydroláz činí inhibíciu možné invázie tumoru enzýmom sprostredkovaná [30]. V rovnakej dobe, prebytok makroglobulínu /hydrolázy komplexov môže aktivovať apoptózu [31]. Že N et al. uvádzajú, že AZGP1 tiež down-reguluje cyklin-dependentnej kinázy, ktorý je zodpovedný za reguláciu G2-M prechod, krok limitujúci rýchlosť bunkového cyklu. To naznačuje, že AZGP1 nepriamo zohráva úlohu pri bránení progresii nádorov [32]. AZGP1 bol navrhnutý ako nádorový supresor rakoviny pankreasu u Kong B. et al. Ich štúdie naznačujú, že gén AZGP1 indukuje mezenchymálnych-to-epiteliálne transdiferenciaci inhibíciu TGF-b-sprostredkovanú signalizáciu EKR [20]. Funkčný význam a vykonávacie mechanizmy AZGP1 u karcinómu žalúdka je potrebné ďalej skúmať.

Na záver sme skúmali prvej úrovne expresie a prognostickú hodnotu AZGP1 v primárnych karcinómov žalúdka v tejto štúdii. Naše Výsledky štúdie naznačujú, že AZGP1 by mohlo slúžiť ako kandidát nádorový supresor a prognostického biomarkeru v primárnych karcinómov žalúdka a byť potenciálnym cieľom pre terapeutický zásah; Avšak molekulárne mechanizmy sa podieľajú na regulácii AZGP1 vo rakovinou žalúdka odôvodňuje ďalšie vyšetrovanie.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Tento výskum bol schválený etickou komisiou z Sun Yat-sen University Cancer Center a písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta zapojených do štúdie.

tkanivového vzorky s

spolu 35 spárovaný rakovinový a uzavreté priľahlé noncancerous žalúdočnej sliznice tkaniva boli získané od pacientov s karcinómom žalúdka podstupujúcich gastrektómii v Sun Yat-sen University Cancer Center od roku 2010 do roku 2011. Po chirurgickej resekcii, čerstvé tkanivá boli okamžite ponorí do RNAlater (Ambion, Inc., USA), aby sa zabránilo degradácia RNA, skladované pri teplote 4 ° C cez noc, aby umožnil dôkladné prenikanie RNAlater do tkaniva a potom sa zmrazí pri -80 ° C až do vykonania extrakcie RNA a proteínov. Ďalších 248 samostatných vzoriek karcinómu žalúdka parafínu zaliate, ktoré boli zhromaždené v rokoch 2005 a 2007 boli získané z Sun Yat-sen University Cancer Center. Žiadny z týchto pacientov dostalo rádioterapii alebo chemoterapii pred operáciou. Histopatologické typ a fázy rakoviny žalúdka boli stanovené v súlade s kritériami klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie a vo fáze TNM stanovenej Európskou úniou pre medzinárodný boj proti rakovine.

Extrakcia celkovej RNA a Real-time kvantitatívne RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) podľa protokolu výrobcu. Celková koncentrácia RNA bola stanovená meraním absorbancie pri 260 nm za použitia spektrofotometra NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Reverzný transkripcie (RT) pre syntézu prvého vláknom cDNA bola vykonaná za použitia 2 ug celkovej RNA ošetrené M-MLV reverznej transkriptázy (Promega, USA) podľa odporúčania výrobcu. Výsledná cDNA sa potom podrobí v reálnom čase, kvantitatívnej RT-PCR pre vyhodnotenie relatívnej úrovne mRNA AZGP1 a GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy, ako vnútorná kontrola) s nasledujúcimi primermi: AZGP1 vpred: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ', a reverzné: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; GAPDH vpred: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', a reverzný: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. zosilnenie gén špecifický bola vykonaná pomocou real-time systém ABI 7900HT PCR (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) s 15 ul PCR zmesi obsahujúce 0,5 ul cDNA, 7,5 ul 2 × SYBR Green master mixu (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA), a 200 nM vhodných oligonukleotidových primérov. Zmes sa na teplotu 95 ° C (10 min) a potom amplifikovanej pri teplote 95 ° C (30 sekúnd) a 60 ° C (1 min) počas 45 cyklov. Rozlíšenie krivka bola meraná pri teplote 95 ° C počas 15 sekúnd, 60 ° C počas 15 sekúnd a 95 ° C počas 15 sekúnd. Hodnota Ct (cyklus prahová hodnota) z každej vzorky bola vypočítaná z prahových cyklov so softvérom prístroja (SDS 2.3), a relatívna expresia mRNA AZGP1 je normalizované na hodnotu GAPDH. Dáta bola analyzovaná metódou (2 ^{-ΔCt), ako ukazuje nasledujúci vzorec porovnávací prah cyklu: Relatívna úroveň expresie = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), v ktorom Ct (GAPDH) znamená hodnotu CT GAPDH a CT (AZGP1) znamená hodnotu CT AZGP1.}

Western Blotting Analýza

homogenizované vzorky žalúdočné rakovina, vrátane nádor a nontumor tkaniva, boli lyžovanie v RIPA pufri pre lýzu a lyzáty boli zozbierané centrifugáciou (12000 otáčok za minútu) pri teplote 4 ° C počas 30 minút. Približne 20 ug proteínových vzoriek boli oddelené elektroforézou na 12% dodecylsulfát sodný polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membrány. Po blokovaní nešpecifických väzobných miest po dobu 60 minút s 5% netučného mlieka, boli membrány inkubované cez noc pri 4 ° C s králičie monoklonálnou protilátkou proti AZGP1 (PTG Company, USA, pri 1: 200 riedenie). Membrány potom boli trikrát premyté TBST (tris-pufrovanom soľnom roztoku s Tween-20) počas 10 minút a testované s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovaným kozím anti-králičie IgG protilátkou (Immunology Consultants Laboratory, USA, na 1: 2000 riedenie) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po troch premytí membrány boli vyvinuté zvýšenou systému chemiluminiscencie (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Intenzita Kapela bola meraná pomocou denzitometrie pomocou softvéru Množstvo One (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Hladiny proteínov boli normalizované k tomu GAPDH detekované za použitia myší anti-ľudská monoklonálna protilátka GAPDH (Shanghai Kangchen, Čína, v 1: 10000 riedenie).

Imunohistochémia Analýza

Tkanivové rezy boli zbavené voskov s dimethylbenzenu a rehydratuje cez 100%, 95%, 90%, 80% a 70% etanolu. Po troch premytí v PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok), bola sklíčka varí v antigénu vyhľadávacom pufri obsahujúcom 0,01 M citrátu sodného, ​​kyseliny chlorovodíkovej (pH = 6,0) po dobu 15 minút v mikrovlnnej rúre. Po opláchnutí PBS boli tkanivové rezy boli inkubované s primárnou protilátkou a bola sklíčka potom opláchne 3% roztokom peroxidázy zhášacej (Invitrogen) k zablokovaniu endogénnej peroxidázy. Rezy boli potom inkubované s králičie monoklonálnou protilátkou proti AZGP1 (PTG Company, USA, pri 1: 200 riedenie) pri teplote 4 ° C cez noc a potom sa inkubujú s chrenovou peroxidázou (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) pri teplote miestnosti po dobu 30 min. Po premytí v PBS, vizualizácie signál bol vyvinutý s 3, 3'-Diaminobenzidine roztoku (DAB), a všetky snímky boli kontrastne hematoxylínom. Ako negatívne kontroly priľahlé rezy boli spracované ako je popísané vyššie, okrem toho, že boli inkubované cez noc pri 4 ° C v blokujúcom roztoku bez primárnej protilátky.

Vzorky boli analyzované tromi pozorovateľmi (Chunyu Huang, Lin LV, a Jingjing Zhao), ktorí boli zaslepení do klinické výsledky pacientov. Rozdiely medzi pozorovateľmi boli nájdené u menej ako 10% vyšetrených šmykľavkami a sa dosiahol konsenzus po ďalšom preskúmaní. Celková AZGP1 imunologické skóre bolo vypočítané ako súčet percent pozitivity (percento pozitívne zafarbených nádorových buniek) a intenzita farbenia. Percentuálny pozitivita bola hodnotená ako "0" (menej ako 5%, negatívny), "1" (5-25%, sporadický), "2" (25-50%, fokálna) alebo "3" (> 50 %, rozptýliť). Intenzita sfarbenia bola hodnotená ako "0" (bez farbenia), "1" (slabo zafarbené), "2" (stredne zafarbené), alebo "3" (silne zafarbené). Celková AZGP1 imunologické farbenie skóre v rozmedzí od 0 do 9. sme definovali úrovne AZGP1 expresie takto: "-" o skóre 0-1, "+" na skóre 2-3, ktorý bol definovaný ako nízku expresiou; "++" Na skóre 4-6, a "+++" pre skóre >. 6, ktoré boli definované ako vysokú expresiu

Follow-Up

Pooperačné následná záber bol vykonaný v našej ambulancii a zahŕňali klinické a laboratórne vyšetrenie každé 3 mesiace po prvých 2 rokov, každých 6 mesiacov počas tretej až piatej rokov a každoročne po dobu ďalších 5 rokov alebo do smrti pacienta, podľa toho, čo sa prvýkrát objavila. Celkové prežitie, ktorá bola definovaná ako čas od operácie na smrť pacienta, alebo poslednej kontroly, bol použitý ako meradlo prognózou. Tam bolo asi 4% pacientov stratili nadväznosť.

Štatistická analýza

spárovaného vzorkách t-test bol použitý na porovnanie úrovne AZGP1 mRNA vo vzorkách nádorového tkaniva a priľahlé nepôvodných súčasťou vzorky nádorového tkaniva. χ
^{2 test na proporcie a Pearsonovho korelačné koeficienty boli použité na analýzu vzťahu medzi AZGP1 prejavu a rôznych klinicko-charakteristikami. Celkové Krivky prežitia boli vypočítané pomocou metódy Kaplan-Meier a boli analyzované pomocou log-rank testu. Cox analýza proporcionálny nebezpečenstvo bol použitý pre jednorozmerné a viacrozmerné analýzy preskúmať vplyv klinicko-premenných a AZGP1 výraz na prežitie. Obojstranná P
-hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významné. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softwaru SPSS (verzia 17,0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).}

Podporné informácie
Obrázok S1.
imunohistochemické zisťovanie expresie AZGP1 proteínu v žalúdočnej rakoviny tkaniva. Pozitívne expresia AZGP1 bol lokalizovaný do cytoplazmy
doi :. 10,1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• Ploche ONE: Zníženie Mir-202-3p Expression, román nádorového supresor, žalúdočné Cancer
• Ploche ONE: Nová subklasifikace PT4 karcinómov žalúdka podľa šírky o Serózna Invasion