Razlike v želodcu gena raka izraz podpisov, ki izhajajo iz lasersko zajem mikrodisekcijo versushistologic macrodissection

Razlike v želodcu gena raka izraz podpisov, ki izhajajo iz lasersko zajem mikrodisekcijo v primerjavi
histološke macrodissection
Abstract
Ozadje
želodca vzorcih raka, pridobljenih s histološko macrodissection vsebuje relativno visoko vsebnost strome, ki lahko bistveno vpliva na izražanje genov profilov. Razlike med genske ekspresije podpisa izpeljane iz macrodissected želodca vzorcev za rakom in podpis pridobljen iz izoliranih epitelnih celic raka želodca iz istih biopsije, ki uporabljajo laser-zajem mikrodisekcijo (LCM) so bili ocenjeni za svoje morebitne poskusne pristranskosti.
Metode
RNA smo izolirali iz vzorcev zamrznjenega tkiva želodčne biopsije rakom od 20 bolnikov, ki uporabljajo tako histološke macrodissection in LCM tehnike. RNA iz LCM je predmet dodatne krogu T7 RNA ojačanja. Expression profiliranje je bila izvedena s pomočjo Affymetrix HG-U133A nize. Geni, opredeljeni v izraz podpisov iz vsake metodo predelave tkiva so bili v primerjavi z nabor genov, vsebovanih v kromosomskih regijah ugotovljeno pristanišče kopiranja število aberacij v vzorcih tumorjev z matrično CGH in beljakovine predhodno ugotovljeno, da se prekomerno raka želodca.
ugotovljeno je bilo tudi rezultati
Geni dokazano, da imajo večje število kopij na raka želodca, ki se prekomerno v vzorcih, dobljenih s macrodissection (LS P
vrednost < 10 -5), ne pa tudi v podatkih polj pridobivajo s pomočjo mikrodisekcijo . Sklop 58 predhodno identificiranih genov prekomerno raka želodca je obogaten tudi s podpisom genov označene z macrodissection (LS P
< 10 -5), vendar ne v podpisu označene z mikrodisekcijo (LS P
= 0,013). Nasprotno pa 66 geni prej poročali, da se underexpressed v raka želodca bila obogatena s podpisom genov označene z mikrodisekcijo (LS P
< 10 -5), ne pa v podpisu označene z macrodissection (LS P
= 0,89).
Sklepi
tehnika vzorčenja tumor nagne rezultate mikromrež. LCM lahko bolj občutljivi za zbiranje in predelavo metoda za identifikacijo morebitnih zaviralnih genov kandidatov na raka želodca, ki uporabljajo izraz profiliranje.
Ozadje
Glavni cilj analize mikromrež je identifikacija različno izraženih genov v podskupinah klinični vzorci se ujemajo posebne terapije v tumorskih podtipov. Vendar kvantitativna analiza izražanje niz kliničnih vzorcih raka z visoko vsebnostjo stromalnih je zahtevna, saj razmerje epitelnih tumorskih celic strome celice lahko zelo različna. Kužne STROMA lahko zmešajmo izraz, ki temelji na mikromrež in kopijo analize številka. zajem Laser mikrodisekcijo (LCM) je dragocena tehnika, ki omogoča, da samo za izolacijo epitelijskih celic iz stromalnih celic, s čimer obogatijo epitela vsebine. Količina vzorca in RNA, dobljene z LCM je pogosto zelo omejena, vendar pa zahteva korak ojačitve za ustvarjanje dovolj materiala za analize mikromrež. Ta proces ojačanje lahko pristranskosti rezultate in vodi v poševno nabor različno izraženih genov [1]. Histološko macrodissection (vzorci, zbrani od oddelkov tkiva z mikroskopsko analizo obarvanih serijsko oddelku vodenih) zagotavlja večjo količino vzorčnega materiala v primerjavi z LCM, ki lahko izognili potrebo po dodatnem krogu RNA ojačanja. Vendar macrodissected vzorci vsebujejo bistveno več vsebin stromalni celic kot vzorce, dobljeni z mikrodisekcijo.
Prejšnje študije so glede teh dveh metod za obdelavo tkiva za kliničnih vzorcih z rakom. Na podlagi podatkov iz 14 danke vzorcev adenokarcinom, Bruin et al
. možnostmi macrodissection nad mikrodisekcijo zaradi relativno nizkega prispevka stromalnih komponent v macrodissected vzorcev iz te vrste tumorja in pristranski genske ekspresije rezultati microdissected vzorcev zaradi ojačitve RNA potrebnega za te vzorce [2]. Po drugi strani pa Klee sod
. Predlaga se, da mikrodisekcijo profiliranje enolično identifikacijo veliko število različno izraženih genov ni drugače ugotovljeno uporablja vzorčenje razsutega tkiva, ki temelji na podatkih iz 10 pljučih adenokarcinomov in 6 sosednjih normalnih vzorcev [3]. Te študije so bile omejene z majhnimi vzorci, in zato zahteva dodatno potrditev. Prav tako ni jasno, ali so geni identificirajo s pomočjo microdissected vzorcev predstavljajo koristne biomarkerjev. Bias, ki izhajajo iz RNA ojačanje je treba pretehtati glede na korist bogati vzorci za epitela vsebine in oceni, ali mikrodisekcijo ugodno za izraz profiliranje tumorjev z visoko vsebnostjo stromalni, kot so želodčne ali trebušne slinavke adenokarcinome.
Mikrodisekcijo je še posebej koristna za obogatitev želodca rak tumorske celice dobimo iz endoskopske biopsije vzorcev, predvsem raka difuzna tipa želodca, ki jo sestavljajo razpršeni tumorskih celic mešati z vnetnimi celicami in fibroze. Zdi se, da v veliki meri pripisati zmanjšanju poškodb črevesne tipa, medtem ko je mislil, da je pojav razpršenega tipa, ki so ostale na enaki ravni padec celotne pojavnosti želodčnega raka v ZDA v tem stoletju [4]. Uporaba vzorcev, ki jih je pridobil LCM, Wu et al
. poročali, da bi lahko maligni primerjavi benignih razjed epitelijskih celic odlikuje z natančnostjo 99% osnovan na 504 genov prediktor [5]. This napovednik included znane gene, izražene v želodčni epitela including triperesne deteljice factors 1, 2 in 3 [5]. Uporaba LCM, Jinawath et al
. identificirati 46 gene, ki lahko predstavljajo različne molekularne podpise za dve histoloških vrstah raka želodca - difuzna-tipa in želodcu raka intestinalnega tipa [6]. Vendar pa niso bile opravljene študije doslej neposredno primerjavo macrodissection vs
. LCM metode, ki uporabljajo enak nabor vzorcev raka želodca.
V tej študiji smo skušali ovrednotiti razlike med izraznih profilov, ki izhajajo iz istih tumorjev, ki so predelane tako macrodissection in LCM za analize mikromrež. Glede na težave pri potrjevanju vseh različno izraženih genov, določenih z vsako vrsto zbiranje vzorcev smo primerjali gene ugotovljenih preko našega mikromrež analiz z beljakovinami, je znano, da se prekomerno raka želodca. Poleg tega smo ugotovili, ali izražanje genov, opredeljenih v vsakem podpisa korelaciji s spremembami v številu kopij gena, ki so bile označene z nizi primerjalno genomsko hibridizacijo (CGH) iz istih tumorjih. Prejšnje študije raka želodca so pokazali visoko korelacijo med matrike CGH in podatkov izraz matrike [7]. Spremembe število Kopiranje so ovrednotili s macrodissected tumorja DNK, da bi se izognili pristranskosti od celotnega genoma ojačanja. Nadalje smo odločeni, ali so bili genski podpisi smo, pridobljeni iz vsake metode zbiranja in obdelavo vzorcev obogaten za beljakovine, ki so bili že prej poročali, da so dysregulated genov pri raku želodca. Naši rezultati kažejo, da je metoda LCM bolj občutljiva za identifikacijo genov, ki so underexpressed v raka v primerjavi z normalnim tkivom (potencialni tumor valov), medtem ko macrodissection določa več genov, ki so izraženi pri raku. Zato macrodissection in LCM mikrodisekcijo zdijo koristni za preučevanje različnih vidikov biologije raka.
Metode
pacientov
dvajset bolnikov, ki so bili analizirani v tej študiji je del 96 bolnikov, ki so sodelovali v prospektivni študiji in katerih vzorci so bili uporabljeni kot sprejemniku izraz za usposabljanje za razvoj kemoterapijo in odzivom napovedovalec v [8]. Del govora in podatkov nizov CGH od svojih macrodissected vzorcev je bilo že poročali [8, 9]. Zbiranje vzorcev, zdravljenje in spremljanje so bile izvedene v skladu s protokolom, ki jih revizijski odbor institucionalno (IRB) državnega bolnišnice Cancer Center v goyang, Koreja (NCCNHS01-003) odobril. Vsi bolniki so podpisali IRB-odobreno informirano obrazec soglasja. Upravičenost za vpis v študiji, so naslednje parametre: 1) starost ≥ 18 let; 2) histološko potrjen adenokarcinomom želodca; 3) klinično dokumentirane oddaljenih metastaz; 4) brez predhodne ali sočasno uporabo malignosti, razen rakom želodca; 5) predhodna zgodovina kemoterapijo, bodisi adjuvans ali paliativno; in 6) ustrezno delovanje vseh glavnih organov. Bolniki so prejemali cisplatin 60 mg /m 2 IV na dan 1 in fluorouracil 1000 mg /m 2 IV na dneve, 1-5 po shemi 3 tednov.
Obdelavo tkiva
Pred macrodissection, tumor vzorci so imeli mediano tumorske jedra 50% (območje interkvartilni, 30-60%). Macrodissection smo izvedli kot je opisano predhodno [10]. Macrodissection vodi do povprečno 60% tumorskih jeder na vrh drsnika (interkvartilni razpon, 60-72,5%). Za mikrodisekcijo, tumor in normalnih tkivnih vzorcev cryosections smo razrezali na 10 um, in shranili zmrznjeno pri -80 ° C. Diapozitivi so bili dehidrirani uporabo nukleaz brez HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagenti v skladu s priporočili proizvajalca. Mikrodisekcijo je bila izvedena s pomočjo PixCell II (Arcturus bioznanosti, Mountain View, CA). Dehidracija in LCM je bila omejena na 15 minut ali manj za vsak vzorec. Skupno 10.000 laserskih posnetkov (Velikost pike 15 mikrometrov premera) so bili zbrani s pomočjo CapSure Makro LCM kapic za vsak vzorec. RNA smo izolirali s pomočjo PicoPure izolacije RNA Kit (Molecular Devices). Na kratko, so epitelne celice inkubiramo s 50 p.L iz ekstrakcijskega pufra v 0,5 ml mikrocentrifugi cevi pri 42 ° C za 30 minut. DNaza (QIAGEN, Valencia, CA) obdelavo smo izvedli direktno v koloni prečiščevanje in RNA smo izolirali ob uporabi elucijski volumen 8 p.L (Molecular Devices). Pet xl RNA iz populacij microdissected celic smo pretvorili biotiniliranega, protismiselna Črna cilja, s pomočjo Affymetrix dva cikla način označevanja (Santa Clara, CA). Vse Biotinilirane cilji so razdrobljeni in 15μ
g vsakega smo hibridizirali na HG-U133A GeneChip mikromrež po protokolu proizvajalca. Skenirane zaporedji slike so bile pregledane in pretvori v znak podatkov prek Affymetrix MAS 5.0 algoritem.
Array CGH
genomske DNK je bila vzeta iz vzorcev s pomočjo TRI reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA), v skladu s protokolom proizvajalca, in dodatno očistimo z QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). Za polj CGH poskusih smo uporabili Agilent 4x44k HD-CGH Mikromreže vsebujejo 44.000 značilnosti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 0,5-1 ig tumorskih genomsko DNK vzorci in enako količino humane genomske DNK iz več anonimnih ženskih darovalcev (Promega, Madison, WI) smo razgradili z AluI (50 enot) in RSAI (50 enot) za 2 uri pri 37 ° C . 5 xl Random Primer zmešamo z prebavi DNA matrici. Referenčna in vzorec DNK, so označeni z uporabo Agilent označevanje Kit Plus, ki vključuje 5x pufer, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mm) in Exo-Klenowim fragment. Mešanica sonda Cy3 označena vzorec DNK, Cy5 označeno referenčno DNK (39 ul), 5 ul človeškega Zibelka-1 DNA (Invitrogen), 11 xl Agilent 10 × blokatorja in 50p.L Agilent 2 × hibridizacije pufru denaturiran v 95 ° C za 3 min in inkubiranih pri 37 ° C za 30 minut. Sonda je bila uporabljena za niz z uporabo Agilent mikromrež hibridizacija komoro in hibridiziramo 21 ur pri 65 ° C v vrteči se sušilniku pri 20 obratih na minuto. Polja so sprali v skladu s priporočili proizvajalca, namočeno v Agilent je stabilizacijo in rešitev sušenja in skenirali z uporabo mikromrež skener za Agilent 2565AA DNA. Program na Agilent Scan Program Control 7.0 in Agilent Feature Pridobivanje Software Program 9.5.1 so bile uporabljene za obdelavo podatkov. Array podatki CGH smo analizirali z uporabo programske opreme Agilent CGH Analytics (različica 3.5.14). ADM-2 algoritem s pragom 6, mehke nič in centralizacijo na, je bila uporabljena za identifikacijo aberacije. Merila za filtriranje aberacije so minimalne sonde za 5, najnižja povprečna absolutna log 2 razmerje 0,5, in mejne aberacije za 1.000.000. Aberacije, določene za vsak vzorec so bili navedeni in grafično prikazani.
Rak želodca genov v literaturi
želite ustvariti uporabniško določen gen set za analizo naših genov primerjava, smo iskali PubMed podatkovne zbirke genov z želodčno raka celic specifične beljakovine izraz, z uporabo ključnih besed za "raka želodca", "imunohistokemiji" in "prekomerno" ali "izguba izražanja". Za analizo naše gen set primerjava, so genski simboli raka želodca specifičnih genov preslika v sonda zastavljenih ID na HG-U133A array (http:.. //Www NetAffx com). Je bilo 178 ( "prekomerno") in 327 ( "izguba izražanja") člankov v PubMed v času pisanja.
Statistična analiza podatkov izraz polj
podatkov mikromrež Affymetrix HG-U133A izražanja genov smo analizirali z gen set algoritmi analize primerjava z BRB ArrayTools (različica 3.8, National Cancer Institute, http:.... //Linus NIS nih gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Orodje primerjava gen nastavljena analizira uporabniško določenih genov kompleti za diferencialno izražanje pri vnaprej določenih vrstah (to
., rak vs
. normalno) iz izvorne nabora podatkov. Uporabniško določene genskih sklopov, ki se uporabljajo v tej študiji vključuje U133A kompleti sonda, ki ustreza genov s spremembo števila kopij, ki ustrezajo želodčnega raka genov v literaturi. Gene, katerih tumor /normalna log razmerje 2, višja od 0,5 na vsaj eni od 20 vzorcev pacientov so bili vključeni v seznam genov s številko kopije dobička. Podobno geni z izgubo števila kopij (log 2 razmerje < -0.5) so bili navedeni. Te uporabniško določene genskih sklopov smo analizirali različno ekspresijo med 20 vzorcev z rakom in 6 normalnih vzorcev (npr.
, 3 macrodissected in 3 microdissected vzorcev).
Za vsak vir CCD, P
-vrednost je izračuna za vsak gen soodvisnosti med stopnjo izražanja za različno ekspresijo med vnaprej določenih kategorij, ki ustvarja postavljen gensko seznam določenega projekta BRB-ArrayTools. Za niza n
genov, je najmanjših kvadratov (LS) statistični opredeljen kot srednji negativnega naravnega logaritma P
-values ​​so v ustreznih single gena enolastnostnimi testov [12]. Povzetek statistika se izračuna, ki povzema te P
vrednosti nad določi uporabnik genom; povzetek statistika povprečne log (P
) za povzetek LS, kako se naprava P
vrednosti razlikujejo od enakomerne porazdelitve za LS [12]. Povzetek statistika se nanaša na distribucijo zbirnih statističnih podatkov za naključnih vzorcev n
genov, vzorčenih od tistih, ki so zastopane v matriki. Tukaj N
je število genov v uporabniško definirani genom. 100.000 naključnih genov kompleti so vzorčili za izračun te razdelitve.
vrednost LS P je delež naključnih nizov n
genov z manjšimi povprečnimi zbirno statistiko kot povzetkov LS izračunanih za resnične podatke.
BRB-ArrayTools ocenjenih LS P
vrednosti za obogatitev za 4 genske sprejemnikov v naši želodca raka transkriptomov podpis označene z vsako metodo predelave tkivo, kot sledi. Prvič, za primerjavo 2.324 gene, povezane s številko kopije dobiček z našo želodca podpisom raka transkriptomov ki jih je opredelila mikrodisekcijo, LS statistika za 2.324 pomnoženih genov je bila ocenjena z izračunom povprečno negativen naravni logaritem vrednosti P
od enega gena univariatne testi za diferencialno izražanje vsakega od 2.324 genov med 20 microdissected želodca vzorcev raka in 6 normalnih vzorcev. Potem BRB-ArrayTools izračunali delež naključnih nizov 2.324 genov z manjšimi povprečnimi zbirno statistiko kot povzetkov LS izračunanih za dejanske podatke (LS P
vrednosti). Želodca rak Transkriptom podpis označene z mikrodisekcijo smo primerjali s 677 genov, povezane z izgubo števila kopij, 58 proteini so poročali, da se prekomerno raka želodca in 66 proteini so poročali, da se underexpressed raka želodca, pri čemer vsakokratni LS P
vrednosti. LS P
vrednost manj kot 0,01 je zdelo pomembno. Iste analize smo ponovili za želodčne podpis raka transkriptomov identificirati po metodi macrodissection.
Imunohistokemija
TFF1 imunohistokemija je bila izvedena z uporabo kirurških ali endoskopsko vzorcev biopsijo tkiva od 16 bolnikov želodca z rakom (16 rakom in 2 sosednjih normalnih vzorcev tkiva), in 4 zdravih prostovoljcih, ki niso bili vključeni v to študijo mikromrež DNA. Skrajno-normalni vzorci želodčne sluznice tkiva so bili zbrani iz želodca antruma zdravih prostovoljcev z uporabo slepo biopsijo tehniko, s privolitvijo [9]. -Parafin vgrajeni drsi tkiva-formalinom fiksno (4 um debeline) smo obarvali z 13734-1-AP (ProteinTech skupine, Chicago, IL) pri 1:50 za 60 minut pri sobni temperaturi in Envision anti-kunčjega hrenovo peroksidazo (K4003, DAKO , Carpinteria, CA), 30 minut pri sobni temperaturi. Reakcijo smo vizualizirali z uporabo diaminobenzidine (K3468, DAKO) in jih nasprotno s hematoksilinom. TFF1 izraz je bila ocenjena semi-kvantitativno na 200x
povečavi, ki temelji na odstotku pozitivno obarvanih celic ( "-" = imunskim barvanjem v ≤ 10% celic, "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Imunskim barvanjem brez primarnega protitelesa in normalno želodca epitela mikromrež kontrolnega tkiva služil kot negativne in pozitivne kontrole, oziroma [15]. Citoplazme madež, ki je bil nedvomno globlja, kot je bilo v ozadju šteje kot pozitivno.
Rezultati
Ugotavljanje globalnih izražanja genov podpisi macrodissected in LCM vzorcev
Tabela 1 zarisuje na klinično-patološke značilnosti bolnikov in prostovoljcev, vključenih v ta študija mikromrež. podatkov mikromrež smo pridobili tako LCM in macrodissected vzorcev z istih 20 biopsije (slika 1A). Čeprav sprejemljive kakovosti, je bilo mikromrež podatki iz LCM vzorcev na splošno nižje "sedanji poziv", kot macrodissected vzorcev (podatki niso prikazani
). Analiza glavna sestavina svetovne genske ekspresije vzorci, ki izhajajo iz mikro- in želodčnih rakov-makro secirali in normalnih vzorcev pokazala jasna ločitev vsake skupine vzorca (slika 1B). Mediana Pearson korelacija med obema metod predelave je bila 0,75 (interkvartilni razpon, 0,71-0,81) .table 1 klinično-patološke značilnosti bolnikov in prostovoljcev, vključenih v analizo mikromrež

Bolniki (n = 20)
prostovoljci (n = 6)
Baseline klinično-patološke značilnosti
Age-letni
Mediana
59
52
interkvartilni razpon
54-69
43-61
Sex - no. (%)
Male
16 (80%)
3 (50%)
Ženski
4 (20%)
3 (50%) Stanje
Uspešnost (PS ) - št. (%)
ECOG1 PS 0 ali 1
20 (100%)
histološki tip - št. (%)
Lauren črevesnih
6 (30%)
Lauren razpršenih
14 (70%)
Kraj primarne poškodbe - no. (%)
Zgornja 1/3
4 (20%)
Srednji 1/3
6 (30%)
Spodnja 1/3
10 (50%)
Distant metastaze - no. (%)
20 (100%)
zdravljenje in izid
kemoterapije - no. (%)
Cisplatin /Fluorouracil
20 (100%)
Skupna preživetje -. Mesec
Mediana
8,0
interkvartilni razpon
5.6-14.7
čas do napredovanja -. mesec
Mediana
3.5
interkvartilni razpon
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Slika 1 (A) program Študija za zbiranje vzorcev in predelave mikromrež (B) glavna komponenta analiza izražanja genov profilov mikro in vzorcev tumorjev-makro izreže iz 20 želodca bolnikov z rakom in 6 normalnih vzorcev iz zdravih prostovoljcih.
tabeli 2 in 3 kažejo geni prekomerno v mikro in makro razkosanih želodca vzorcih raka na izbiro funkcij P
< 10 -6. Cell morfologija
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) je bil najbolj obogatena funkcionalna kategorija od 42 genov prekomerno v microdissected vzorcih v primerjavi z običajnimi vzorci (izbor funkcija P
< 10 -6), ki so opredeljeni Ingenuity Peš-pot analize (IPA) (tabela 2). Tumor morfologija
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) je bil najbolj obogatena funkcionalna kategorija med 73 genov prekomerno v macrodissected vzorcih (izbor funkcija P
< 10 -6) IPA (tabela 3). Ekstracelularni matrix geni, kot COL6A2, COL1A1, COL1A2
in COL5A2
, so bili vidno v macrodissected vzorcih in verjetno prispevale stromalnih celicah. Tabela 4 prikazuje gene underexpressed v mikro in makro razkosanih vzorcih raka želodca pri izbirnem funkcija P
< 10 -6.Table 2 Geni prekomerno v microdissected raka želodca pri izbirnem funkcija P
< 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold sprememba, z razmerjem izraz raka opredeljeno v normalno (= rak /normalno)
2 Vsi ti geni imel lažno stopnja odkritje < 0,001
Tabela 3 Geni prekomerno v macrodissected raka želodca na funkcijo izbirnega P
. < 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold sprememba, z razmerjem izraz raka opredeljeno v normalno (= rak /normalno)
2 Vsi ti geni so lažno stopnja odkritje. ≪ 0,001
Tabela 4 Geni underexpressed v mikro in makro-razkosanih raka želodca na funkcijo izbira P
< 06/10
Microdissected

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold spremeniti, opredeljena z negativnim razmerja izražanja normalne raka (= - (normalna /raka))
2 Vsi ti geni imel lažno stopnja odkritje < 0,001
Primerjava izražanja in matrike CGH podatkov.
Array CGH analiza je bila opravljena s pomočjo genomske DNA, povzete iz macrodissected vzorcev, ki vsebujejo > 50% tumorskih celic (merila s prejšnjimi raziskavami [16, 17]), saj bi se lahko zadostno DNA dobimo brez potrebe celotnega genoma ojačanje kot je potrebno za microdissected vzorcev. Celoten genom pomnoževanje DNA lahko potencialno uvesti artifactual pristranskost v nizov rezultatov CGH [18]. Je prikazano na sliki 2, je frekvenca DNK kopij število odstopanj med vsemi 20 vzorcev. Naše število kopij podatkov aberacija je na splošno v skladu s predhodno sporočenih podatkov [7, 16, 17, 19-23]. Štirje od 20 bolnikov je imelo ojačanje CHR8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596), ki vsebuje myc
onkogena. Drugi najpogostejši ojačanje locus je CHR17 q21.2 (36109939-36230163), ki je bila dopolnjena pri 3 bolnikih. Sedem bolnikov je imelo nobenih zaznavnih kromosomske aberacije. Te 7 vzorcev je vsebovala mediano 70% tumorskih celic, medtem ko drugi 13 so imeli bolniki mediano 60% tumorskih celic (P
vrednost = 0,1). Zato pomanjkanje prepoznavnih kromosomskih aberacij v 7 vzorcih ni bilo zaradi manjšega odstotka tumorskih celic v teh vzorcih. Slika 2 Grafična slika prikazuje odstotno frekvenco sond zaznal (aberacije) med vsemi 20 vzorcev.
Je bilo 2.324 edinstvenih gene, ki so bile povezane s številko kopije dobiček v vsaj enem izmed 20 bolnikov, in 677 geni, povezani s številom kopij izguba. Uporaba gen set primerjavo analiz smo primerjali te genske agregati z našimi transkriptome podpisov, ki jih različnih metod izolacije vzorec. Domnevali smo, da dysregulated gene, povezane s številčnimi kopija aberacije so bolj verjetno, da se vključijo kot prispevajo k onkogenezo in ne zgolj kot "drugih prisotnih." Zato je bilo 2.324 genov, vsebovane v regijah število kopij dobičkov analizirati glede na njihovo izražanje iz podatkov nizov, pridobljenih z metodo macrodissection (izbirna funkcija P
< 0,05). Prekrivanje seznama genov v regijah ojačevanje in obogatitev za njihovo izražanje v vzorcih, ki so bili macrodissected je bila statistično značilna (LS P
vrednost = 10 -5; glej Metode statističnega opisa). Vendar pa ta povezava ni bilo opaziti, ko se je izraz analizirati podatke iz microdissected vzorcev (izbirna funkcija P
< 0,05; LS P
vrednost = 0,41) (slika 3A). Tako je bila močnejša povezava med vzorcu števila kopij mase in genske ekspresije le v vzorcih, ki so bili macrodissected. Na primer, MYC
, najpogosteje pomnožili gen v naših vzorcih pacientov, je ugotovljeno, da so bistveno prekomerno v macrodissected vzorcih, vendar ne v tistih, ki so bili microdissected, čeprav se lahko ta rezultat posledica relativno majhnega vzorca ali heterogenosti znotraj tumor. Slika 3 Število genov, ki se prekrivajo med LCM in macrodissected izraz nizov podatkovnih baz in podatkov matrika CGH z istim naborom 20 bolnikov.
Seznam 677 genov je bila ugotovljena v regijah, kjer je bilo ugotovljeno, izguba število DNA kopijo v vsaj enem od 20 študijskih bolnikov. Izražanje teh genov je bil analiziran v makro in mikro secirali nizov nizov. Pomemben Povezave med geni z izgubo in številom kopij in njihovo izražanje v obeh makro in mikro secirali vzorcev. (LS vrednosti
P, 0,009 in 0,006 za LCM in macrodissected vzorcev oz) (slika 3B).
Skladnost genskih podpisov z geni prej poročali, da je povezana z rakom želodca
PubMed iskanje literature je bila izvedena opredeliti že poročali pre- in izrazil genov in proteinov za rakom želodca (ključne besede: imunohistokemijo, raka želodca ter prekomerno in izida izražanja). 58 proteini izraženi pri raku želodca so bile ugotovljene na ta način. Ugotovljeno je bilo izražanje genov za teh 58 proteine, ki se obogaten podatkih izraz iz vzorcev, ki jih macrodissection zbranih (LS P
< 10 -5), ne pa bogatenje v ekspresijo 58 genov, je bilo za vzorce, ki jih zbirajo mikrodisekcijo (LS P
= 0,013). V nasprotju s tem pa je 66 proteini so poročali, da se underexpressed raka želodca v podatkih polj izraz obogatili iz vzorcev z mikrodisekcijo zbranih (LS P
< 10 -5), ne pa tudi iz vzorcev, ki jih macrodissection zbranih (LS P
= 0,89) (tabela 5) .table 5 želodcu raka genov v literaturi, ki so različno izražena med 20 rakom in 6 normalnih vzorcev v izbirnem funkcija P
< 0.05 po podatkih mikromrež ustvarila uporabi vsake metode predelave tkivo
prekomerno genov pri raku
Underexpressed genov cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RHOA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RaRb
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously poročali prekomerno beljakovine za rakom želodca, ki so pretirano izražena tudi v našem microdissected (LCM) in macrodissected vzorcev raka v primerjavi z običajnimi vzorci
2Previoulsy poročali underexpressed beljakovine za rakom želodca, ki so bili underexpressed tudi v našem microdissected (LCM) vzorci rak, vendar ne v macrodissected vzorcih raka
validacijo mikromrež podatkov
za potrditev naše mikromrež podatkov, smo opravili imunohistokemični analiz gena prepoznani kot underexpressed v microdissected vzorcih raka od 16 bolnikov in 4 prostovoljcev, ki niso bili vključeni v raziskavo DNA mikromrež. TFF1
je bila izbrana za te študije potrjevanja imunohistokemični, saj je bistveno underexpressed v vzorcih LCM (P
= 0,0036), vendar ne v macrodissected vzorcih (P
= 0,09), v primerjavi z običajnim želodčne sluznice. TFF1 radioinkorporacijo pri raku je bila ocenjena kot -, + ++ in +++ pri 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%) in 2 (12,5%) oz. Nasprotno, vse od 6 normalnih želodca vzorcev sluznici (4 zdravih prostovoljcih in 2 normalnih vzorcev sosednjih tkiv), ohranjena TFF1 radioinkorporacijo (+++) (slika 4). Tako je imel v želodcu vzorci rakom bistveno manjše TFF1 radioinkorporacijo kot normalno želodčne sluznice, v skladu s prejšnjimi poročili [13, 14] (P
za hi-kvadrat = 0,007). Slika 4 predstavnik TFF1 Imunohistokemijsko rezultati za (A) želodca adenokarcinom kaže na izgubo TFF1 izražanja, in (b) običajno želodčne sluznice z zdravim prostovoljcem, ki izraža TFF1 v epitelijskih celic želodca. (Povečava = 200x)
Ti rezultati kažejo, da temelji na macrodissection izražanje genov analize prekosila izražanje genov analize iz vzorcev LCM za identifikacijo genov izraženi pri raku želodca.

• BariSurg preskušanje: rokav želodca v primerjavi Roux-en-Y želodčni obvod pri debelih bolnikih z ITM 35-60 kg /m2 - multi-center naključno potrpežljivi in ​​opazovalec slepi neinferiornost trial
• Izražanje profil MUCINS (MUC2, MUC5AC in MUC6) v Helicobacter pylori okuženih pre-neoplastične in neoplastične človeškega želodca epithelium